Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Questo articolo video descrive una procedura per ottenere profili di glicosilazione di 20 diverse glicoproteine in un campione di siero di un paziente con carcinoma epatocellulare utilizzando un microarray di anticorpi chimicamente bloccato prima glicoproteina Gli anticorpi specifici vengono stampati direttamente su vetrini di microarray e i glicani anticorpali vengono bloccati per prevenire il legame delle lectine. Quando vengono applicati campioni di siero del paziente, le glicoproteine del campione vengono catturate dagli anticorpi. Le proteine leganti i glicani biotinilati vengono quindi aggiunte per rilevare i glicani e il neu travain coniugato per marcare le lectine biotinilate.

Il vetrino del microarray viene quindi scansionato per rilevare la fluorescenza, l'analisi dei dati risultanti rivela i profili di glicosilazione delle proteine del campione. Questa tecnica presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti come l'HPLC. Questo metodo consente di rilevare le singole glicoproteine nel loro stato nativo.

È più veloce e più facile eseguire lo screening dell'alterazione della glicosilazione per più proteine contemporaneamente. Bene, abbiamo scoperto che i biomarcatori della malattia, in particolare del cancro e del cancro al fegato, che abbiamo esaminato con la massima attenzione, sono spesso glicosilati. E la capacità di rilevare specifiche forme di glico che abbiamo trovato migliora notevolmente le prestazioni dei biomarcatori nella loro sensibilità e nella loro specificità.

Quindi questa misura può fornire informazioni sulle alterazioni della glicosilazione su più proteine sieriche nell'HCC. Può anche essere applicato allo studio della patologia e alla scoperta di biomarcatori in altri tumori e malattie come il cancro al pancreas, il diabete e il morbo di Alzheimer. A dimostrare la procedura sarà Chen Lu, un tecnico del mio laboratorio.

Inizia questo protocollo preparando prima il microarray di anticorpi in provette da microcentrifuga da 0,8 millilitri su ghiaccio diluire tutti gli anticorpi che verranno utilizzati per la stampa di microarray a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro in un minimo di 40 millilitri di PBS qui, 26 diversi anticorpi verranno utilizzati come controllo positivo. Preparare anche la stessa quantità di 0,5 milligrammi per millilitro di BSA biotinilato in PBS. Utilizzare un pipettatore per aliquotare 40 millilitri di ciascun anticorpo nella piastra sorgente a 384 pozzetti su ghiaccio.

Quindi, nel software di controllo del microarray, designare la posizione di ciascun anticorpo. Quindi, caricare la piastra sul microarray come sorgente. Quindi caricare 20 diapositive di microarray di percorso sul microarray come target.

Impostare il microarray per stampare 48 array di subar identici in cui 27 anticorpi e proteine di controllo sono individuati in triplicato in uno schema nove per nove. Avviare il microarray per stampare i vetrini del microarray di anticorpi. Raccogliere i vetrini del microarray di anticorpi e conservarli in una cassetta per vetrini con essiccante.

Sigillare la cassetta in un sacchetto di plastica per evitare la denaturazione delle proteine e l'umidità sui vetrini durante la conservazione. Conservare i vetrini sigillati per microarray a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. L'aspetto più difficile e importante di questa procedura è la fase di blocco chimico.

Per garantire il successo, è fondamentale che una quantità sufficiente di anticorpi sia stampata sulla luce del micro array. Preparare sempre l'IDE di sodio fresco e l'idrocita di agroacidi immediatamente prima dell'esperimento. E assicurati di eseguire la procedura di ossidazione a quattro gradi evitando la luce.

Estrarre i vetrini del microarray dal frigorifero ed equilibrarli a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere un vetrino dalla scatola di immagazzinaggio. Immergere brevemente il vetrino in una bacinella contenente PBS con lo 0,1% di interpolazione 20.

Quindi immergere il vetrino in un tampone di acetato di sodio da 15 millimolari con interpolazione allo 0,1% per 10 minuti. Quindi, preparare 150 millimolari di sodio per iodato fresco in 15 millimolari di tampone di acetato di sodio e trasferirlo in una bacinella di lavaggio a vetrino Conservare in frigorifero, evitando la luce fino all'uso. Rimuovere il vetrino dal tampone di acetato di sodio e inserirlo nella bacinella contenente puriato di sodio fresco con il lato dell'anticorpo rivolto verso l'alto.

Copri la bacinella con un foglio di alluminio per evitare la luce. Quindi posizionare la bacinella dello scivolo a quattro gradi Celsius agitando delicatamente per due ore. Rimuovere il vetrino dalla bacinella e sciacquarlo brevemente in tampone di acetato di sodio tre volte per cinque minuti.

Incubare il vetrino in 300 millilitri di soluzione bloccante dell'acido idroglutammico da 10 millimolari appena preparata in una camera di incubazione per due ore a temperatura ambiente con agitazione delicata. Rimuovere i vetrini dalla camera e lavarli con PBS allo 0,1% di interpolazione per tre minuti. Successivamente, in una bacinella di lavaggio dei vetrini, incubare il vetrino per microarray in 300 millilitri di 1%BSA in PBS con 0,5%tween per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente.

Sciacquare le diapositive in PBS con lo 0,1% di interpolazione tre volte per tre minuti. Mettere il vetrino su una griglia per vetrini e centrifugarlo a 1.200 volte G per due minuti per asciugare il vetrino del microarray. Per separare ogni array di subar, sul vetrino è impressa una griglia di cera.

Dopo aver preriscaldato l'imprinter per cera a 70 gradi Celsius per cinque minuti, caricare il vetrino del microarray bloccato nell'imprinter per cera con il lato dell'anticorpo rivolto verso la cera. Tirare delicatamente l'impugnatura per imprimere la cera in modo uniforme sul vetrino. Questo metodo può essere utilizzato per eseguire saggi di profilazione del glico per un singolo campione o per misurare un singolo epitopo di glico in più campioni.

Qui dimostreremo i saggi di profilazione del glico. Inizia diluendo 40 microlitri di siero in 360 microlitri di PBS contenenti lo 0,1% tra lo 0,1% e il ponte 35 e 100 microgrammi per millilitro, ciascuno di IgG di topo, ratto, coniglio, capra e asino. Questo volume è sufficiente per applicare sei microlitri di soluzione di siero diluito su ciascun sottoarray.

Applicare con cautela sei microlitri del campione diluito o del controllo su ciascun sottoarray del vetrino. Incubare il vetrino in una cassetta umidificata con carta assorbente bagnata a temperatura ambiente per un'ora. Sciacquare il vetrino con PBS con lo 0,1% di interpolazione tre volte per tre minuti.

Quindi asciugare il vetrino facendolo girare a 1200 volte G per due minuti. Preparare 20 microlitri di proteine leganti i glicani biotinilati a 10 milligrammi per millilitro in PBS tween in un tubo micro fuge da 0,8 millilitri su ghiaccio. Applicare sei microlitri di lectine biotinilate diluite su ciascun sottoarray del vetrino e incubare nella scatola dei vetrini umidificata con salviette di carta bagnate a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo aver risciacquato i vetrini con PBS allo 0,1% per tre volte come prima, asciugare il vetrino centrifugandolo a 1200 volte G in una centrifuga per due minuti. Preparare 400 microlitri da 10 milligrammi per millilitro DITE 5 49 etichettato neut travain in PBS 0,1% in un tubo micro fuge da 0,8 millilitri su ghiaccio. Utilizzare un pipettatore ripetuto per applicare sei microlitri di neut travain marcato DITE 5 49 su ciascun sottoarray e incubare il vetrino nella cassetta per vetrini umidificata a temperatura ambiente per un'ora dopo l'incubazione.

Sciacquare il vetrino con PBS 0,1% tween tre volte per tre minuti. Asciugare il vetrino facendolo girare a 1200 volte G in una centrifuga per due minuti. Scansiona il vetrino utilizzando uno scanner a fluorescenza per microarray con risoluzione di 10 millimetri.

Le impostazioni del laser e del PMT devono essere il più forti possibile, garantendo al contempo che non si osservi alcuna saturazione. Apri l'immagine nell'array Pro 3.2. Impostare il modello di matrice in base alla mappa dell'array che mostra le posizioni dei punti degli anticorpi.

Allinea attentamente ogni cerchio del modello sul punto corrispondente nell'immagine, estrai l'intensità di ogni punto in un file Excel per ulteriori analisi. Un micro array di anticorpi contenente 48 array di subar identici con 26 anticorpi contro 20 glicoproteine sieriche e biotina. BSA è stato progettato e realizzato come descritto in questo video per esaminare l'importanza della procedura di blocco.

Nell'analisi del profilo glicoproteico, sono stati generati due vetrini microarray identici. Uno non è stato bloccato chimicamente, mentre l'altro era un campione di controllo, è stato applicato su array di subar nelle colonne uno e tre e un campione di siero di HCC raggruppato è stato applicato sugli array di subar. Nelle colonne due e 4 22.

Le lectine biotinilate specifiche per diversi glicani sono state quindi applicate su ciascun sottoarray, come mostrato in queste immagini degli array di subar. Le lectine si legavano per catturare gli anticorpi nelle colonne di controllo, fornendo un elevato background che era indistinguibile dalle colonne caricate con siero nei microarray non bloccati. Tuttavia, quando lo stesso esperimento è stato eseguito su un vetrino di microarray di anticorpi chimicamente bloccato, non c'era alcun legame o c'era un legame molto basso per catturare gli anticorpi nelle colonne di controllo e un alto legame dell'antigene nelle colonne caricate con siero.

Questi risultati dimostrano che la procedura di blocco chimico è un passaggio critico per la misurazione dei glicani sulle glicoproteine catturate dagli anticorpi Seguendo il protocollo, è possibile ottenere profili di glicosilazione di 22 glicoproteine nel siero HCC Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in otto ore se eseguita correttamente. Gli anticorpi, se modificati, possono perdere le loro affinità per i loro antigeni e altre proprietà.

Quindi è importante tenerlo a mente e utilizzare diversi anticorpi in diverse fonti di anticorpi Seguendo questa procedura. Altre misure, come il rilevamento di ciascuna concentrazione proteica utilizzando lo stesso vetrino a raggi micro, possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se l'alterazione della glicosilazione è dovuta al cambiamento dei livelli di espressione proteica o esclusivamente all'alterazione della glicosilazione su ogni singola proteina. Non dimenticare che lavorare con campioni di siero contenenti agenti patogeni può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come guanti protettivi.