Valutazione morfologica e funzionale degli assoni e delle loro sinapsi durante la morte di Axon in Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questo protocollo di lesione della Drosophila è quello di osservare sia la conservazione della morfologia assonale e sinaptica, sia la funzione sinaptica degli assoni e delle loro sinapsi. Questi test possono anche essere usati per caratterizzare i fattori di manutenzione neuronale, studiare il trasporto assonale o analizzare gli organelli assonali in assoni intatti. Il test parziale della lesione alare consente l'osservazione di assoni feriti sottoposti a degenerazione fianco a fianco con assoni di controllo illesi all'interno dello stesso fascio nervoso nell'ala Drosophila.

Questo saggio di lesione può essere facilmente praticato in anticipo in mosche di tipo selvaggio applicando un taglio grosso modo nel mezzo dell'ala con micro-forbici. La lesione interna consente la valutazione della morfologia assonale e l'uso dell'optogenetica per visualizzare la conservazione funzionale dell'assone e delle loro sinapsi. L'ablazione antennale richiede mani ferme.

Si consiglia inoltre di praticare la rimozione delle antenne in mosche di tipo selvaggio in anticipo. Nella dipendenza, qualsiasi configurazione optogenetica disponibile è adatta per attivare i neuroni in volo con il cappello. Altrimenti, una configurazione semplice può essere facilmente costruita da zero.

Per iniziare, usa cinque femmine vergini e cinque maschi del genotipo destro per eseguire croci a temperatura ambiente. Trasferisci la generazione P0 in nuove fiale ogni tre o quattro giorni. Raccogli ogni giorno la generazione di progenie per adulti F1 appena chiusa in nuove fiale e invecchiale per sette o 14 giorni.

Dopo l'anestesia, utilizzare micro-forbici per tagliare la vena interna dell'ala all'incirca al centro dell'ala. Usa un'ala per l'infortunio e l'altra ala come un'età abbinata al controllo illeso. Applicare un infortunio per ala e assicurarsi di infortunato 15 ali.

Recupera le mosche nel cibo contenente fiale. Successivamente, con una pipetta, stendere 10 microlitri di olio di alocarbonio 27 lungo un intero scivolo di vetro. Uno o sette giorni dopo l'infortunio, usa le micro-forbici per tagliare i feriti e l'ala di controllo illesa.

Usa le pinzette per afferrare l'ala al centro, montare quattro ali massime nell'olio di alocarbonio 27 e coprirle con uno scivolo di copertura. Le immagini dei neuroni etichettati GFP nell'ala possono essere facilmente acquisite con un disco rotante. Tuttavia, il tempo di acquisizione deve essere eseguito entro meno di otto minuti dal montaggio delle ali perché il piatto non è fisso.

Immagini immediatamente l'ala usando un microscopio a disco rotante. Acquisire una serie di sezioni ottiche lungo l'asse Z con dimensioni del passo di 0,33 micrometri e comprimere le pile Z in un unico file per le analisi successive. Attraversa cinque femmine vergini e cinque maschi dal genotipo destro e raccogli la generazione di F1 come in precedenza.

Dopo l'anestesia, utilizzare le pinzette per oblattare il terzo segmento antenne destro per l'ablazione unilaterale o sia i segmenti antenne terzi sinistro che destro per l'ablazione bilaterale. Questo rimuove i corpi cellulari neuronali etichettati GFP mentre le loro proiezioni assonali rimangono nel SNC. A seconda dei neuroni etichettati GFP utilizzati nella tecnica, è importante sapere se i corpi cellulari sono alloggiati nel terzo o nel secondo segmento antennale per il successivo saggio di lesione.

Recupera le mosche nel cibo contenente fiale. Dopo l'anestesia, utilizzare una pinzetta per afferrare il collo e un'altra pinzetta per riparare il torace. Estrarre delicatamente il collo e la testa dal torace.

Utilizzando pinzette che sono state imperniate nella soluzione di fissaggio, trasferire tutte le teste in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di soluzione di fissaggio del 4% di paraformaldeide e 0,1 tritone X100 in PBS. Fissare le teste per 20 minuti con delicata agitazione a temperatura ambiente. Quindi mettere il tubo di microcentrifugo sul ghiaccio e le teste gravitano sul fondo del tubo di microcentrifugo.

Rimuovere il supernatante con una pipetta e aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio contenente lo 0,1% di tritone X100 in PBS. Posizionare il tubo su una ruota di tornitura a temperatura ambiente per lavare per due minuti. Ripetere il lavaggio quattro volte in più per rimuovere la soluzione di fissaggio residua.

Dopo aver preparato il cervello, ottenere una diapositiva di copertura, attaccare il nastro da laboratorio su di esso e tagliare una forma simile a una T dal nastro. Utilizzare una punta della pipetta da 20 a 200 microlitri in cui sono stati tagliati tre millimetri della punta per allargare l'apertura della pipetta. Pipettare il cervello contenente reagente antifade sullo scivolo e coprire il cervello con uno scivolo di copertura.

Usa l'argilla per preparare due piccoli rotoli pari. Assicurarsi che i rotoli di argilla non siano superiori all'altezza di uno scivolo di vetro. Attaccare i rotoli di argilla sullo scivolo di vetro e posizionare il cervello contenente il sandwich di scorrimento di copertura sui rotoli di argilla.

Procedere secondo il manoscritto. Per preparare le mosche per l'optogenetica, prima sciogliere il fly food in un forno a microonde. Dopo che il cibo si è raffreddato, prima della solidificazione, aggiungere 20 millimolare tutto trans-retinale in etanolo a una concentrazione finale di 200 micromolari.

Mescolare bene e versare immediatamente il cibo in fiale vuote. Coprire le fiale contenenti il cibo solidificato con spine o batuffoli di cotone. Avvolgere le fiale con un foglio di alluminio.

Quindi, conservare il cibo contenente fiale in una stanza fredda scura. Usa cinque femmine vergini e cinque maschi del genotipo destro per eseguire croci a temperatura ambiente e raccogliere la generazione di F1 come in precedenza in fiale coperte di alluminio contenenti 200 micromolari tutti trans-retinali nel cibo a mosca. Successivamente, raccogli le mosche toccandole dal cibo contenente fiale in una fiala vuota senza cibo.

Raffreddare la fiala in ghiaccio contenente acqua per circa 30 secondi. Le mosche si addormentano. Ora, mettere rapidamente le singole mosche in piccole camere copriva una diapositiva di copertura per eseguire l'optogenetica.

In una stanza buia, eseguire il protocollo composto da 30 secondi in cui la luce rossa è assente, seguita da 10 secondi di esposizione alla luce rossa a 10 Hertz. Ripetere questa procedura tre volte in totale seguita da un intervallo aggiuntivo di 30 secondi in cui la luce rossa è assente. Raccogli singole mosche da ogni camera su cuscinetti di anidride carbonica.

Per sottometterli a lesioni antennali, aborrire sia i segmenti antenne del secondo sinistro che destro. Questo rimuove i corpi cellulari dei neuroni d'organo di Johnston mentre le proiezioni assonali rimangono nel SNC. Recuperare le mosche in fiale rivestite in alluminio contenenti 200 millimolare tutte trans-retiniche.

Nei punti di tempo corrispondenti, ad esempio sette giorni dopo l'ablazione antennale, sottosegna le mosche a un altro saggio di toelettatura. In questo protocollo sono stati presentati tre metodi per studiare la morfologia e la funzione degli assoni mozzati e delle loro sinapsi. Il primo metodo consente l'osservazione ad alta risoluzione dei singoli assoni nel sistema nervoso periferico.

Le croci schematiche per generare cloni di tipo jolly e highwire nell'ala sono mostrate qui. Il controllo negli assoni etichettati GFP feriti è anche presentato con frecce che indicano assoni mozzati. Viene presentato il secondo approccio per studiare la morte di axon degli assoni di neuroni sensoriali etichettati GFP nel cervello.

Le croci schematiche per generare cloni di tipo selvaggio e highwire nel cervello sono mostrate qui. Esempi di controllo negli assoni etichettati GFP feriti sono presentati con frecce che indicano fasci di assoni recisi. Il terzo metodo dimostra l'approccio per visualizzare la funzione assonale e sinaptica dopo l'assotomia.

Le croci schematiche per generare neuroni sensoriali d'organo di tipo selvaggio e dnmnat che esprimono troppo i neuroni sensoriali dell'organo di Johnston sono mostrate qui. Le mosche di tipo selvaggio sono mosche contenenti neuroni d'organo di Johnston con morte attenuata dell'assone. Entrambi nutrivano un potente comportamento di toelettatura prima dell'infortunio.

Tuttavia, sette giorni dopo l'infortunio, la toelettatura non è stata suscitata dall'optogenetica nelle mosche di tipo selvaggio, mentre gli animali con morte attenuata dell'assone hanno continuato a pulirsi. Qui usiamo la perdita di mutazioni di funzione o la nostra espressione di geni per osservare la conservazione della morfologia assonale o della funzione sinaptica. Possono essere applicati altri metodi di modifica, come l'interferenza dell'RNA knock down o i knock out mediati CRISPR-Cas9 specifici del tessuto.

Questi metodi possono essere utilizzati in un contesto indipendente dalla lesione. Consentono l'osservazione e la caratterizzazione dei fattori di mantenimento neuronale durante l'invecchiamento, il trasporto assonale e gli organelli assonali negli assoni intatti.