Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare oligonucleotidi morph eno tramite iniezioni ventricolari nei geni larvali, coddle fin e knock down per valutare la loro funzione durante la rigenerazione. Ciò si ottiene anestetizzando prima la larva e posizionandola in una scanalatura dello stampo aros. Successivamente, l'ago per iniezione viene inserito nel ventricolo cardiaco.

Quindi la soluzione morpho viene iniettata da quattro a sei volte nel ventricolo con intervalli di ponderazione tra gli impulsi per consentire la pulizia del cuore. Infine, la pinna di coccola viene amputata e lasciata rigenerare per tre giorni. In definitiva, l'effetto sulla rigenerazione delle pinne può essere valutato misurando l'area rigenerata della pinna utilizzando lo strumento di tracciamento delle linee del software open source Fiji image J.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la transgenesi o la mutagenesi, è che consente l'abbattimento dei geni da parte di Minos nei tessuti larvali che non sono adatti per le iniezioni dirette Utilizzando capillari di vetro con un diametro di 0,75 millimetri, posizionarne uno in un estrattore di aghi e tirare l'ago con i seguenti parametri con una pinzetta da orologiaio, e sotto uno stereoscopio con oculare micrometrico, rompere il capillare tirato per produrre un ago di 20 micrometri di diametro. Quindi utilizzare un tornio con un filatoio di gomma sposata per affilare l'ago e produrre uno smusso di 20 micrometri. Preparare il morpho stock sciogliendo il Morpho liofilizzato in un XPBS fino a una concentrazione finale di 7,5 millimolari.

Miscelare la soluzione iniettabile di Morpho combinando 2,5 microlitri di soluzione madre di Morpho con 2,8 microlitri di una soluzione madre di endo Porter millimolare per una concentrazione finale di 3,5 millimolari di morph e 0,5 millimolari di endo porter per effettuare le iniezioni. Utilizzare una micro pipetta con punta da 10 microlitri per caricare l'ago di vetro smussato con cinque microlitri di soluzione morpho. Quindi inserire l'ago di vetro nel portaago del micro manipolatore collegato alla pompa pneumatica pico.

Regolare l'angolo per le iniezioni a circa 45 gradi in modo che l'ago debba essere spostato solo in una direzione della pialla. Quindi, impostare i valori del micro iniettore come segue, una pressione di mantenimento di 20 libbre per pollice quadrato o PSI una pressione di espulsione di 15 PSIA 100 millisecondi di intervallo di gating e un valore di periodo di 1,9, che corrisponde a 10,9 millisecondi. Preparare 20 millilitri di aros fuso all'1,5% in un XPBS e versarlo in una capsula di Petri da 10 centimetri.

Quindi posizionare uno stampo a iniezione scanalato nell'aros caldo per formare solchi nel gel indurito per anestetizzare le larve. Mettili in 100 millilitri di acqua dell'acquario con 20 milligrammi per litro di tricano. Dopo che smettono di rispondere al tatto, utilizzare una pipetta pastorale di plastica per trasferire con cura la larva in un solco dello stampo aros umido in modo che il lato ventrale sia rivolto verso la parete verticale dell'aros del solco.

Posizionare la piastra aros sotto lo stereomicroscopio in modo che il ventricolo sia rivolto lontano dall'ago per iniezione. Quindi, abbassare l'ago e inserirlo di circa uno o due micrometri nel ventricolo cardiaco. Facendo attenzione a non inserirlo troppo in profondità.

Quindi iniettare un impulso di tre nanolitri di soluzione Morpho nel ventricolo e nel peso per consentire la pulizia del cuore prima di ripetere con altri cinque impulsi dopo l'iniezione, rimuovere l'ago e metterlo in una capsula di Petri contenente un XPBS per evitare l'essiccazione. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento riempita con E 3 terreno, trasferire con cura le larve in una capsula di Petri contenente E 3 terreno fresco per garantire l'assorbimento e il mantenimento del morfo nelle cellule. Ripetere le iniezioni ogni 12-24 ore per tutta la durata dell'esperimento per valutare le iniezioni.

Dopo aver anestetizzato i pesci, posizionarli su una piastra piatta e bagnata ricoperta di terreno E tre prima di utilizzare uno stereomicroscopio con campo chiaro e fluorescenza per visualizzarli. Analizza le immagini per la rigenerazione utilizzando il software gratuito Fiji Image J per utilizzare lo strumento di tracciamento delle linee per determinare la quantità di crescita rigenerativa che si è verificata. Innanzitutto, calibra le immagini trascinando e rilasciando un file nella finestra principale delle Figi nel menu principale.

Imposta la scala per tutte le immagini facendo clic su analizza nel menu a discesa. Fai clic su imposta scala, quindi attiva l'opzione globale facendo clic sulla casella di controllo. Ora trascina e rilascia nuovamente l'immagine per misurare la quantità di crescita rigenerativa nella barra degli strumenti.

Scegli lo strumento di selezione a mano libera e circonda l'area da misurare. Infine, premi Ctrl M.Si aprirà una nuova finestra dei risultati che mostra il valore dell'area cerchiata in pixel quadrati. Come si vede qui entro pochi minuti dall'iniezione, la soluzione morpho endo porter si distribuisce in tutto il sistema vascolare in diversi tessuti come la piega delle pinne e il cervello per almeno 12 o più ore.

Per valutare la rigenerazione delle strutture distali delle pinne larvali, sono stati rimossi i seguenti elementi: la punta distale della piega della pinna e del midollo spinale, il muscolo distale senza cordone, il muscolo distale del tronco, che non è visibile qui, e le cellule del pigmento, che sono difficili da colpire con l'iniezione diretta, ma sembrano incorporare il morfo dopo iniezioni ventricolari seriali. Pertanto, questo metodo promuove relativamente facilmente la consegna di morfo a tessuti difficili da colpire individualmente e consente la valutazione della funzione genica in diversi tessuti nella pinna rigenerante contemporaneamente. Per analizzare l'importanza di specifici geni coinvolti nella rigenerazione, la pinna larvale viene parzialmente amputata e tutti i tessuti che hanno incorporato il morfo vengono resecati.

La piega larvale della pinna rigenera la sua struttura entro pochi giorni dall'amputazione, come dimostrato. Qui, morpho sta prendendo di mira i geni necessari per la rigenerazione, ha perturbato la risposta di rigenerazione rispetto ai controlli di morpho non iniettati e discorrispondenti dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione per esplorare i meccanismi molecolari coinvolti nella rigenerazione del pesce zebra