Modello di cardiomiopatia zebrafish: cardiotossicità indotta da farmaci

- La cardiomiopatia è una condizione in cui il muscolo cardiaco si indebolisce e perde la capacità di pompare sangue. Questa condizione può essere replicata nei pesci zebra. In primo luogo, diluire una soluzione stock di un farmaco responsabile della cardiotossicità nella soluzione salina equilibrata di Hanks per preparare diverse concentrazioni di lavoro. Successivamente, posizionare un pesce anestetizzato di tricaina, lato ventrale verso l'alto, su una spugna di tenuta sotto un microscopio sezionante. Posizionare l'ago tra le pinne pelviche con un angolo di 45 gradi dall'orizzontale.

Ora spingere delicatamente l'ago da 1 a 2 millimetri nella cavità peritoneale e iniettare lentamente la soluzione farmacologica. Attendere cinque secondi prima di estrarre l'ago per evitare che la soluzione perda. Trasferire immediatamente il pesce in un serbatoio pulito contenente acqua fresca del sistema. Registrare il numero di pesci che muoiono ogni giorno a causa di una grave cardiotossicità, danni al muscolo cardiaco. Il farmaco si lega ai recettori della morte presenti sulla membrana cellulare cardiomiocita e innesca l'apoptosi, con conseguente grave cardiotossicità.

Create una curva di sopravvivenza, un grafico che mostri la probabilità di sopravvivenza nel tempo per ogni concentrazione di farmaci. Nell'esempio, inietteremo doxorubicina, o DOX, per indurre la cardiomiopatia in un pesce zebra adulto in due modi.

Prima di iniettare il pesce con DOX, digiunare il pesce per 24 ore. Quindi, raggruppare il pesce. Durante l'anestesia, utilizzare una carta da filtro pulita per asciugare ogni pesce e misurarne il peso corporeo. Creare gruppi di pesci che si trovano tutti entro il 10% dello stesso peso corporeo in modo che ogni gruppo possa essere iniettato con la stessa dose di DOX. Successivamente, calcolare la concentrazione di lavoro di DOX per ciascun gruppo in modo che ogni gruppo venga iniettato con cinque microlitri di soluzione e riceva la stessa dose di DOX in base al peso corporeo.

Quindi, diluire lo stock di DOX in 1x HBSS. Mescolare la diluizione con un vortice e quindi ruotare la diluizione per tenerla raggruppata nel tubo. Per l'iniezione, preparare una piattaforma di iniezione. In una piastra di Petri pulita da 100 millimetri, posizionare una spugna. Con l'aiuto di un microscopio a dissezione, tagliare una cavità nella spugna per contenere un pesce, quattro centimetri di solito funzionano.

Quindi, su un ago calibro 34, fissare un microsiringe da 10 microliter. Quindi sciacquare l'ago con 1x HBSS per rimuovere eventuali bolle o blocchi dalla siringa e dai tubi. Ora, anestetizzare brevemente il pesce adulto con la tricaina. Quindi, immergere la spugna nell'acqua dell&'embrione con la tricaina e trasferire un pesce sulla spugna con l&&;addome per liniezione. Ora, iniettare per via intraperitoneale la soluzione DOX inserendo rapidamente l'ago con un angolo di 45 gradi nella linea mediana tra le pinne pelviche profonde circa 1-2 millimetri.

Quindi, rilasciare lentamente tutta la soluzione DOX. Prima di ritrarre l'ago, attendere cinque secondi. In alternativa, il pesce può essere posizionato lateralmente con l'interno a destra. Quindi, iniettato la linea laterale sopra la pinna pelvica con la smussatura rivolta verso le 7 con un angolo di 45 gradi e 3-4 millimetri di profondità. Se uno dei due metodi di iniezione ha avuto successo, ci sarà una tinta rossa nella pancia.

Dopo l'iniezione, trasferire rapidamente il pesce in un serbatoio di incrocio pulito pieno di acqua di sistema fresca dove può riprendersi. Quindi sciacquare l'ago con HBSS e procedere all'iniezione del pesce successivo. In seguito, riportare il pesce iniettato in un sistema con circolazione in esecuzione ma separato dal sistema principale per evitare contaminazioni incrociate. Per le successive 24 ore, continuare a digiunare il pesce. Durante la prima settimana, dopo l'iniezione, assicurarsi di controllare quotidianamente il pesce e rimuovere qualsiasi pesce morto.