Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la capacità di conservazione evolutiva della proteina da shock termico G 96 nel promuovere le risposte antigene-specifiche delle cellule T CD 8 nei manicotti di xenopus della rana. Ciò si ottiene prelevando prima i leucociti peritoneali mediante lavaggio peritoneale. Il secondo passo della procedura consiste nel pulsare i leucociti peritoneali con GP 96 derivato dal tumore che accompagna gli antigeni minori e tumorali dopo l'incubazione e i lavaggi.

I leucociti peritoneali vengono trasferiti adottivamente mediante iniezione intraperitoneale in rane naive al fine di innescare queste rane contro antigeni tumorali o minori di istocompatibilità. La terza fase della procedura consiste nell'innesto cutaneo o nella sfida del tumore alle rane innescate e nel monitorare l'insorgenza dell'innesto cutaneo, il rigetto o la comparsa del tumore. La fase finale della procedura consiste nell'ottenere sangue periferico per caratterizzare le cellule T coinvolte nel rigetto cutaneo e nelle risposte antitumorali.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una significativa accelerazione del rigetto dell'innesto cutaneo, nonché ritardi nella comparsa del tumore nelle rane innescate con GP 96 rispettivamente attraverso l'innesto cutaneo e i test di provocazione del tumore. Ciao, sono Christina Koska nel laboratorio del Dr.Jacque Robert nel Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università di Rochester Medical Center. Sono Tanya Cruz, anche lei del laboratorio del Dr.River.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'innesco di rane clone mediante trasferimento adottivo di leucociti peritoneali, seguita da innesti cutanei e saggi di trapianto tumorale. Inoltre, ti mostreremo anche come ottenere il sangue periferico da questi animali. Utilizziamo questa procedura nel nostro torio per studiare la capacità di riscaldare la proteina GP 96 di promuovere le cellule CDAT antigene specifiche in Salla e di studiare i tipi di cellule coinvolte.

Ok, allora iniziamo. Le rane utilizzate nei nostri esperimenti sono cloni genetici ISO provenienti dalla nostra colonia riproduttiva presso l'Università di Rochester. Per suscitare leucociti peritoneali o pls per il prelievo, utilizzare un ago da 25 gauge cinque otto per iniettare la rana anestetizzata intraperitoneale con una preparazione di e coli uccisa dal calore Tre giorni dopo l'iniezione, i pls vengono raccolti mediante lavaggio intraperitoneale.

Per iniziare questa procedura, disinfettare l'addome della rana anestetizzata con una piccola quantità di etanolo al 70%. Quindi utilizzare un ago calibro 18 da 1,5 per iniettare cinque millilitri di soluzione fisiologica tamponata con fosfato di anfibio sterile, o un PBS prebellico a temperatura ambiente nella cavità peritoneale. Rimuovere l'ago e massaggiare delicatamente il nasetto per un minuto per assicurarsi che il tampone iniettato sia uguale al liquido nella cavità corporea.

Successivamente, inserire un nuovo ago calibro 18 1,5 senza siringa nell'addome della rana. Evitando i vasi sanguigni, raccogliere il liquido peritoneale che gocciolerà dalla parte posteriore dell'ago in un tubo conico pulito da 50 millilitri. Assicurati di recuperare il più possibile il volume iniziale iniettato dopo che i pls sono stati raccolti.

Metti la rana in un contenitore con acqua bassa fino a quando non è sveglia, a quel punto può essere riposta nella sua gabbia. Una volta raccolti i pls, centrifugare a 1000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il sup, il natante e risus. Sospendere il pls in freddo A PBS.

Trasferire il RESUSPENDED pls in un tubo di micro rifiuti da 1,5 millilitri. Per pulsare il PLS con GP 96. Aggiungere la quantità appropriata di GP 96 al pls e mescolare pipettando, incubare su ghiaccio per un'ora dopo un'ora.

Centrifugare le celle a 14.000 giri/min per un minuto. Per rimuovere il GP 96 non legato, rimuovere il surnatante. Aggiungere A PBS freddo e risucchiare.

Sospendere nuovamente la centrifuga PLS. Lavare la S con A-P-B-S-A fredda per un totale di tre volte per assicurarsi che non rimangano residui di G 96 dopo il lavaggio finale. Resus sospendere il pls pulsato a una concentrazione di cinque volte 10 a cinque pls per 300 microlitri di un PBS per trasferire adottivamente pls in sei riceventi LG ingenui.

Iniettare intraperitoneale 300 microlitri di pls pulsato per animale. Le rane devono essere innescate almeno tre giorni prima dell'innesto cutaneo o degli esperimenti di provocazione del tumore, che verranno mostrati in seguito. La pelle per l'innesto è ottenuta da una rana donatrice LG 15 anestetizzata.

Usa le forbici per tagliare e rimuovere un piccolo pezzo di pelle ventrale, che è la pelle addominale che appare argentea. A causa della presenza di ARI quattro cellule pigmentate durante la manipolazione dell'innesto. È fondamentale avere la minor manipolazione possibile del tessuto poiché ciò causerà danni all'innesto.

Tenere la pelle molto delicatamente con la pinza e metterla in una capsula di Petri contenente A PBS freddo. Tenere accesa la capsula di Petri. Posizionare la pelle su un vetrino fresco e utilizzare un rasoio per tagliare i singoli innesti in pezzi di cinque millimetri per cinque millimetri.

Conserva i frammenti in un PBS sul ghiaccio per innestare la pelle sulla rana ricevente LG six. Innanzitutto, praticare una piccola incisione sulla pelle dorsale del ricevente anestetizzato. Quindi inserire l'innesto di cinque millimetri per cinque millimetri sotto la pelle con il lato argentato rivolto verso l'alto.

Assicurati di annotare i segni delle forbici e delle pinze sugli innesti perché non vengono conteggiati come rigetto dell'innesto. Una volta che il punteggio inizia 24 ore dopo, una parte della pelle dell'ospite sovrapposto deve essere rimossa dall'innesto. Usa le forbici per ritagliare una finestra attorno all'innesto in modo che l'innesto possa essere visualizzato liberamente.

Fare attenzione a non toccare la pelle del donatore o a non indurre sanguinamento. Inizia subito a segnare l'innesto facendo uno schizzo. Innesto cutaneo.

Il rigetto è determinato dalla percentuale di distruzione dell'aridolo sulla pelle innestata. L'innesto deve essere controllato ogni due o tre giorni sotto lo stereomicroscopio. Preparare le cellule tumorali per il trapianto mediante resus, sospendendole in terreno di coltura tumorale a una densità di cinque volte 10 a cinque cellule per 300 microlitri.

Trapiantare le cellule mediante iniezione sottocutanea su un lato del lato dorsale dell'animale. Cinque volte 10 su cinque cellule in un volume di 300 microlitri viene iniettato per rana. La crescita del tumore inizierà entro due o tre settimane dopo la provocazione del tumore.

Si noti l'aspetto iniziale del tumore. Usa i calibri per misurare le dimensioni del tumore e registrare il suo volume ogni due o tre giorni prima della raccolta dei leucociti del sangue dalla rana. Preparare gli aghi di vetro tirando le pappe di pasta sul fuoco.

Dopo aver affilato l'estremità sottile della pipetta sotto lo stereomicroscopio, collegare la pipetta a un tubo di plastica di aspirazione. Per iniziare la raccolta del sangue, tagliare la pelle sopra il piede posteriore della rana anestetizzata per esporre la vena tarsale dorsale. Riempi l'ago di vetro con uno o due millilitri di soluzione ghiacciata di A PBS più eparina.

Quindi inserire l'ago di vetro nella vena e iniziare a raccogliere il sangue aspirando lentamente con la bocca. Da uno a due millilitri di sangue possono essere ottenuti da una rana di medie dimensioni. La piccola incisione sulla zampa del rana non ha bisogno di essere cucita.

La ferita guarirà entro una settimana. Di seguito sono riportati i risultati di un'analisi stereomicroscopica del rigetto del trapianto cutaneo 12 giorni dopo il trapianto. Una rana clonata LG six che ha ricevuto un trapianto di pelle da un donatore MHC identico a LG six non ha mostrato rigetto.

L'asterisco indica che la pinza marcatore non è dovuta a rigetto. Al contrario, una rana LG sei clonata che ha ricevuto un trapianto di pelle da un donatore eterogeneo MHC mostra un rigetto dell'80%. In entrambe le immagini, le frecce indicano quattro cellule pigmentate argentee iride che contrassegnano il tessuto innestato sano non rigettato.

In questo esperimento successivo, LG 15 pls sono stati pulsati con un PBS come controllo negativo, GP 96 ricombinante purificato da una coltura di e coli o GP 96 purificato da 15 cellule di tessuto tumorale zero sono state quindi trasferite adottivamente in LG 15 riceventi adulti e tre giorni dopo 15 cellule tumorali zero sono state trapiantate da iniezione sottocutanea I tumori che sono apparsi per la prima volta giorni dopo il challenge sono stati monitorati e le dimensioni del tumore sono state misurate periodicamente in In questi grafici, ogni curva rappresenta la cinetica della crescita tumorale in una rana. I risultati mostrano che gli animali innescati con 0,5 o un microgrammo di GP 96 avevano un aspetto significativamente ritardato del tumore rispetto ai gruppi di controllo. Pertanto, GP 96 facilita la presentazione incrociata degli antigeni tumorali in xenopus.

Quindi vi abbiamo appena mostrato come esplorare la capacità di GP 96 di rappresentare sia antigeni minori che tumorali nel frog xap lavis mediante innesti cutanei e saggi di trapianto di tumore. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di evitare di raccogliere il lavaggio peritoneale se un vaso sanguigno è stato danneggiato poiché la maggior parte delle cellule all'interno degli eritrociti e non dei macrofagi. È anche importante evitare di schiacciare il tessuto con la pinza durante la manipolazione dell'innesto cutaneo per evitare danni.

Quindi questo è tutto. Grazie per il lavaggio e buona fortuna con i tuoi esperimenti.