Isolamento funzionalizzato delle cellule bersaglio basate su fili: una tecnica ex vivo per isolare le cellule tumorali dal sangue periferico spiked

Le molecole di adesione delle cellule epiteliali, o EpCAM, sono glicoproteine transmembrana di superficie sovraespresse nelle cellule epiteliali a rapida proliferazione nei tumori della prostata. Per isolare le cellule che esprimono EpCAM, iniziare con un filo di grado medico con una punta rivestita d'oro funzionalizzato. La funzionalizzazione stratifica un gel polimerico contenente anticorpi specifici per EpCAM legati covalentemente.

Immergere il filo in una sospensione di sangue periferico contenente cellule tumorali marcate in modo fluorescente. Assicurarsi che la parte funzionalizzata rimanga immersa nella sospensione di sangue. Gli EpCAM sulle cellule tumorali riconoscono e si legano ai loro anticorpi specifici funzionalizzati sul filo.

Lavare con un tampone per rimuovere eventuali celle non legate dalla superficie del filo. Piegare il filo e montarlo su un vetrino contenente tampone, con la parte funzionalizzata immersa nel tampone. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per controllare la fluorescenza luminosa dal citoplasma cellulare e dai nuclei e confermare la presenza di cellule catturate sul filo.

Trattare il filo con un tampone di rilascio. Gli enzimi proteolitici nel tampone scindono il gel polimerico, rilasciando i complessi anticorpo-cellula tumorale nel tampone. Centrifugare il gruppo filo per raccogliere i complessi anticorpo-cellula rilasciati nel pellet. Rimuovere il filo e il surnatante contenente enzima. Risospendere il pellet contenente la cellula bersaglio in un mezzo adatto.

In 5 millilitri di sangue periferico, aggiungere circa 500-500.000 cellule e poi mescolare capovolgendo la provetta. Dopo aver rimosso il filo dal vano portaoggetti, rimuovere il tappo di gomma che trattiene il filo e lavare il filo in 1x soluzione salina tamponata con fosfato e montarlo nel tappo del tubo. Quindi, incubare la provetta su un miscelatore a rulli inclinati a 5 giri al minuto per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sciacquare tre volte il filo in una soluzione salina tamponata con fosfato. Quindi, conservare il filo in una provetta da 15 millilitri contenente 1x soluzione salina tamponata con fosfato al buio.

Disegna un'area rettangolare su un vetrino usando una penna grassa e aggiungi 500 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1x. Per immergere la parte funzionale del filo in 1x soluzione salina tamponata con fosfato, piegare la parte non funzionale del filo e posizionarla sul vetrino. Per contare il numero di celle catturate, ispezionare visivamente entrambi i lati del filo. Dopo l'ispezione, ritrasferire il filo nella provetta da 15 millilitri con 1 soluzione salina tamponata con fosfato e tenerlo al buio.

In 1 millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato, sciogliere 4 milligrammi del componente tampone di rilascio. Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri per ottenere il tampone pronto all'uso. Quindi, scaldare il tampone di rilascio a 37 gradi Celsius per 5 minuti. Una volta riscaldato, trasferire 1,6 millilitri di tampone di rilascio per riempire completamente una provetta di reazione da 1,5 millilitri. Quindi, incubare la parte funzionale del filo nel tampone di rilascio a 37 gradi Celsius a bagnomaria per 20 minuti.

Dopo l'incubazione, posizionare il filo su uno shaker a 500 rotazioni al minuto per 15 minuti. Quindi, centrifugare il filo a 300 x g per 10 minuti. Una volta terminata la centrifugazione, spostare il filo dalla provetta, chiudere il tappo e centrifugare nuovamente la provetta a 300 x g per 10 minuti.

• Epithelial Cell Adhesion Molecules (EpCAMs) – Overexpressed in rapidly proliferating cells in prostate cancers.
• Free Floating Cancer Cells – Malignant cells in blood that have detached from a primary tumor.
• Cytocentrifugation Method – A procedure used to concentrate cells from a fluid sample.
• Functionalization – Process of equipping the wire with EpCAM-specific antibodies.
• Mccoy's 5a Medium Modified – A commercially available solution for culturing human cells.

• The EpCAMs are surface transmembrane glycoproteins overexpressed in rapidly proliferating epithelial cells (e.g., prostate cancer).
• These molecules bind to specific antibodies bound to a functionalized wire in a fluid suspension (e.g., cytocentrifugation method).
• A washing step removes unattached cells, leaving only the target cells bound to the wire (e.g., free floating cancer cells).
• The immersing and release process allows for the focus on the captured cells on the wire, and their subsequent collection.

• What is an EpCAM and how does it relate to prostate cancer and the isolation process?
• How does cytocentrifugation assist in concentrating the target cells?
• How does the wire's functionalization and release process work in terms of capturing and collecting cells?

• Isolating EpCAM-expressing cells for study can lead to advancements in cancer research (e.g., free floating cancer cells).
• Techniques like cytocentrifugation have numerous applications in cell biology and medical diagnostics (e.g., cytocentrifugation method).
• The process provides greater insights into the nature and behavior of cancers cells, potentially leading to more effective treatments (e.g., EpCAMs).
• Focused studies of such nature often lead to significant scientific advancements in cancer research and treatment.