Isolamento del DNA microbico delle feci: studio dell'effetto dell'arricchimento ambientale sulla diversità del microbioma nel modello di tumore murino

- L'arricchimento ambientale, o EE, si riferisce alle modifiche dei parametri abitativi per ottenere effetti benefici su varie malattie come il cancro. In un topo portatore di tumore, l'EE attiva il sistema immunitario e riduce l'infiammazione, migliorando il microbiota intestinale e il tasso di sopravvivenza. Per studiare i cambiamenti nel microbiota intestinale, aggiungere la quantità desiderata di tampone per la lisi delle feci in una provetta contenente le feci del topo.

Centrifugare il campione e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Aggiungere il tampone di lisi del cloruro di guanidinio che denatura la DNasi e la RNasi. Quindi, aggiungere etanolo e trasferire il campione in una colonna di centrifuga di silice.

L'etanolo aiuta il DNA a legarsi alla silice. Centrifugare il campione. A questo punto, trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga e aggiungere un tampone di eluizione alla colonna per eluire il DNA.

Centrifugare il campione e scartare la colonna. Trasferire il campione in una provetta PCR ed eseguire la PCR per amplificare il DNA. Caricare il DNA su gel di agarosio ed eseguire l'elettroforesi per quantificare le dimensioni del DNA microbico. Nel seguente protocollo, isoleremo il DNA dalle feci per analizzare l'effetto dell'EE sul microbiota del colon nel topo tumorigenico.

- Utilizzare un kit commerciale per isolare il DNA microbico dalle feci seguendo un protocollo di rilevamento dei patogeni delle feci. A questo punto, trasferire i campioni dal congelatore a meno 80 gradi Celsius su ghiaccio secco e pesarli. Successivamente, imposta una PCR che amplifica il DNA microbico come descritto nel protocollo di testo. Quindi, pulire i prodotti di reazione utilizzando perline magnetiche.

Per la pulizia, per prima cosa, centrifugare brevemente la piastra PCR dell'amplicone per estrarre i prodotti di reazione. Quindi, agitare le perle magnetiche per disperderle uniformemente e trasferire 20 microlitri di aliquote a ciascun pozzetto di reazione. Mescolare accuratamente le perle con la soluzione pipettando lentamente l'intero volume 10 volte. Quindi, lasciate riposare le perline per 5 minuti.

Quindi, posizionare la piastra PCR su un supporto magnetico e attendere 2 minuti affinché i surnatanti si liberino dopo la raccolta magnetica delle perline. Quindi, rimuovere e scartare i surnatanti. Quindi, con la piastra ancora sul magnete, riempi ogni pozzetto di perline con 200 microlitri di etanolo fresco all'80% e attendi 30 secondi. Quindi, rimuovere con cura il surnatante.

Ripeti questa fase di lavaggio una volta e lascia asciugare le perline all'aria per 10 minuti. Ora, eluire i prodotti di reazione dalle perle rimuovendo la piastra dal supporto magnetico e aggiungendo 52,5 microlitri di Tris a ciascun pozzetto. Mescolare completamente le perle in soluzione pipettando lentamente l'intero volume 10 volte. Quindi, raccogliere le perle sul supporto magnetico come prima e trasferire 50 microlitri di surnatanti su una piastra PCR pulita. Copri la piastra con un adesivo trasparente e conservala a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana.