Name: Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Scopri il ruolo di gp96 nell'attivazione delle risposte T CD8 antigen-specifiche in Xenopus laevis. Questo metodo utilizza trasferimento adottivo di leucociti peritoneali e innesti cutanei per studiare la presentazione incrociata.

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La zootecnia esperto fornito da Tina Martin e David Albright è apprezzati. Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 dal NIH.

1. Animali X. laevis x X. Gilli ibridi LG-6 e LG-15 cloni isogenetic 1 sono dalla nostra colonia di riproduzione presso l'Università di Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 condividono lo stesso aplotipo MHC eterozigote (a / c) ma si differenziano a minori di istocompatibilità (H) loci. Progenie di questi cloni sono prodotti da gynogenesis, in cui le uova diploidi prodotte dalla femmina sono attivati ​​da UV-irradiati spermatozoi (nessun contributo del DNA per la progenie). L'uso di guanti è facoltativo. Alcune persone preferiscono non li indossano perché è più difficile da maneggiare le rane (scivoloso) e in effetti sembra di fare le rane a disagio. 2. Purificazione di gp96 da 15 / 0 tumorale (Tumor ed esprime sia minore H-Ags) Gp96 purificazione è stato descritto in precedenza 2, 3. In breve, gp96 è purificato dal frazionamento solfato di ammonio 50-70%, seguita da Ancona-sefarosio e DEAE cromatografia. Circa 20-50 mg di proteina possono essere ottenuti per 1 ml di tessuto tumorale. La purezza del preparato è determinata dalla SDS-PAGE e colorazione argento. 3. Elicitazione e Harvest di leucociti peritoneale (PL) dalla minore H-Ag-disparati LG-6 Rane <ol><li> Crescere un 25 mL notte E. Cultura Coli in un tubo da 50 ml conici a 37 ° C con agitazione. </li><li> Il calore giorno successivo uccidere i batteri da bollire per 1 ora. </li><li> Centrifugare il caldo ha ucciso E. Coli per 15 min a 2.000 giri (1.500 g) a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet batterico in 1 / 10 ° volume cultura originale (2,5 ml) in APBS. A questo punto la coltura batterica è pronto per l'uso e deve essere utilizzato entro 24 ore. </li><li> Iniettare intraperitoneale (ip) 200 (per una rana 2 pollici) o 300 ml (per una rana 3 pollici) del calore uccisi per la preparazione batterica rana con un calibro 25 5 / 8 ago. </li><li> Tre giorni dopo l'iniezione PL vengono raccolte a lavaggio intraperitoneale. </li><li> Prima della raccolta PL, rane adulte sono anestetizzati per immersione in una soluzione acquosa 0,1% di metano solfonato tricaine (TMS, MS-222) tamponato con bicarbonato di sodio per un massimo di 5 minuti fino a quando tutti i movimenti cessa (la durata dipende dalla dimensione ed età). Animali scia entro 10-20 minuti dopo il trattamento. </li><li> Disinfettare l'addome della rana con una piccola quantità di etanolo al 70%. </li><li> Iniettare 5 ml (per una rana 2 pollici) o 10 ml (per una rana 3 pollici) di APBS sterile pre-riscaldato a temperatura ambiente nella cavità peritoneale con una calibro 18 1 ½ ago. Rimuovere l'ago e massaggiare delicatamente la rana per un minuto per assicurarsi che il buffer iniettato in equilibrio con il liquido nella cavità del corpo. </li><li> Utilizzare un nuovo 18 gauge 1 ½ una siringa senza ago per raccogliere il liquido peritoneale, che a goccia dalla parte posteriore dell'ago in un ambiente pulito tubo da 50 ml. Assicurati di recuperare la maggior quantità di volume iniziale iniettato possibile. Stare attenti ad evitare i vasi sanguigni nella zona centrale della regione addominale. </li><li> Una volta PL vengono raccolte mettere la rana in un contenitore con acqua bassa fino a quando è sveglio a quel punto può essere rimesso nella sua gabbia. </li></ol> 4. Trasferimento pulsare e adottivi del Lg-6 Pls Into Naive Lg-6 Destinatari <ol><li> Lavare la PL volta con APBS freddo e centrifugare li a 1.000 giri (750 g) per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante e risospendere il PL in APBS. </li><li> Il polso del PL con gp96 ad una concentrazione di 1 mg gp96 per 5 x 10 5 PL. </li><li> Una volta che la quantità appropriata di gp96 viene aggiunto al PL, mescolarli pipeting e incubare in ghiaccio per 1 ora. </li><li> Centrifugare le cellule sia a 1000 rpm per 10 min a 4 ° C o a 14.000 rpm per 1 min di togliere qualunque legato gp96. </li><li> Lavare la PL 3X con APBS fredda per assicurare che non residuale gp96 sinistra. </li><li> Risospendere il PL pulsata ad una concentrazione di 5 x 10 5 PL per 300 ml. </li><li> Adoptively trasferimento PL mediante iniezione ip utilizzando calibro 25 5 / 8 ago. Iniettare 300 ul di PL pulsata (5 x 10 5 cellule) per animale. </li><li> Le rane dovranno essere innescato almeno 3 giorni prima di continuare con innesto di pelle o esperimenti sfida tumore. </li></ol> 5. Innesto della pelle Assay Il rigetto del trapianto della pelle è una realtà consolidata nel saggio Xenopus 4, 5, 6. In Xenopus, un destinatario rifiuta la pelle del donatore visualizzazione di 1 o 2 mismatch aplotipo MHC entro 18-22 giorni a 21-22 ° C. Al contrario, i trapianti di pelle tra LG e LG-6-15 cloni che differiscono solo per piccoli H-Ags vengono respinte più lentamente (più di 30 giorni). Tuttavia, questo rifiuto è accelerata nei pazienti that sono stati vaccinati contro il donatore minore H-Ags sia da un innesto di pelle precedente o tramite l'immunizzazione con gp96 purificata dal donatore. Nessun rifiuto a tutti si verifica quando il donatore e il ricevente sono geneticamente identici (ad esempio, gli animali clonati o completamente inbred). Pertanto, questa semplice tecnica è molto potente per la caratterizzazione in vivo risposte immunitarie provocato da gp96. <ol><li> Anestetizzare rana donatore, come descritto in 3.7. Nota: solo le precauzioni minime devono essere prese dal Xenopus produrre potente anti-microbico peptidi (ad esempio, magainin) nella pelle che elimina la necessità per un totale di procedure asettiche. Infatti, il trattamento della rana con qualsiasi disinfettante sarebbe dannoso per la pelle. Inoltre, Xenopus non hanno alcun agenti patogeni che possono essere trasferiti agli esseri umani. Pertanto, l'uso di guanti è facoltativo. Tuttavia, tutti gli strumenti di dissezione utilizzati devono essere sterilizzati in autoclave e tutte le soluzioni devono essere sterili. </li><li> Tagliare e rimuovere una piccola (20 mm x 5 mm) pezzo di pelle ventrale (cute addominale che sembra argentato per la presenza di irridophore cellule pigmentate) da un LG-15 rana donatore con le forbici. </li><li> Posizionare la pelle in un APBS Petridish contenimento e tenerlo in ghiaccio. Manipolare il tessuto della pelle molto delicatamente, evitare di tenere in tra le pinze. </li><li> Utilizzando un rasoio o le forbici tagliare i singoli innesti in 5 mm x 5 pezzi mm. Tenere i frammenti in APBS sul ghiaccio. </li><li> A questo punto la rana donatore viene inserito in un contenitore con acqua bassa fino a quando è sveglio e poi viene messo in acqua contenenti antibiotici (Penstrep a una concentrazione di 5 mg / L). La rana è tenuto in acqua con gli antibiotici per due giorni ea quel punto si ritorna in acqua normale. La piccola ferita nel sito in cui è stata rimossa la pelle non ha bisogno di essere cucite e guarisce entro una settimana. </li><li> Anestetizzare l'LG-6 destinatario rana. </li><li> Fai una piccola incisione sulla dorsale (posteriore) della pelle del destinatario e inserire il 5 mm x 5 innesto mm sotto la pelle con la parte argentea alto. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria di grandi dimensioni sotto la pelle perché può portare allo spostamento o addirittura la perdita del trapianto. </li><li> Assicurati di notare le marcature forbici e pinze sul innesti, perché quelli non sono conteggiati come rigetto una volta che il punteggio comincia. </li><li> 24 ore più tardi una parte della pelle ospitare sovrapposizione deve essere rimosso dal trapianto. </li><li> Anestetizzare l'LG-6 destinatario rana. Gestire l'animale, come descritto al punto 5.1. </li><li> Utilizzando le forbici autoclave ritagliare una finestra intorno al trapianto in modo che l'innesto può essere liberamente visualizzati. Fare attenzione a non toccare la pelle del donatore o di indurre emorragie. Lasciate che la rana di recuperare, come descritto in 5.5. </li><li> Avviare segnando l'innesto subito facendo uno schizzo. Il rigetto del trapianto cutaneo è determinato dalla percentuale di distruzione del irridophores sulla pelle innestata. </li><li> Gli innesti devono essere controllati ogni 2-3 giorni, ma gli animali non hanno bisogno di essere anestetizzati per questo. Per visualizzare gli innesti, le rane devono essere collocati in un petridish sotto un microscopio da dissezione. </li></ol> 6. Tutto-mount Immunohistology di pelle trapiantato Rana con tutto il montaggio immunohistology è stato descritto in precedenza 6. In breve, la rana è anestetizzato e posto sotto il microscopio su un tovagliolo di carta sterile pre-bagnato con acqua rana (l'area di lavoro è anche asetticamente preparato). La pelle viene poi trapiantato raccolte insieme ad una piccola quantità di cute circostante ospite e si è macchiato con anticorpi in modo simile a colorazione delle cellule per l'analisi di citometria a flusso 6. Strumenti in autoclave e tamponi sterili devono essere utilizzati. Dopo la colorazione della pelle è posto su un vetrino da microscopio e delicatamente pressato con una scivolata di copertura. A questo punto la pelle può essere visualizzato usando un microscopio a fluorescenza per diverse popolazioni cellulari che hanno infiltrato l'innesto. Al termine della procedura la rana è tenuto in acqua con gli antibiotici come descritto nella sezione 5.5. ed è tornato in acqua normale. La piccola ferita sinistra dove la pelle è stato rimosso guarisce entro una settimana. 7. Caratterizzazione dei leucociti del sangue <ol><li> Prima di togliere il sangue dalla rana, si ha la necessità di preparare "aghi di vetro" tirando sterile pipette Pasteur a fuoco. L'estremità sottile della pipetta è acuito con lo stereomicroscopio. La pipetta viene poi collegato ad un tubo di plastica aspirazione. Tutti gli strumenti come le pinze e le forbici devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso. </li><li> Anche preparare ghiacciata 10 ml di soluzione di eparina APBS e con l'aggiunta di 50 unità di eparina per 1 ml di APBS. Tenere la soluzione su ghiaccio. Tutte le soluzioni utilizzate devono essere sterili. </li><li> Anestetizzare rana come descritto in 3.7, e seguire le stesse procedure di trattamento degli animali, come descritto al punto 5.1. . </li><li> Tagliare la pelle sopra il piede posteriore per esporrela vena dorsale tarso. </li><li> Riempire la pipetta Pasteur con 1-2 mL di soluzione APBS + eparina. </li><li> Inserire la "ago di vetro" nella vena e iniziare a raccogliere il sangue lentamente aspirando con la bocca. E 'importante avere APBS soluzione di eparina + nel "ago di vetro" in quanto questo impedisce la coagulazione del sangue e intasamento sulla punta dell'ago. </li><li> 1 a 2 ml di sangue può essere ottenuto da una rana di medie dimensioni. </li><li> La piccola incisione sulla gamba della rana non ha bisogno di essere cucito e la ferita guarisce entro una settimana. </li><li> Centrifugare il sangue a 1.000 rpm per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante e lavare le cellule 1X con 10 ml di APBS freddo. </li><li> Sovrapposizione 2 ml di sangue (1-5 x 10 6 celle) su 1 ml di Ficoll HISTOPAQUE 1,077 (Sigma), pre-riscaldato a temperatura ambiente al fine di separare i leucociti del sangue dai globuli rossi. </li><li> Centrifugare 20 min a 1.000 giri al minuto a temperatura ambiente, senza freno, e raccogliere quindi la banda dei leucociti. </li><li> Lavare le cellule 2X con APBS per centrifugazione a 1.400 rpm per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i residui di Ficoll. </li><li> A questo punto le cellule sono pronte per essere colorate con anticorpi per l'analisi di citometria a flusso, o da utilizzare per il test in coltura in vitro. </li></ol> 8. Tumore Trapianto di analisi <ol><li> Circa una settimana prima del disgelo esperimento in un lotto fresco di cellule 15 / 0 tumore e fare in modo che le cellule iniziano a crescere bene. Terreno di coltura è succintamente descritto nella sezione successiva e più in dettaglio in 3. </li><li> Espandere il 15 / 0 cellule tumorali. </li><li> Il giorno dell'esperimento, contare le cellule e determina morte cellulare per esclusione tripan blu. La morte cellulare deve essere inferiore al 5%. Lavare le cellule 1X a APBS freddo, e centrifugare a 1.000 rpm a 4 ° C per 10 min. </li><li> Risospendere le cellule in terreno di coltura del tumore ad una densità di 5 x 10 5 15 / 0 cellule per 300 ml. </li><li> Trapianto di 5 x 10 5 cellule in 300 microlitri di volume per rana per iniezione sottocutanea con un calibro 25 5 / 8 ago su un lato della dorsale (posteriore) lato dell'animale. </li><li> La crescita del tumore avrà inizio entro 2-3 settimane dopo la sfida del tumore. La comparsa del tumore iniziale deve essere notato e il volume del tumore deve essere registrato ogni 2-3 giorni. Volume del tumore (altezza x larghezza x lunghezza) è misurata con le pinze. </li><li> Una volta che il tumore cresce a 3.500 mm 3 o la rana inizia a guardare letargico, ha bisogno di essere l'eutanasia per evitare disagi. </li></ol> 9. Reagenti necessari: <ul><li> Anfibio soluzione tampone fosfato (APBS): 6,6 g / L di NaCl, 1,15 g / L di Na 2 HPO 4, 0,2 g / l KH 2 PO. il pH a 7,5 con NaOH 10N e filtro sterilizzato attraverso filtro 0,2 micron. </li><li> Tricaine solfonato metano (TMS, MS-222) (Crescent ricerca CAS # 886-86-2 sostanze chimiche). </li><li> Bicarbonato di sodio (Fisher Scientific S-233-500). </li><li> HISTOPAQUE-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 ml) </li><li> Eparina sale di sodio (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Terreno di coltura per Xenopus 15 / 0 tumori [vedi 3 per ulteriori dettagli]: 1 l di media basale Iscove DMEM (Invitrogen Gibco-11965) con 10 Insulina ml, 10 ml aminoacidi non essenziali, 10 mL di penicillina-streptomicina; 10 mcg / ml di kanamicina, 3 mL di primatone (Sheffield Products Division), 1 ml di β2-mercaptoetanolo, e 3,02 g di NaHCO 3 in acqua (pH 7,0). Questo mezzo è diluito a osmolarità anfibi con l'aggiunta di 30% di acqua bidistillata ed integrata con 5% di siero fetale bovino, il 20% superantant da una A6 linea di Xenopus cellule renali, e lo 0,25% del normale Xenopus siero. </li></ul> 10. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Analisi stereomicroscopio di rigetto del trapianto cutaneo 12 giorni dopo il trapianto. LG-6 rana clonato ricevuto un trapianto di pelle da entrambi (A) un MHC-identico LG-6 (non mostra alcun rifiuto) o (B) un MHC-disparati donatori consanguinei (80% rifiuto). Le frecce indicano le cellule pigmentate iridophore argenteo marcatura sani (non respinte) del tessuto innestato. (*) Mark of non forcipe a causa di rifiuto. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Gp96 facilita la cross-presentazione di antigeni tumorali in Xenopus. LG PL-15 (5 x 10 5) sono stati pulsata per 1 ora su ghiaccio sia con APBS (controllo negativo), 1 mg di gp96 ricombinante purificata da E. Mcg cultura Coli, o 1 o 0,5 di gp96 purificata da 15 / 0 tessuto tumorale. Dopo 3 lavaggi, le cellule sono state trasferite in adoptively LG-15 pazienti adulti (1 x 10 6 / individuale). Tre giorni dopo, dal vivo 15 / 0 cellule tumorali (5 x 10 5) sono statitrapiantati per iniezione sottocutanea. Ogni curva rappresenta la cinetica della crescita tumorale in una rana. Giorni dopo sfida, quando i tumori sono stati monitorati prima apparizione, e la dimensione del tumore è stata determinata periodicamente con un (lunghezza x larghezza x spessore) pinza.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;anfibio Xenopus è un unico versatile non mammiferi modello per studiare l&#39;immunità. Il suo largo uso nella ricerca biomedica e immunologico ha prodotto in molti strumenti di ricerca importanti come i cloni MHC definito LG-6 e LG-15 così come diverse linee cellulari e anticorpi monoclonali. L&#39;utilizzo di questi strumenti che abbiamo stabilito diversi in vitro e in vivo per studiare la capacità delle proteine ​​heat shock come gp96 di mediare potente Ag-specifici anti-minori H-Ag e...

<table><tbody><tr><td>&lt;forte&gt;Reagenti necessari:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato per anfibi (APBS): </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 1,15 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,2 g/L </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH 10 N </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metanosolfonato (TMS, MS-222) </td><td>Crescent Research Chemicals</td><td>CAS#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio </td><td>Fisher Scientific</td><td>S-233-500</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Sale sodico di eparina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di coltura per tumori Xenopus 15/0 [vedi 3 per maggiori dettagli]:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo basale Iscove DMEM</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primatone</td><td>Divisione Prodotti Sheffield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;2-mercaptoetanolo&amp;#8211;etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% acqua doppia distillata </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% di siero fetale bovino</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% di supernatante da una linea cellulare renale di Xenopus A6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% di siero normale di Xenopus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;forte&gt;Materiali e attrezzature:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici sterili per centrifuga da 50 e 15 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aghi sterili Precision Glide da 25 gauge, 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 gauge 1&amp;frac12; Aghi sterili Precision Glide</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile da 1 ml con ago fisso per tubercolina</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile da 10 ml con estremità liscia</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi microcentrifuga da 1,5 ml (sterili)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatti di Petri in polistirene 60 x 15 mm sterili</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame da rasoio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini microscopici premium 25 X 75 mm X 1 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pietre di Petri in vetro da 10 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; Pipette Pasteur in vetro borosilicato Durex, monouso, con tappo di cotone</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubazione Tygon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Due pinzette di tipo 5 svizzere&amp;rsquo;s Pinze</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione microchirurgiche McPherson-Vannas con bordo tagliente dritto, 6 mm</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>calibri Helios </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore ad alta intensità</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Un-bunsen burner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;incubatore con agitazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comparativo in vivo studio di gp96 adjuvanticity nella rana xenopus laevis</em

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

Abbiamo sviluppato negli anfibi Xenopus laevis un unico non-mammiferi modello per studiare la capacità di alcune proteine ​​da shock termico (HSP) come gp96 per facilitare la cross-presentazione di antigeni sorvegliati e suscitano innata e adattiva le risposte delle cellule T. Rigetto del trapianto pelle Xenopus fornisce una piattaforma eccellente per studiare la capacità di gp96 per suscitare classica MHC di classe Ia (classe Ia) limitato le risposte delle cellule T. Inoltre, il sistema Xenopus modello fornisce anche una valida alternativa al mouse per esplorare la capacità di gp96 di generare risposte contro i tumori che hanno down-regolato loro molecole di classe Ia fine di eludere la sorveglianza immunitaria. Recentemente, abbiamo sviluppato un saggio di trasferimento adottivo di cellule di cloni Xenopus utilizzando leucociti peritoneali come cellule presentanti l&#39;antigene (APC), e dimostrato che la gp96 possibile preparare le risposte delle cellule T CD8 in vivo contro gli antigeni di istocompatibilità minori della pelle così come contro il tumore del timo Xenopus 15 / 0 che non esprime molecole di Ia classe. Descriviamo qui la metodologia coinvolti per eseguire questi test tra cui il trasferimento elicitazione, pulsante e adottivi dei leucociti peritoneali, così come l&#39;innesto di pelle e saggi di trapianto di tumore. Inoltre siamo anche descrivendo la raccolta e la separazione dei leucociti del sangue periferico utilizzato per la citometria a flusso e saggi di proliferazione che consentono un&#39;ulteriore caratterizzazione delle popolazioni effettrici coinvolte nel rifiuto della pelle e anti-tumore risposte.

La rana<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Offre una interessante alternativa non-mammiferi modello per esplorare la possibilità di proteine ​​da shock termico come gp96 per promuovere antigene-specifiche risposte delle cellule T CD8. Vi presentiamo i metodi per lo studio<em&gt; In vivo</emFacilitazione&gt; di cross-presentazione di antigeni tumorali della pelle e da gp96.

Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis</em

Abbiamo sviluppato nell'anfibio Xenopus laevis un modello unico non mammifero per studiare la capacità di determinate proteine da shock termico (hsps), come la gp96, di...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la conservazione evolutiva della proteina da shock termico G 96 nel promuovere risposte delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene nella rana Xenopus laevis. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo i leucociti peritoneali mediante lavaggio peritoneale. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trattare i leucociti peritoneali con GP 96 derivata da tumore, che accompagna antigeni minori e tumorali, dopo incubazione e lavaggi.I leucociti peritoneali vengono trasferiti in modo adottivo mediante iniezione intraperitoneale in rane naive al fine di sensibilizzare queste rane nei confronti di antigeni tumorali o di istocompatibilità minore. Il terzo passaggio della procedura consiste nel trapiantare un lembo di cute o nel sottoporre le rane sensibilizzate a una sfida tumorale, monitorando l'insorgenza del rigetto del trapianto di cute o la comparsa del tumore. L'ultimo passaggio della procedura prevede il prelievo di sangue periferico per caratterizzare le cellule T coinvolte nelle risposte di rigetto cutaneo e antitumorali.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un significativo acceleramento del rigetto del trapianto cutaneo, nonché ritardi nell'insorgenza del tumore in rane sensibilizzate alla GP 96, rispettivamente tramite i saggi di trapianto cutaneo e di sfida tumorale. Ciao, sono Christina Koska nel laboratorio del Dott. Jacque Robert del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia presso il University of Rochester Medical Center. Sono anche Tanya Cruz, del laboratorio del Dott. River.Oggi vi mostreremo un procedimento per sensibilizzare rane clonate mediante trasferimento adottivo di leucociti peritoneali, seguito da trapianto di innesti cutanei e saggi di trapianto tumorale. Inoltre, vi mostreremo anche come prelevare sangue periferico da questi animali. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la capacità della proteina da calore GP96 di promuovere cellule CDAT specifiche per l'antigene in Salla, nonché per analizzare i tipi cellulari coinvolti.Ok, iniziamo. Le rane utilizzate nei nostri esperimenti sono cloni genetici ISO provenienti dalla nostra colonia di allevamento presso l'Università di Rochester. Per indurre i leucociti peritoneali, o PL, da raccogliere, utilizzare un ago da 25 gauge cinque ottavi per iniettare per via intraperitoneale nella rana anestetizzata una preparazione di e. coli uccisa termicamente. Tre giorni dopo l'iniezione, i PL vengono raccolti mediante lavaggio intraperitoneale.Per iniziare questa procedura, disinfettare l'addome della rana anestetizzata con una piccola quantità di etanolo al 70%. Quindi utilizzare un ago da 18 gauge lungo 1,5 pollici per iniettare cinque millilitri di soluzione salina fosfato sterile tampone per anfibi, o PBS preriscaldata a temperatura ambiente, nella cavità peritoneale. Rimuovere l'ago e massaggiare delicatamente la rana per un minuto per assicurare che il tampone iniettato si mescoli uniformemente con il liquido presente nella cavità corporea.Successivamente, inserire un nuovo ago da 18 gauge lungo 1,5 senza siringa nell'addome della rana. Evitando i vasi sanguigni, raccogliere il liquido peritoneale che gocciola dalla parte posteriore dell'ago in un tubo conico pulito da 50 millilitri. Assicurarsi di recuperare la maggior quantità possibile del volume iniziale iniettato dopo che i PL sono stati raccolti.Mettere la rana in un contenitore con acqua poco profonda fino a quando non si sveglia, momento in cui può essere rimessa nella sua gabbia. Una volta raccolti i pls, centrifugare a 1000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il sopranatante e risospendere i pls in PBS A freddo.Trasferire il PLS RISOSPESO in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per impulsi di PLS con GP 96, aggiungere la quantità appropriata di GP 96 al PLS e mescolare mediante pipettaggio; incubare sul ghiaccio per un'ora dopo un'ora.Centrifugare le cellule a 14.000 giri al minuto per un minuto. Per rimuovere qualsiasi GP 96 non legata, eliminare il soprannatante. Aggiungere PBS A freddo e risospendere.Sospendere nuovamente il PLS in centrifuga. Lavare il S con A-P-B-S-A freddo per un totale di tre volte per assicurarsi che non rimanga traccia di G 96 dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere il PLS pulsato a una concentrazione di cinque volte 10 alla cinque PLS per 300 microlitri di PBS per trasferire in modo adottivo i PLS in sei recettori naive LG.Iniettare per via intraperitoneale 300 microlitri di pls attivato per animale. Le rane devono essere sensibilizzate almeno tre giorni prima degli esperimenti di innesto cutaneo o di sfida con tumori, che verranno mostrati successivamente. La pelle per l'innesto viene prelevata da una rana donatrice LG 15 anestetizzata.Utilizzare le forbici per tagliare e rimuovere un piccolo pezzo di pelle ventrale, ovvero la pelle addominale che appare argentata. A causa della presenza di quattro cellule pigmentate ARI durante la manipolazione dell'innesto, è fondamentale ridurre al minimo la manipolazione del tessuto, poiché ciò potrebbe causare danni all'innesto.Tenere delicatamente la pelle con la pinzetta e posizionarla in una piastra di Petri contenente PBS A freddo. Mantenere la piastra di Petri in posizione. Posizionare la pelle su un vetrino pulito e utilizzare un rasoio per tagliare innesti singoli in pezzi di cinque millimetri per cinque millimetri.Mantenere i frammenti in PBS su ghiaccio per innestare la pelle su sei rane riceventi. Innanzitutto, praticare una piccola incisione sulla pelle dorsale della rana ricevente anestetizzata. Successivamente, inserire l'innesto di cinque millimetri per cinque millimetri sotto la pelle con il lato argentato rivolto verso l'alto.Assicurarsi di notare i segni di forbici e pinzette sui trapianti, poiché questi non vengono considerati rigetto del trapianto. Una volta iniziato il punteggio dopo 24 ore, è necessario rimuovere una parte della pelle dell'ospite sovrastante dal trapianto. Utilizzare le forbici per ritagliare una finestra intorno al trapianto in modo che quest'ultimo possa essere visualizzato liberamente.Attenzione a non toccare la pelle del donatore né a provocare sanguinamento. Iniziare immediatamente a eseguire il punteggio dell'innesto effettuando un disegno. Innesto cutaneo.Il rigetto è determinato dalla percentuale di distruzione dell'aridolo sulla cute innestata. L'innesto deve essere controllato ogni due o tre giorni al microscopio stereoscopico. Preparare le cellule tumorali per il trapianto mediante risospensione in mezzo di coltura tumorale a una densità di cinque volte 10 alla cinque cellule per 300 microlitri.Trapiantare le cellule mediante iniezione sottocutanea su un lato della parte dorsale dell'animale. Vengono iniettate cinque volte 10 alla cinque cellule in un volume di 300 microlitri per ogni rana. La crescita del tumore inizierà entro due o tre settimane dal trapianto del tumore.Osservare l'aspetto iniziale del tumore. Utilizzare un calibro per misurare le dimensioni del tumore e registrarne il volume ogni due o tre giorni prima del prelievo di leucociti sanguigni dalla rana. Preparare aghi di vetro tirando pasta di pipette su una fiamma.Dopo aver affilato l'estremit&agrave; sottile della pipetta sotto il microscopio stereoscopico, collegare la pipetta a un tubo di aspirazione in plastica. Per iniziare il prelievo di sangue, tagliare la pelle sopra la parte posteriore della zampa della rana anestetizzata per esporre la vena tarsale dorsale. Riempire l'ago di vetro con uno o due millilitri di soluzione di PBS A freddo ghiacciato pi&ugrave; eparina.Quindi inserire l'ago di vetro nella vena e iniziare a raccogliere il sangue aspirando lentamente con la bocca. Da un singolo esemplare di rana di dimensioni medie è possibile ottenere da uno a due millilitri di sangue. La piccola incisione sulla gamba della rana non necessita di punti di sutura.La ferita guarirà entro una settimana. Qui sono mostrati i risultati di un'analisi al microscopio stereoscopico del rigetto del trapianto cutaneo a 12 giorni dal trapianto. Una rana LG six clonata che ha ricevuto un innesto cutaneo da un donatore LG six identico per MHC non ha mostrato alcun rigetto.L'asterisco indica la pinzetta del marcatore non dovuta al rigetto. Al contrario, una rana LG6 clonata che ha ricevuto un innesto cutaneo da un donatore allogenico con MHC differente mostra un rigetto dell'80%. In entrambe le immagini, le frecce indicano cellule pigmentate iridee argentate che contrassegnano tessuto innestato sano e non rigettato.Nel prossimo esperimento, LG 15 pls sono stati stimolati con un PBS come controllo negativo, con GP 96 ricombinante purificato da una coltura di e coli o con GP 96 purificato da cellule di tessuto tumorale 15 zero. Successivamente, sono stati trasferiti in modo adottivo in riceventi adulti LG 15 e, tre giorni dopo, cellule tumorali 15 zero vive sono state trapiantate mediante iniezione sottocutanea. I tumori comparsi nei giorni successivi alla sfida sono stati monitorati e la dimensione tumorale è stata misurata periodicamente. In questi grafici, ogni curva rappresenta la cinetica della crescita tumorale in una rana. I risultati mostrano che gli animali sensibilizzati con 0,5 o con un microgrammo di GP 96 hanno presentato un ritardo significativo nell'insorgenza del tumore rispetto ai gruppi di controllo. Pertanto, GP 96 facilita la presentazione incrociata degli antigeni tumorali in xenopus.Abbiamo appena illustrato come esplorare la capacità della GP96 di presentare sia antigeni minori sia antigeni tumorali nella rana Xenopus laevis mediante saggi di trapianto cutaneo e di trapianto tumorale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di evitare il prelievo del lavaggio peritoneale se un vaso sanguigno è stato danneggiato, poiché la maggior parte delle cellule presenti sono eritrociti e non macrofagi. È inoltre fondamentale evitare di schiacciare il tessuto con la pinzetta durante la manipolazione del trapianto cutaneo, per prevenire danni.Ecco fatto. Grazie per aver eseguito il lavaggio e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra il punteggio di induzione e clinica di un modello animale di sclerosi multipla: cronico-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale nei ratti DA. La malattia, indotta da immunizzando topi con una emulsione che contiene tutto midollo spinale di ratto e adiuvante completo di Freund, presenta segni clinici simile alla malattia umana.

Induzione e punteggio clinico dell&#39;epatite cronica-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale

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Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Questo video dimostra un'efficiente tecnica di omogeneizzazione per generare un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in un modello murino. L'emulsione contiene un autoantigene - la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) - in fase acquosa, circondata da una fase oleosa continua comprendente un batterio patogeno inattivato. L'emulsione garantisce un rilascio prolungato di antigeni per una risposta immunitaria prolungata.

Preparazione di un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune

Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione1 F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.

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Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

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Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Il protocollo presenta metodi dettagliati per valutare se l'adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D promuove risposte immunitarie cellulari efficaci.

In vitro Valutazione dell'attività cellulare del vaccino adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D

Per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un'emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell'emulsione.

Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Presentato qui è un efficace protocollo di perfusione sanguigna rapida per preparare campioni di tessuto da rane artigliate africane per studi di trascrittomica e proteomica.

Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus

Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

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Scopri il ruolo di gp96 nell'attivazione delle risposte T CD8 antigen-specifiche in Xenopus laevis. Questo metodo utilizza trasferimento adottivo di leucociti peritoneali e innesti cutanei per studiare la presentazione incrociata.

Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis

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