Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l'embriogenesi

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare se due geni sono funzionalmente ridondanti per la specificazione di un lignaggio cellulare definito. Ciò si ottiene definendo prima il fenotipo con perdita di funzione di ogni singolo gene utilizzando morfi specifici del gene iniettati in embrioni di zebrafish in via di sviluppo. La seconda fase della procedura consiste nello sviluppare un test per quantificare la specificazione o la differenziazione della linea cellulare.

Ad esempio, utilizzando un ceppo di pesce reporter, come mostreremo qui. La terza fase della procedura consiste nel combinare due FENO morph per mirare alla perdita di funzione di entrambi i geni contemporaneamente. La fase finale della procedura consiste nel valutare il fenotipo causato dal doppio knockdown.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la perdita o il guadagno di funzione per le cellule di un lignaggio specifico attraverso l'esame del reporter di lignaggio o l'analisi dell'espressione per il marcatore specifico del lignaggio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la combinazione di knockout nel modello murino, è che due o anche tre geni possono essere presi di mira nel modello di pesce semplicemente combinando morphos convalidati in un singolo esperimento. È possibile iniettare oltre 100 embrioni e valutare i fenotipi nel corso di diversi giorni.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave. Nella biologia dello sviluppo, come la definizione delle vie trascrizionali che controllano il destino cellulare, le principali vie regolatorie sono spesso rappresentate da piccole famiglie di geni correlati che sono funzionalmente ridondanti. Il loro ruolo non è quindi evidente dagli studi knockout sui topi a causa della compensazione dei geni fratelli.

Sebbene questo modello possa fornire informazioni sull'embriogenesi del pesce zebra, i risultati possono essere applicati ad altri sistemi come il topo, poiché gli stessi programmi genetici sono in genere ben conservati durante l'evoluzione. Preparare le piastre per microiniezione prima di iniettare gli embrioni. Versare circa 12 millilitri di 2%agros nell'acqua del sistema, che è acqua pulita prelevata direttamente dal sistema dell'acquario nel coperchio rovesciato di una capsula di Petri da 100 millimetri.

Appoggiare due vetrini da microscopio ad angoli di circa 45 gradi nei due lati del coperchio. Quando l'agros si è solidificato, tirare delicatamente i vetrini lontano dal coperchio, creando trogoli dove gli embrioni riposeranno durante l'iniezione morph fo, nessun gambo viene mantenuto a temperatura ambiente a una concentrazione di un millimolare e acqua deionizzata distillata sterile prima dell'iniezione. Incubare le scorte di morphos a 65 gradi Celsius per cinque minuti per assicurarsi che siano completamente in soluzione.

Lasciare raffreddare i brodi a temperatura ambiente. Ogni morfo di nuova concezione deve essere convalidato empiricamente per l'attività e la tolleranza dell'embrione. Nelle provette per microcentrifuga, iniziare con una o due diluizioni seriali del morfo madre in acqua distillata deionizzata, ottenendo concentrazioni di lavoro di un millimolare, 0,5 millimolari, 0,25 millimolari e 0,125 millimolari.

Sotto un cannocchiale da dissezione, utilizzare l'aspirazione per caricare frontalmente un ago di iniezione calibrato che è stato collegato al micromanipolatore e posizionato correttamente. Caricare l'ago con circa un microlitro della soluzione morpho a più bassa concentrazione. Utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare gli embrioni fecondati di una cellula nelle depressioni della piastra per microiniezione.

Utilizzare la pipetta per rimuovere l'acqua in eccesso dalla piastra in modo che gli embrioni cadano sul fondo della mangiatoia. Posizionare la piastra di iniezione sotto il microscopio, far scendere l'ago attraverso il corion e nel tuorlo. Iniettare ogni embrione prima di rimuovere l'ago e riposizionare la piastra di iniezione per accedere all'embrione successivo.

Quando si impara a iniettare, può essere utile utilizzare un colorante vitale per visualizzare l'iniezione nella cellula come mostrato qui, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri da 100 millimetri con acqua di sistema coltivarli a 28,5 gradi Celsius. Espellere l'eventuale soluzione di morpho rimanente dall'ago e riempirla con il morpho successivo con la concentrazione più alta per iniettare il successivo lotto di embrioni in uno stadio di sviluppo appropriato. Esaminare gli embrioni per i fenotipi ad ogni concentrazione di morfo iniettata.

La dose soglia per ogni morfo è la dose più bassa alla quale esiste un fenotipo affidabile definito. Possono essere necessari più cicli di titolazione per definire una soglia imprecisa. Cercare un'interazione genetica tra due geni distinti.

Preparare una miscela di due morfi di interesse, ciascuno alla rispettiva concentrazione soglia. È importante tenere presente che gli embrioni non possono tollerare più di 20 nanogrammi di morfo totale per iniezione. Iniettare gli embrioni nello stesso modo di prima.

Mantenere costanti i volumi di iniezione tra i gruppi sperimentali e di controllo, che dovrebbero includere set iniettati con ogni morpho da solo al microscopio da dissezione. Monitorare gli embrioni iniettati subito dopo l'iniezione e più volte durante il giorno, utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere eventuali embrioni morti o morenti. Poiché questi possono compromettere la vitalità delle morfine rimanenti con una pipetta di trasferimento si muove, gli embrioni sedati o soppressi in qualsiasi momento.

Indica un vetrino di depressione per l'osservazione. Per la fotografia. Se necessario, utilizzare una pinza affilata per rimuovere il corion.

Stabilizzare l'embrione in una goccia di 3% di metilcellulosa per un fenotipo distinto, unico per la combinazione di morfosi in contrapposizione a una maggiore penetranza del fenotipo delle singole morfine. Qui ci sono diversi embrioni di tipo selvatico quando iniettati con morphos alla soglia. Per gata five, il fenotipo tipico è cardio bifida o due cuori, perché i progenitori non sono riusciti a fondersi sulla linea mediana.

Si notino i cardiomiociti positivi alla GFP indicati dalle frecce. Il fenotipo di sei morfine include cuori deformi che non riescono ad avvolgersi correttamente. Questi embrioni sviluppano anche cardiomiociti GFP positivi.

Tuttavia, gli embrioni iniettati con una combinazione di morfi gata cinque e gata sei mostrati qui. Presentano una perdita totale dello sviluppo dei cardiomiociti, indicando che il GATA 5 o il GATA 6 devono essere espressi per lo sviluppo dei cardiomiociti. I due geni sono funzionalmente ridondanti per la specificazione dei cardiomiociti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante prima convalidare completamente i tuoi morphos ed essere il più certo possibile che rappresentino un vero e proprio knockdown di un singolo bersaglio genetico Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la combinazione di alleli nulli condizionali di topo, possono essere eseguiti per dimostrare che gli stessi geni funzionano. Lo stesso vale per i mammiferi.

Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare se due geni sono funzionalmente ridondanti durante l'embriogenesi.