Name: Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante lembriogenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Scopri come determinare la ridondanza funzionale genica durante l'embriogenesi utilizzando embrioni di Danio rerio. Questo metodo combina morfolini e ceppi reporter per analizzare l'interazione tra geni.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Evans per il loro aiuto nella preparazione di questa presentazione. Il Morpholinos usato qui sono stati inizialmente convalidato dal Dr. Audrey Holtzinger. TE è supportato anche da finanziamenti del National Institutes of Health (HL064282 e HL056182). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall&#39;Istituto per la cura degli animali e del Comitato uso, del Weill Cornell Medical College.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nell&#39;esperimento descritto qui, abbiamo unito due Morpholinos, ognuna delle quali da sola di generare una gamma di fenotipi distinti, e ha trovato un fenotipo completamente diverso quando sono stati co-iniettata insieme. Naturalmente, avevamo bisogno di una giustificazione per fare questo esperimento, in primo luogo. Avevamo il sospetto che i due geni potrebbe compensare l&#39;un l&#39;altro per una funzione in precedenza, in questa specifica caso cardiaco. Questo perché i geni sono altamente correlate (e in grado d...

<table><tbody><tr><td>Acquari per allevamento di pesci e divisori</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retine per pesci</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua del sistema</td><td></td><td></td><td>60 mg di Instant Ocean&amp;#8221; per litro di dH2O</td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per tirare aghi per micropipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>Capillari di vetro da 3,5&quot;</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>Micromacinetta</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>Oculare del microscopio con griglia</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>Micrometro</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Contenitori monouso per pesatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>Microonde convenzionale</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beuta di Erlenmeyer</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduato</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>Pompetta automatica per pipette</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione lavaggio al 70% di etanolo</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di N2</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micoiniettore</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt; morfolino del sito di splicing</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>gata5 ATG Blocker</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt; ATG Blocker per l'isoforma lunga</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metansolfonato</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette appuntite</td><td>Dumont</td><td></td><td>Taglia 55</td></tr><tr><td>Vetrini con depressione</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

La funzione del gene durante l&#39;embriogenesi è tipicamente definito da perdita di funzione di esperimenti, per esempio mutagenesi mirata (eliminazione diretta) nel topo. Nel modello di zebrafish, efficaci tecniche della genetica inversa sono stati sviluppati utilizzando microiniezione di geni specifici per Morpholinos antisenso. Morpholinos un mRNA bersaglio attraverso specifici di base-accoppiamento e funzione genica bloccare transitoriamente dalla traduzione inibendo o splicing per diversi giorni durante l&#39;embriogenesi (atterramento). Tuttavia, nei vertebrati come mouse o pesce zebra, alcune funzioni geniche possono essere oscurate da questi approcci per la presenza di un altro gene che compensa la perdita. Ciò è particolarmente vero per le famiglie di geni contenenti geni sorella che sono co-espressi nei tessuti stesso sviluppo. In zebrafish, compenso funzionale può essere testato in maniera relativamente elevato throughput, per co-iniezione di Morpholinos che knockdown obiettivo di entrambi i geni contemporaneamente. Allo stesso modo, usando Morpholinos, una interazione genetica tra due geni può essere dimostrato con atterramento di entrambi i geni insieme a livello sub-livelli di soglia. Per esempio, Morpholinos può essere titolata in modo tale che né i singoli knockdown genera un fenotipo. Se, in queste condizioni, co-iniezione di entrambi Morpholinos causa un fenotipo, una interazione genetica è mostrato. Qui mostriamo come mostrare ridondanza funzionale nel contesto di due fattori correlati trascrizione GATA. Fattori GATA sono essenziali per la specificazione dei progenitori cardiaco, ma questo si rivela solo dalla perdita di entrambi i Gata5 e Gata6. Mostriamo come svolgere esperimenti microiniezione, convalidare il Morpholinos, e valutare il fenotipo compensato cardiogenesis.

La funzione del gene può essere oscurato la perdita di funzione esperimenti se non vi è compensazione da un altro gene. Il modello di zebrafish fornisce un numero relativamente elevato throughput significa rivelare tale ridondanza funzionale negli embrioni viventi.

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

La funzione genica durante l'embriogenesi viene tipicamente definita attraverso esperimenti di perdita di funzione, ad esempio mediante mutagenesi mirata (knockout) nel topo. In...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare se due geni sono funzionalmente ridondanti per la specificazione di una linea cellulare definita. Questo viene raggiunto innanzitutto definendo il fenotipo da perdita di funzione di ciascun gene singolo, utilizzando morpholino specifici per il gene iniettati in embrioni di pesce zebra in via di sviluppo. Il secondo passaggio della procedura consiste nello sviluppare un saggio per quantificare la specificazione o la differenziazione della linea cellulare.Ad esempio, utilizzando una linea di pesci reporter, come mostreremo qui. Il terzo passaggio della procedura consiste nel combinare due morph FENO per mirare la perdita di funzione di entrambi i geni contemporaneamente. L'ultimo passaggio della procedura è valutare il fenotipo causato dall'abbattimento doppio.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una perdita o un guadagno di funzione per le cellule di una specifica linea cellulare, attraverso l'esame del reporter della linea cellulare o l'analisi dell'espressione di marcatori specifici per la linea. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la combinazione di knockout nel m

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Un metodo genetica inversa adattabile per zebrafish per valutare la funzione del gene durante le fasi successive di sviluppo e omeostasi fisiologica, come la rigenerazione dei tessuti utilizzando iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici.

Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva

Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un in perdita e guadagno-di metodo di funzione che è applicabile per identificare neogenin come un recettore specifico stadio che porta a trophectoderm e la differenziazione massa cellulare interna di embrioni preimpianto mouse.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

Questo articolo descrive il video di una semplice metodologia vivo che può essere utilizzata per caratterizzare in modo sistematico ed efficiente componenti di vie di segnalazione complessi e reti di regolazione in molti embrioni invertebrati.

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelli di sviluppo per lo studio delle cellule cellula-Complex segnalazione di rete Interazioni

Vi presentiamo un protocollo di schermo semplice soppressore in fissione lievito. Questo metodo è efficiente, privo di sostanza mutagena e selettivo per le mutazioni che si verificano spesso in un singolo locus genomico.  Il protocollo è adatto per isolare i soppressori che alleviare i difetti di crescita in coltura liquida che sono causati da una mutazione o una droga.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di perdita di funzione che prevede l'introduzione e l'integrazione genomica di sequenze di micro-RNA artificiali in embrioni di pulcino utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol2. Questa tecnica fornisce una metodologia di knockdown genico robusta e stabile per gli studi sulla funzione genica durante lo sviluppo.

Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

La luce / buio prova di transizione è uno dei test più usato per misurare l'ansia comportamento simile nei topi. Qui, vi presentiamo un film che mostra le procedure dettagliate su come condurre il test.

Luce / buio test di transizione per i Topi

Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati ​​embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Induzione neurale è il primo passo nella formazione del cervello. Si tratta di un meccanismo attraverso il quale nodo di Hensen (organizzatore), istruisce tessuti adiacenti ad adottare un destino neurale, cioè di dare origine al sistema nervoso. Questo video dimostra un test per l'induzione neurale in embrione di pollo.

Test di induzione neurale nell&#39;embrione Chick

Scopri come determinare la ridondanza funzionale genica durante l'embriogenesi utilizzando embrioni di Danio rerio. Questo metodo combina morfolini e ceppi reporter per analizzare l'interazione tra geni.

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l'embriogenesi

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