Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva

L'obiettivo generale di questa procedura è consegnare oligonucleotidi morfogenetici mediante iniezioni ventricolari nei larvi di pesce zebra per silenziare geni e valutarne la funzione durante la rigenerazione. Questo viene ottenuto anestetizzando innanzitutto il larva e posizionandolo nella scanalatura dello stampo in aros. Successivamente, l'ago di iniezione viene inserito nel ventricolo cardiaco.

Quindi la soluzione di morfo viene iniettata da quattro a sei volte nel ventricolo, con intervalli pesati tra i singoli impulsi per consentire la pulizia del cuore. Infine, la pinna codale viene amputata e lasciata rigenerare per tre giorni. In ultima analisi, l'effetto sulla rigenerazione della pinna può essere valutato misurando l'area rigenerata della pinna mediante lo strumento di tracciamento lineare del software open source Fiji ImageJ.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la trasgenesi o la mutagenesi è che consente l'abbattimento dell'espressione genica mediante minos in tessuti larvali che non sono adatti per iniezioni dirette. Utilizzando capillari di vetro con un diametro di 0,75 millimetri, inserirne uno in un estrattore di aghi ed estrarre l'ago con i seguenti parametri; quindi, con pinzette da orologiaio e sotto uno stereomicroscopio dotato di oculare micrometrico, spezzare il capillare estratto per ottenere un ago con diametro di 20 micrometri. Successivamente, utilizzare un tornio con una mola rotante in gomma per affilare l'ago e ottenere un bisellatura di 20 micrometri. Preparare la soluzione di riserva di Morpho sciogliendo il Morpho liofilizzato in 1x PBS per ottenere una concentrazione finale di 7,5 millimolari.

Mescolare la soluzione di iniezione Morpho combinando 2,5 microlitri di soluzione madre di Morpho con 2,8 microlitri di soluzione madre di endo Porter ad una concentrazione di un millimolare, per ottenere una concentrazione finale di 3,5 millimolare di morph e 0,5 millimolare di endo porter, da utilizzare per le iniezioni. Utilizzare una micropipetta con punta da 10 microlitri per caricare l'ago di vetro smussato con cinque microlitri di soluzione morpho. Inserire quindi l'ago di vetro nel supporto dell'ago del micromanipolatore collegato alla pompa pneumatica pico.

Regolare l'angolo delle iniezioni a circa 45 gradi in modo che l'ago debba essere spostato in una sola direzione planare. Successivamente, impostare i valori del microiniettore come segue: una pressione di mantenimento di 20 pound per pollice quadrato (psi), una pressione di espulsione di 15 psia, un intervallo di temporizzazione di 100 millisecondi e un valore del periodo di 1,9, corrispondente a 10,9 millisecondi. Preparare 20 millilitri di agarosio fuso al 1,5% in un XPBS e versarli in una piastra di Petri da 10 centimetri.

Quindi posizionare uno stampo per iniezione scanalato nell'aros caldo per formare solchi nel gel indurito al fine di anestetizzare le larve. Collocarle in 100 millilitri di acqua di acquario con 20 milligrammi per litro di trican. Dopo che hanno smesso di reagire al tocco, utilizzare una pipetta pasteur di plastica per trasferire con attenzione la larva in una scanalatura dello stampo aros bagnato, in modo che il lato ventrale sia rivolto verso la parete verticale dello stampo aros dello solco.

Posizionare la piastra con l'embrione sotto il microscopio stereoscopico in modo che il ventricolo sia rivolto lontano dall'ago di iniezione. Successivamente, abbassare l'ago e inserirlo di circa uno o due micrometri nel ventricolo cardiaco, avendo cura di non inserirlo troppo in profondità.

Quindi iniettare un impulso di tre nanolitri di soluzione Morpho nel ventricolo e attendere per permettere la pulizia del cuore prima di ripetere con altri cinque impulsi; dopo l'iniezione, rimuovere l'ago e posizionarlo in una capsula di Petri contenente un XPBS per prevenire l'essiccamento. Successivamente, utilizzando una pipetta trasferibile riempita con mezzo E three, trasferire con attenzione le larve in una capsula di Petri contenente mezzo E three fresco per garantire l'assunzione e il mantenimento del morpholino nelle cellule. Ripetere le iniezioni ogni 12-24 ore per tutta la durata dell'esperimento al fine di valutare gli effetti delle iniezioni.

Dopo aver anestetizzato i pesci, posizionarli su una piastra piatta e bagnata rivestita con E three medium prima di utilizzare un microscopio stereoscopico a campo chiaro e in fluorescenza per acquisirne le immagini. Analizzare le immagini per la rigenerazione utilizzando il software gratuito Fiji Image J e lo strumento di tracciamento lineare per determinare la quantità di crescita rigenerativa avvenuta. Per prima cosa, calibrare le immagini trascinando e rilasciando un file nella finestra principale di Fiji presente nel menu principale.

Imposta la scala per tutte le immagini facendo clic su "analizza" nel menu a tendina. Fai clic su "imposta scala", quindi attiva l'opzione globale selezionando la casella di controllo. Ora trascina e rilascia nuovamente l'immagine per misurare la quantità di crescita rigenerativa nella barra degli strumenti.

Scegliere lo strumento di selezione a mano libera e circondare l'area da misurare. Infine, premere Ctrl M. Verrà aperta una nuova finestra dei risultati che mostra il valore dell'area circondata in pixel quadrati. Come si può osservare, entro pochi minuti dall'iniezione, la soluzione morpho endo porter si distribuisce attraverso la vascolarizzazione in diversi tessuti, come il lembo della pinna e il cervello, per almeno 12 ore o più.

Per valutare la rigenerazione delle strutture distali della pinna larvale, sono state rimosse le seguenti parti: l'apice distale della piega della pinna e del midollo spinale, la regione distale senza corda, il muscolo del tronco distale, che qui non è visibile, e le cellule del pigmento, difficili da colpire mediante iniezione diretta, ma che sembrano incorporare il morpholino dopo iniezioni ventricolari seriali. Pertanto, questo metodo promuove in modo relativamente semplice il rilascio del morpholino nei tessuti difficili da colpire singolarmente e permette di valutare la funzione genica in diversi tessuti della pinna in rigenerazione contemporaneamente. Per analizzare l'importanza di geni specifici coinvolti nella rigenerazione, la pinna larvale viene parzialmente amputata e tutti i tessuti che hanno incorporato il morpholino vengono resecati.

La piega della pinna larvale rigenera la sua struttura entro pochi giorni dal taglio, come dimostrato. Qui, il morfolino ha bersagliato geni necessari per la rigenerazione, alterando la risposta rigenerativa rispetto ai controlli non iniettati e ai controlli con morfolino mismatch. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione per esplorare i meccanismi molecolari coinvolti nella rigenerazione della pinna del pesce zebra.