Name: Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine specifico in campioni complessi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Scopri il profilo di glicosilazione multiplexed di glicoproteine sieriche mediante microarray di anticorpi chimicamente bloccati. Questo metodo ad alto throughput riduce tempi e costi rispetto alle tecniche tradizionali come HPLC.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

1. Proteina bersaglio e selezione anticorpo di cattura Prima del test microarray anticorpi, alcuni reagenti e materiali sono necessari per essere considerato e preparati. Per progettare un microarray per l&#39;analisi degli anticorpi glicano o biomarker di screening glicano, un pannello di anticorpi specifici per i candidati della glicoproteina deve essere determinato secondo la letteratura o dai risultati precedenti. Questi anticorpi sono di solito acquistati da fornitori diversi, quali R &amp...

<table border="1"><tbody><tr><td> ID </td><td> Nome del reattivo </td><td> Abbreviazione </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td></tr><tr><td> L1 </td><td> Biotinilato Concanavalina A </td><td> ConA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L2 </td><td> Biotinilato Sambucus Nigra lectina </td><td> SNA </td><td> Vector Laboratories </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> L3 </td><td> Biotinilato Lens Culinaris agglutinina </td><td> LCA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L4 </td><td> Biotinilato Ricinus Communis agglutinina I </td><td> RCA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L5 </td><td> Biotinilato Aleuria aurantia lectina </td><td> AAL </td><td> Vector Laboratories </td><td> B-1395 </td></tr><tr><td> L6 </td><td> Biotinilato Erythrina cristagalli lectina </td><td> ECL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L7 </td><td> Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II </td><td> GSL II </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L8 </td><td> Biotinilato di Germe di Grano agglutinina </td><td> WGA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L9 </td><td> Biotinilato Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris </td><td> PHA-E </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L10 </td><td> Biotinilato Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris </td><td> PHA-L </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L11 </td><td> Peanut agglutinina biotinilato </td><td> PNA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L12 </td><td> Biotinilato Pisum Sativum agglutinina </td><td> PSA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L13 </td><td> Biotinilato Dolichos biflorus agglutinina </td><td> DBA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L14 </td><td> Biotinilato lectina Datura Stramonium </td><td> DSL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L15 </td><td> Biotinilato agglutinina Sophora Japonica </td><td> SJA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L16 </td><td> Soia agglutinina biotinilato </td><td> SBA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L17 </td><td> Biotinilato Solanum tuberosum (patata) lectina </td><td> STL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L18 </td><td> Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I lectina </td><td> GSL I </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L19 </td><td> Biotinilato Vicia Villosa lectina </td><td> VVL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L20 </td><td> Biotinilato Lycopersicon esculentum (pomodoro) lectina </td><td> LEL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L21 </td><td> Biotinilato Ulex Europaeus agglutinina I </td><td> UEA I </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L22 </td><td> Biotinilato Jacalin </td><td> JACALIN </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> A1 </td><td> Capra F (ab &#39;) 2 Frammento anti-IgM umane, anticorpi Fc5μ </td><td> IgM </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 109-006-129 </td></tr><tr><td> A2 </td><td> Donkey F (ab &#39;) 2 Frag anti-IgG umane (H + L) unotibody </td><td> AB1 </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 709-006-149 </td></tr><tr><td> A3 </td><td> Topo anti-IgG umane F (ab &#39;) 2 anticorpo monoclonale </td><td> AB3 </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 209-005-097 </td></tr><tr><td> A4 </td><td> Capra anti-umano alfa 2 macroglobulina anticorpo policlonale </td><td> A2M </td><td> GeneTex </td><td> GTX62924 </td></tr><tr><td> A5 </td><td> Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale </td><td> A1AT </td><td> Lee Biosiences </td><td> CA1T-80A </td></tr><tr><td> A6 </td><td> Topo anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo monoclonale </td><td> A1AT </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SAB4200198 </td></tr><tr><td> A7 </td><td> Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale </td><td> ACT </td><td> NeoMarkers </td><td> RB-367-A1 </td></tr><tr><td> A8 </td><td> Coniglio anti-umanoalfa-1-antichimotripsina anticorpo policlonale </td><td> ACT </td><td> Fisher Scientific </td><td> RB9213R7 </td></tr><tr><td> A9 </td><td> Topo anti-transferrina umana anticorpo monoclonale </td><td> Transferrina </td><td> GeneTex </td><td> GTX101035 </td></tr><tr><td> A10 </td><td> Coniglio anti-transferrina umana anticorpo policlonale </td><td> Transferrina </td><td> GeneTex </td><td> GTX77130 </td></tr><tr><td> A11 </td><td> Capra anti-umano apolipoproteina J anticorpo policlonale </td><td> ApoJ </td><td> Abcam </td><td> ab7610 </td></tr><tr><td> A12 </td><td> Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale </td><td> GP73 </td><td> Abbott </td><td> 14H4-23 </td></tr><tr><td> A13 </td><td> Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale </td><td> GP73 </td><td> Santa Cruz Biotechnology INC </td><td> sc-101275 </td></tr><tr><td> A14 </td><td> Coniglio anti-umano alfa-1 fetoprotein anticorpo policlonale </td><td> AFP </td><td> Genway </td><td> GWB-41C966 </td></tr><tr><td> A15 </td><td> Murino anti-umano alfa-1 fetoproteina anticorpo monoclonale </td><td> AFP </td><td> Fitzgerald </td><td> 10-A05A </td></tr><tr><td> A16 </td><td> Topo anti-umano emopessina anticorpo monoclonale </td><td> Emopessina </td><td> Assaypro </td><td> 60.190-05.011 </td></tr><tr><td> A17 </td><td> Murino anti-umano glypican-3 (1g12) anticorpo monoclonale </td><td> GPL3 </td><td> Santa Cruz Bio </td><td> sc-65443 </td></tr><tr><td> A18 </td><td> Topo anti-umano chininogeno (LMW) anticorpo monoclonale </td><td> Chininogeno </td><td> Assaypro </td><td> 20.333-05.011 </td></tr><tr><td> A19 </td><td> Coniglio anti-umano MMP-21 anticorpo monoclonale </td><td> MMP21 </td><td> Epitomic </td><td> 1955-1 </td></tr><tr><td> A20 </td><td> Topo anti-umano CEACAM-1 anticorpi monoclonaliy </td><td> CEACAM </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB1180 </td></tr><tr><td> A21 </td><td> Ratto anti-umano DPPIV/CD26 anticorpo monoclonale </td><td> DPPIV </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB22441 </td></tr><tr><td> A22 </td><td> Topo anti-umano PIVKA II anticorpo monoclonale </td><td> PIVICA </td><td> Cristallo chem </td><td> 8040 </td></tr><tr><td> A23 </td><td> Topo anti-antigene carcinoembrionario </td><td> CEA </td><td> USA biologico </td><td> C1300 </td></tr><tr><td> A24 </td><td> Topo Antigen anti-cancro CA125 </td><td> CA125 </td><td> USA biologico </td><td> C0050-01D </td></tr><tr><td> A25 </td><td> Topo anti-CA19-9 Cancer antigene </td><td> CA19-9 </td><td> USA biologico </td><td> C0075-18 </td></tr><tr><td> A26 </td><td> Topo anti-Lewis x anticorpo monoclonale </td><td> Lewis x </td><td> Calbiochem </td><td> 434631 </td></tr><tr><td> bio </td><td> Biotinilato BSA (controllo positivo) </td><td> Bio </td><td> Fatto in casa </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco delle lectine e anticorpi utilizzati in questo protocollo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo, s / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Contatto micro-distributore non </td><td> BioDot Inc </td><td> sciFLEXARRAYER </td></tr><tr><td> 384 micropiastra </td><td> Pescatore </td><td> 14-230-243 </td></tr><tr><td> Foodsaver </td><td> Foodsaver </td><td> V3835 </td></tr><tr><td> Ultrasottile nitrocellulosa Coate microarray scivola </td><td> Gentel </td><td> PATH </td></tr><tr><td> Presentazione Imprinter (opzionale) </td><td> Il Gel Società </td><td> WSP60-1 </td></tr><tr><td> Shaker </td><td> Pescatore </td><td> 15-453-211 </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5804 000.013 </td></tr><tr><td> Diapositiva lavandino / Slide Dish colorazione con Rack estraibile </td><td> Pescatore </td><td> 08-812 </td></tr><tr><td> Diapositiva camera di incubazione / vetrino da microscopio box </td><td> Pescatore </td><td> 03-448-5 </td></tr><tr><td> Brij 35, 30 w / v% di soluzione in acqua </td><td> Acros Organics </td><td> AC32958-0025 </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Pescatore </td><td> P337-100 </td></tr><tr><td> Periodato di sodio (NAIO 4) </td><td> Sigma </td><td> 311448 </td></tr><tr><td> L-glutammico γ-idrazide </td><td> Sigma </td><td> G-7257 </td></tr><tr><td> Acetato di sodio anidro (CH 3 COONa) </td><td> Sigma </td><td> S2889 </td></tr><tr><td> Albumina sierica bovina (BSA) </td><td> Lampire Biological Labs </td> &lt;td&gt; 7500804 </td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino (PBS) (10X) </td><td> Denville scientifico </td><td> CP4390-48 </td></tr><tr><td> Dylight 549 neutravidina coniugato </td><td> Thermo </td><td> 22837 </td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi Cocktail Tablets </td><td> Roche </td><td> 4693159001 </td></tr><tr><td> ChromPure IgG umane, frammento Fc </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 009-000-008 </td></tr><tr><td> ChromPure IgG umane, molecola intera </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 009-000-003 </td></tr><tr><td> ChromPure mouse IgG, molecola intera </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> ChromPure mouse IgG, frammento Fc </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-008 </td></tr><tr><td> ChromPure IgG di coniglio, molecola intera </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 011-000-003 </td></tr><tr><td> ChromPure Donkey IgG, molecola intera </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 017-000-003 </td></tr><tr><td> Microarray Scanner </td><td> Tecan </td><td> LS Reloaded </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Elenco di attrezzature e reagenti utilizzati in questo protocollo.

anticorpo microarray chimicamente bloccato per multiplexed high-throughput profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In questo studio, descriviamo un protocollo efficace da utilizzare in un microarray multiplex ad alto rendimento di anticorpi con rilevamento di proteine leganti glicani, che consente il profilo della glicosilazione di proteine specifiche. La glicosilazione delle proteine è la modifica post-traduzionale più diffusa presente sulle proteine e determina modifiche diversificate delle proprietà fisiche, chimiche e biologiche delle stesse. Poiché il sistema di glicosilazione è particolarmente suscettibile al progresso delle malattie e alla trasformazione maligna, la glicosilazione aberrante è stata riconosciuta come biomarcatore per la diagnosi precoce di cancro e di altre patologie. Tuttavia, i metodi attualmente disponibili per lo studio della glicosilazione proteica sono tipicamente troppo complessi o costosi per essere utilizzati nella maggior parte dei laboratori comuni o in ambito clinico, rendendo necessario un metodo più pratico. Il nuovo protocollo descritto in questo studio sfrutta un microarray di anticorpi chimicamente bloccato con rilevamento mediante proteine leganti glicani (GBP), riducendo significativamente il tempo, il costo e le esigenze di attrezzature di laboratorio necessarie per lo studio della glicosilazione proteica. In questo metodo, diversi anticorpi specifici per glicoproteine immobilizzati vengono stampati direttamente su vetrini per microarray e gli N-glicani sugli anticorpi vengono bloccati. Gli anticorpi specifici per glicoproteine bloccati e immobilizzati sono in grado di catturare e isolare le glicoproteine da un campione complesso applicato direttamente sui vetrini del microarray. Il rilevamento dei glicani può quindi essere effettuato mediante l'applicazione di lectine biotinilate e altre GBP sul vetrino del microarray, mentre i livelli di legame possono essere determinati utilizzando Streptavidina-Dylight 549. Attraverso l'uso di un pannello di anticorpi e l'analisi con multiple lectine biotinilate, questo metodo consente di ottenere un profilo efficace della glicosilazione delle diverse proteine presenti in un determinato campione umano o animale.
Introduzione
La glicosilazione delle proteine, che è la modifica post-traduzionale più diffusa sulle proteine, ne modifica le proprietà fisiche, chimiche e biologiche, svolgendo un ruolo fondamentale in diversi processi biologici.1-6Poiché il sistema di glicosilazione è particolarmente suscettibile al progredire della malattia e alla trasformazione maligna, una glicosilazione anomala è stata riconosciuta come biomarcatore per la diagnosi precoce di cancro e di altre malattie 7-12Infatti, la maggior parte degli attuali biomarcatori del cancro, come la frazione L3 della α-1-fetoproteina (AFP) per il carcinoma epatocellulare 13-15e CA199 per il cancro del pancreas 16, 17 sono tutti residui glicanici aberranti sui glicoproteine. Tuttavia, i metodi per lo studio della glicosilazione proteica sono risultati complessi e non adatti per impieghi di routine in ambito laboratoristico e clinico. Chen et al. ha recentemente ideato un microarray di anticorpi chimicamente bloccati con un metodo di rilevamento mediante proteine leganti glicani (GBP) per il profilo ad alto rendimento e multiplex della glicosilazione di glicoproteine native in un campione complesso 18. In questo metodo di microarray basato sull'affinità, diversi anticorpi specifici per glicoproteine immobilizzati catturano e isolano direttamente le glicoproteine dalla miscela complessa sulla lamellina del microarray, e i glicani su ciascuna proteina catturata vengono rilevati mediante GBP. Poiché tutti gli anticorpi normali contengono N-glicani che potrebbero essere riconosciuti dalla maggior parte dei GBP, il passaggio cruciale di questo metodo consiste nel bloccare chimicamente i glicani presenti sugli anticorpi per impedirne il legame ai GBP. Nella procedura, il cisI gruppi -diolo dei glicani sugli anticorpi sono stati inizialmente ossidati a gruppi aldeidici utilizzando NaIO₄4 in tampone di acetato di sodio, al riparo dalla luce. I gruppi aldeidici sono stati quindi coniugati al gruppo idrazide di un cross-linker, l'acido 4-(4-N-maleimidofenil)butirrico idrazide cloridrato (MPBH), seguito dalla coniugazione di un dipeptide, Cys-Gly, al gruppo maleimide dell'MPBH. In questo modo, i gruppi cis-diolo dei glicani degli anticorpi sono stati convertiti in gruppi ingombranti privi di idrossili, che ostacolano il legame di lectine e altri GBP agli anticorpi di cattura. Questa procedura di blocco fa sì che i GBP e le lectine si leghino esclusivamente ai glicani delle proteine catturate. Dopo questo blocco chimico, i campioni di siero sono stati incubati con la microarray di anticorpi, seguita dalla rilevazione dei glicani mediante l'uso di diverse lectine e GBP biotinilati, e visualizzati con streptavidina-Cy3. L'uso in parallelo di un pannello di anticorpi e di diversi saggi con lectine fornisce profili di glicosilazione distinti per molteplici proteine in un dato campione 18-20. Questo metodo è stato utilizzato con successo in diversi laboratori 1, 7, 13, 19-31Tuttavia, la stabilità di MPBH e Cys-Gly, insieme alla procedura complessa e prolungata di questo metodo, influiscono sulla riproducibilità, efficacia ed efficienza del metodo stesso. In questo nuovo protocollo, abbiamo sostituito sia MPBH che Cys-Gly con un reagente molto più stabile, l'idrazide dell'acido glutammico (Glu-idrazide), migliorando significativamente la riproducibilità del metodo e semplificando e abbreviando l'intera procedura, che può così essere completata entro una singola giornata lavorativa. In questo nuovo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata, facilmente adottabile da laboratori ordinari per lo studio routinario della glicosilazione proteica, e le tecniche necessarie per ottenere risultati riproducibili e ripetibili.

In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

In questo studio, descriviamo un protocollo efficace per l'impiego in un microarray di anticorpi multiplex ad alta produttività con rilevazione di proteine leganti i glicani che...

Questo articolo video descrive un procedimento per ottenere profili di glicosilazione di 20 diversi glicoproteine in un campione di siero di paziente affetto da carcinoma epatocellulare, utilizzando un microarray di anticorpi chimicamente bloccato. Inizialmente, specifici anticorpi per le glicoproteine vengono stampati direttamente su vetrini per microarray e i glicani degli anticorpi vengono bloccati per impedire il legame con le lectine. Quando vengono applicati i campioni di siero del paziente, le glicoproteine presenti nel campione vengono catturate dagli anticorpi. Successivamente vengono aggiunte proteine leganti i glicani biotinilati per rilevare i glicani, e viene aggiunto streptavidina di-coniugata per etichettare le lectine biotinilate.Il vetrino per microarray viene quindi scansionato per rilevare la fluorescenza; l'analisi dei dati ottenuti rivela i profili di glicosilazione delle proteine del campione. Questa tecnica presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti come l'HPLC. Il metodo consente il rilevamento di singole glicoproteine nel loro stato nativo.È più rapido e semplice analizzare contemporaneamente le alterazioni della glicosilazione per molteplici proteine. Abbiamo scoperto che i biomarcatori delle malattie, in particolare del cancro e del carcinoma epatico, che abbiamo esaminato con maggiore attenzione, sono spesso glicosilati. Inoltre, abbiamo riscontrato che la capacità di rilevare forme glicosidiche specifiche migliora notevolmente le prestazioni dei biomarcatori in termini di sensibilità e specificità.Pertanto, questa misura può fornire informazioni sulle alterazioni della glicosilazione di molteplici proteine sieriche nel carcinoma epatocellulare. Può inoltre essere applicata allo studio patologico e alla scoperta di biomarcatori in altri tipi di cancro e malattie, come il cancro del pancreas, il diabete e la malattia di Alzheimer. A dimostrare la procedura sarà Chen Lu, un tecnico del mio laboratorio.Iniziare questo protocollo preparando innanzitutto il microarray di anticorpi in provette microcentrifuga da 0,8 millilitri su ghiaccio, diluendo tutti gli anticorpi che verranno utilizzati per la stampa del microarray a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro in un minimo di 40 millilitri di PBS; in questo caso, verranno utilizzati 26 anticorpi diversi come controllo positivo. Preparare anche la stessa quantità di BSA biotinilata a 0,5 milligrammi per millilitro in PBS. Utilizzare una pipetta per aliquotare 40 millilitri di ciascun anticorpo nella piastra sorgente da 384 pozzetti posta su ghiaccio.Quindi, nel software di controllo del microarray, assegnare la posizione di ciascun anticorpo. Successivamente, caricare la piastra sul microarray come sorgente. Poi caricare 20 vetrini per microarray sul microarray come destinazione.Impostare il microarray per stampare 48 sottoarray identici in cui 27 anticorpi e proteine di controllo vengono depositati in triplice copia secondo uno schema nove per nove. Avviare il microarray per stampare le lamelle del microarray di anticorpi. Raccogliere le lamelle del microarray di anticorpi e conservarle in un contenitore per lamelle con disidratante.Sigillare la cassetta in un sacchetto di plastica per prevenire la denaturazione delle proteine e l'umidità sui vetrini durante la conservazione. Conservare i vetrini per microarray sigillati a quattro gradi Celsius fino al loro utilizzo. L'aspetto più difficile e importante di questa procedura è il passaggio di bloccaggio chimico.Per garantire il successo, è fondamentale che venga stampata una quantità sufficiente di anticorpo sull'array microscopico luminoso. Preparare sempre al momento l'IDE di sodio e l'idrocito di acido agarico immediatamente prima dell'esperimento. Inoltre, assicurarsi di eseguire la procedura di ossidazione a quattro gradi, evitando l'esposizione alla luce.Estrarre le lamelle per microarray dal frigorifero e portarle a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere una lamella dalla scatola di conservazione. Immergere brevemente la lamella in un contenitore con PBS contenente lo 0,1% di tween 20.Quindi immergere il vetrino in tampone di acetato di sodio 15 millimolare con 0,1% di tween per 10 minuti. Successivamente, preparare una soluzione fresca di periodato di sodio 150 millimolare in tampone di acetato di sodio 15 millimolare e trasferirla in un contenitore per il lavaggio dei vetrini. Conservare in frigorifero, al riparo dalla luce, fino all'uso. Rimuovere il vetrino dal tampone di acetato di sodio e posizionarlo nel contenitore contenente il periodato di sodio fresco con il lato dell'anticorpo rivolto verso l'alto.Coprire la vaschetta con della pellicola di alluminio per proteggerla dalla luce. Quindi posizionare la vaschetta con i vetrini a quattro gradi Celsius con agitazione delicata per due ore. Rimuovere il vetrino dalla vaschetta e risciacquarlo brevemente tre volte nel buffer di acetato di sodio, per cinque minuti ciascuna.Incubare il vetrino in 300 millilitri di soluzione bloccante di acido idroglutamico 10 millimolare appena preparata, in una camera di incubazione per due ore a temperatura ambiente con agitazione delicata. Rimuovere i vetrini dalla camera e lavarli con PBS contenente 0,1% di tween per tre minuti. Successivamente, in un contenitore per il lavaggio dei vetrini, incubare il vetrino a microarray in 300 millilitri di soluzione di BSA al 1% in PBS con 0,5% di tween per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata.Lavare i vetrini in PBS con tween 0,1% tre volte per tre minuti. Posizionare il vetrino su un portavetrini e centrifugare a 1.200 ×g per due minuti per asciugare il vetrino per microarray. Per separare ogni sottoarray, una griglia di cera viene impressa sul vetrino.Dopo aver preriscaldato l'impronta di cera a 70 gradi Celsius per cinque minuti, inserire il vetrino microarray bloccato nell'impronta di cera con il lato degli anticorpi rivolto verso la cera. Tirare delicatamente la leva per imprimere la cera in modo uniforme sul vetrino. Questo metodo può essere utilizzato per eseguire saggi di profilazione glicidica per un singolo campione o per misurare un singolo epitopo glicidico in più campioni.Di seguito verranno illustrate prove di profilazione glicidica. Iniziare diluendo 40 microlitri di siero in 360 microlitri di PBS contenente 0,1% di tween, 0,1% di bridge 35 e 100 microgrammi per millilitro, ciascuno, di IgG di topo, ratto, coniglio, capra e asino. Questo volume è sufficiente per applicare sei microlitri di soluzione di siero diluito su ciascuna sotto-matrice.Applicare con attenzione sei microlitri del campione diluito o del controllo su ciascun sotto-array del vetrino. Incubare il vetrino in una cassetta umidificata con tovaglioli di carta bagnati a temperatura ambiente per un'ora. Lavare il vetrino con PBS contenente 0,1% di tween per tre volte, per tre minuti ciascuna.Quindi asciugare il vetrino centrifugandolo a 1200 ×g per due minuti. Preparare 20 microlitri di proteine leganti glicani biotinilati a 10 milligrammi per millilitro in PBS tween in un tubo microcentrifuga da 0,8 millilitri su ghiaccio. Applicare sei microlitri dei lectine biotinilati diluiti su ciascun sotto-array del vetrino e incubare nella scatola per vetrini umidificata con tovaglioli di carta bagnati a temperatura ambiente per un'ora.Dopo aver lavato i vetrini con PBS contenente 0,1% di Tween tre volte come in precedenza, asciugare il vetrino centrifugandolo a 1200 ×g per due minuti. Preparare 400 microlitri di neutreven marcato con DITE 5 49 alla concentrazione di 10 milligrammi per millilitro in PBS con 0,1% di Tween in un tubo microcentrifuga da 0,8 millilitri su ghiaccio. Utilizzare una pipetta ripetitiva per applicare sei microlitri di neutreven marcato con DITE 5 49 su ciascun sotto-array e incubare il vetrino nella cassetta umidificata per vetrini a temperatura ambiente per un'ora dopo l'incubazione.Lavare il vetrino con PBS 0,1% tween tre volte per tre minuti ciascuna. Asciugare il vetrino centrifugandolo a 1200 ×g per due minuti. Scansionare il vetrino utilizzando uno scanner a microarray a fluorescenza con risoluzione di 10 millimetri.Le impostazioni del laser e del PMT devono essere il più intense possibile, assicurandosi che non si verifichi alcuna saturazione. Aprire l'immagine in Array Pro 3.2. Configurare il modello di array in base alla mappa dell'array che mostra le posizioni dei punti di anticorpo.Allineare con attenzione ogni cerchio modello sulla posizione corrispondente nell'immagine ed estrarre l'intensità di ogni spot in un file di Excel per ulteriori analisi. Un microarray di anticorpi contenente 48 sottogrid identici con 26 anticorpi contro 20 glicoproteine sieriche e biotina. L'albumina sierica bovina (BSA) è stata progettata e prodotta come descritto in questo video per esaminare l'importanza della procedura di bloccaggio.Nell'analisi del profilo delle glicoproteine, sono stati generati due microarray identici. Uno non è stato bloccato chimicamente, mentre sull'altro è stato applicato un campione di controllo sulle sotto-matrici nelle colonne uno e tre e un campione di siero HCC pooled è stato applicato sulle sotto-matrici nelle colonne due e 4 22.Lettine biotinilati specifici per diversi glicani sono stati quindi applicati su ciascun sottoschieramento, come mostrato in queste immagini dei sottoschieramenti. Le lettine si sono legate agli anticorpi di cattura nelle colonne di controllo, generando uno sfondo elevato che non era distinguibile dalle colonne caricate con siero nei microarray non bloccati. Tuttavia, quando lo stesso esperimento è stato eseguito su un vetrino per microarray di anticorpi bloccato chimicamente, non si è verificato alcun legame o un legame molto basso agli anticorpi di cattura nelle colonne di controllo, mentre si è osservato un elevato legame all'antigene nelle colonne caricate con siero.Questi risultati dimostrano che la procedura di blocco chimico è un passaggio fondamentale per la misurazione dei glicani su glicoproteine catturate da anticorpi. Seguendo il protocollo, è possibile ottenere i profili di glicosilazione di 22 glicoproteine nel siero di HCC una volta acquisita padronanza della tecnica. Questa tecnica può essere eseguita in otto ore se svolta correttamente. Gli anticorpi, quando modificati, possono perdere affinità per i loro antigeni e altre proprietà.Pertanto, è importante tenerlo presente e utilizzare diversi anticorpi provenienti da fonti differenti seguendo questa procedura. Altre misure, come il rilevamento della concentrazione di ciascuna proteina mediante l'uso della stessa diapositiva a micromatrici, possono essere eseguite per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se l'alterazione della glicosilazione sia dovuta al cambiamento nei livelli di espressione proteica o esclusivamente all'alterazione della glicosilazione su ciascuna proteina individuale. Non dimenticare che lavorare con campioni di siero contenenti patogeni può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti protettivi devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi (Video) | JoVE Journal

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