Saggio di immunofluorescenza: un metodo per identificare le cellule tumorali catturate su un filo medico

- Prendi un filo funzionalizzato con una piccola porzione d'oro rivestita con un idrogel accoppiato con anticorpi di interesse. Immergere la parte d'oro del filo in una fiala contenente cellule tumorali. Chiuderlo con un tappo a filo e incubarlo in un rotatore di tubi. Le cellule tumorali circolanti o CTC che mostrano antigeni di superficie si legano agli anticorpi sul filo. Sciacquare il filo immergendolo in fiale contenenti soluzione salina tamponata con fosfato o PBS e asciugare all'aria. Ora immergi il filo in una soluzione di acetone per fissare le cellule disidratandole.

Successivamente, inserire delicatamente il filo attraverso una punta P200 con la parte funzionalizzata al suo interno. Riempire il nastro con un anticorpo coniugato con un fluorocromo per immergere il filo. Questi anticorpi marcati si legheranno ai rispettivi antigeni presenti sulle cellule. Sigillare l'apertura con una pellicola da laboratorio e incubare per una notte al buio a 4 gradi Celsius. Quindi, lavare il filo con PBS per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Posizionare il filo in un portafilo e osservarlo al microscopio a fluorescenza. Le CTC legate dagli anticorpi emettono fluorescenza sul filo. Nel seguente protocollo, cattureremo le CTC su un filo medico e le identificheremo mediante colorazione immunofluorescente.

- Per iniziare l'esperimento, risospendere l'intero contenuto di un pallone T75 che si trova all'80% di confluenza in una fiala da 5 millilitri utilizzando 4 millilitri di terreno completo. Quindi, rimuovi il filo dalla sua confezione di vetro. Immergere la parte d'oro funzionalizzato del filo nella fiala assicurandosi che il tappo del filo sia a tenuta stagna per una fiala da 5 millilitri. Sigillare il filo con pellicola da laboratorio. Quindi incubare il filo in un rotatore di provette per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la rotazione, sciacquare il filo tre volte in una soluzione PBS utilizzando tre diverse fiale pulite e attendere che il filo si asciughi.

Dopo aver asciugato il filo all'aria per 10 minuti in una cappa, fissare le celle immergendo il filo in una soluzione di acetone al 100% in una provetta da 5 millilitri per 10 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che non ci sia traccia di acetone sulla punta funzionalizzata. Asciugare il filo all'aria per 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, in un tubo da 5 millilitri, lavare il filo due volte in una piega PBS. Incubare il filo in un tampone di diluizione dell'anticorpo.

Preparare 150 microlitri di miscela di anticorpi con una diluizione di anticorpo primario monoclonale coniugato con fluorocromo e tampone di diluizione dell'anticorpo come specificato nella scheda tecnica. Quindi utilizzare una punta P200 per estrarre il filo dal fermafilo e inserire delicatamente il filo attraverso il foro più grande della punta. Inserisci prima l'estremità non funzionalizzata e tira lentamente il filo attraverso il foro più piccolo fino a quando la parte dorata non si trova appena oltre il foro più grande. Aggiungere delicatamente 150 microlitri della miscela di anticorpi nella punta.

Per evitare il rischio di formazione di bolle, far roteare delicatamente il filo fino a quando l'estremità funzionalizzata non è completamente immersa. Sigillare il foro della punta e avvolgere la pellicola da laboratorio attorno al foro. Incubare il filo verticalmente per una notte al buio a 4 gradi Celsius. Il secondo giorno, bloccare l'incubazione degli anticorpi lavando il filo due volte in una sola piega PBS. Reinserire il filo nel suo fermafilo.