Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare una strategia semplice ed efficiente per immobilizzare qualsiasi proteina di interesse su idrogel di poliacrilammide al fine di controllare in modo indipendente vari parametri del microambiente cellulare. Ciò si ottiene diffondendo prima la soluzione proteica sulla superficie del timbro PDMS. Il secondo passo consiste nell'asciugare accuratamente la superficie strutturata del timbro PDMS con un flusso costante di azoto gassoso ad alta purezza.

Successivamente, il timbro rivestito di proteine viene posizionato con una superficie strutturata a contatto con la superficie dell'idrogel essiccato e brevi punti di pressione vengono applicati sulla parte superiore del timbro PDMS per garantire un buon contatto tra le micro caratteristiche del timbro e la superficie dell'idrogel, il passaggio finale consiste nel rimuovere delicatamente il timbro PDMS dalla superficie dell'idrogel e pulire il timbro Dopo l'azione delle zone non stampate. Con BSA, le celle possono essere posizionate sulla superficie dell'idrogel con modello micro. In definitiva, un microscopio a fluorescenza invertito viene utilizzato per osservare le micro caratteristiche delle proteine.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della trasduzione meccano, come il contributo relativo delle proprietà della matrice extracellulare, ad esempio la rigidità, la densità del ligone cellulare o la natura proteica. Nel processo di non transazione, si consiglia di eseguire questa procedura in una cappa chimica. Inizia posizionando vetrini circolari di vetro di 25 millimetri di diametro in una capsula di Petri e spalmando su di essi una soluzione di idrossido di sodio molare 0,1 per cinque minuti.

Rimuovere la soluzione di idrossido di sodio e immergere completamente i vetrini coprioggetti in DD H2O sterile, agitare delicatamente per 20 minuti su una piastra a dondolo, scolare il DDH sterile due O, aggiungere altro DDH due O sterile per immergere completamente i vetrini coprioggetti e agitare delicatamente per altri 20 minuti. Rimuovere i vetrini coprioggetti con una pinzetta sterile e metterli in una nuova capsula di Petri. Con il lato attivato rivolto verso l'alto a secco, il coperchio scivola con un flusso costante di azoto gassoso ad alta purezza.

Una volta che i vetrini coprioggetto sono asciutti, riportarli nella cappa di coltura sterile e spalmare uno strato sottile di tre trimetilpropil acrl sul lato attivato di ciascun coperchio. Scivolare per un'ora dopo un'ora. Lavare accuratamente i vetrini di copertura con DD H2O sterile.

Quindi immergere i vetrini coprioggetto in DD H2O sterile in una nuova piastra di Petri. Sigillare la capsula di Petri con pellicola para e posizionarla su una piastra a dondolo agitando delicatamente per 10 minuti. Infine, utilizzare una pinzetta sterile con punte sottili per trasferire i vetrini coprioggetti dal DDH two O a una nuova capsula di Petri.

Con l'attivato rivolto verso l'alto. Coprire la pirofila con un foglio di alluminio per evitare che la polvere si attacchi ai vetrini coprioggetti e conservare a temperatura ambiente in un luogo asciutto. Per iniziare questa procedura, preparare cinque millilitri di una soluzione sterile di idrogel di idrossipoliacrilammide e 100 microlitri di una soluzione fresca di ammonio per solfato al 10%.

Come descritto nel testo del protocollo, aggiungere 2,5 microlitri di tetra metilene diammina e 25 microlitri di soluzione di ammonio per solfato alla soluzione di idrogel di idrossi poliacrilammide. Per avviare la polimerizzazione, miscelare la soluzione mediante tre pipettaggi successivi senza introduzione di bolle in condizioni sterili sotto una cappa sterile, posizionare una goccia da 25 microlitri della soluzione di idrogel di idrossipoliacrilammide su un vetrino coprioggetti circolare da 25 millimetri e posizionare immediatamente un vetrino di vetro circolare da 22 millimetri sopra la gocciolina per spremere la soluzione di idrogel di idrossol-poliacrilammide. Il vetrino coprioggetto da 22 millimetri è stato precedentemente attivato da un'esposizione di sette minuti in un detergente all'ozono UV.

Centrare il vetrino coprioggetto con una pinzetta sterile e appianare eventuali bolle. Lasciare polimerizzare l'idrogel di idrossipoliacrilammide a temperatura ambiente per 15 minuti. Capovolgere manualmente la restante soluzione di idrogel di idrossipoliacrilammide nel tubo.

Per seguire il completamento del processo di polimerizzazione, immergere completamente i vetrini coprioggetto con D DH sterile due o. Separare accuratamente il vetrino coprioggetto in vetro da 22 millimetri inserendo il bordo di una lama di rasoio tra il vetrino da 22 millimetri e lo strato di idrogel idrossipoliacrilammide. Lavare tre volte l'idrogel di idrossipoliacrilammide con PBS sterile e lasciare il gel completamente immerso in PBS sterile per mantenere l'idratazione.

I micro timbri in polidimetilsoano o PDMS utilizzati in questa procedura sono stati fabbricati come descritto nel protocollo di testo. Posizionare i micro timbri PDMS in una soluzione acquosa di etanolo da 50 a 50 e sonicare per 15 minuti. Asciugare i timbri con un flusso di vapore di azoto e metterli in un detergente all'ozono UV per sette minuti.

Sotto una cappa sterile, posizionare una goccia da 150 microlitri di una soluzione proteica desiderata sulla superficie microstrutturata di A-P-D-M-S. In questa dimostrazione viene utilizzato il timbro FI nin. Distribuire la soluzione proteica sulla superficie del timbro spostandola con la punta di una pipetta sterile verso ciascun angolo del timbro.

Lasciare assorbire la soluzione proteica sul timbro PDMS per 60 minuti. Sotto questa cappa sterile, spegni le lampade per evitare danni alle proteine. Quindi, trasferire i vetrini di copertura rivestiti di idrogel di idrossi di idrossi in una nuova piastra di Petri.

Rimuovere l'eccesso di PBS dalla superficie dei substrati di idrogel idrossipoliacrilammide con il flusso a basso contenuto di azoto in condizioni sterili. Interrompere la procedura. Non appena non si osserva alcuna traccia di acqua stagnante sulla superficie del gel.

Il gel non deve essere asciugato completamente in questa fase. Asciugare accuratamente la superficie strutturata del timbro PDMS con un flusso costante di azoto gassoso ad alta purezza. Afferrare il timbro rivestito di proteine con una pinza per tessuti di medicazione e posizionare una superficie strutturata a contatto con la superficie dell'idrogel essiccato.

Applicare brevi punti di pressione con la punta delle pinzette sulla parte superiore del timbro PDMS per garantire un buon contatto tra le micro caratteristiche del timbro e la superficie dell'idrogel, lasciare il timbro PDMS sulla superficie dell'idrogel per un'ora a temperatura ambiente dopo un'ora. Rimuovere delicatamente il timbro PDMS dall'idrogel di idrossipoliacrilammide con una pinza per tessuti di medicazione e pulire il timbro fornicandolo in una soluzione acquosa di etanolo per 15 minuti. Lavare accuratamente l'idrogel di idrossipoliacrilammide stampato con tre scambi di PBS in condizioni sterili per 10 minuti per scambio.

Dopo l'ultimo lavaggio PBS, aggiungere una soluzione sterile di BSA e incubare per una notte a quattro gradi Celsius sotto leggera agitazione su una piastra a dondolo. Questo manderà le zone non stampate il giorno successivo. Lavare accuratamente l'idrogel di idrossipoliacrilammide stampato con tre scambi di PBS in condizioni sterili per 10 minuti per scambio.

Gli idrogel di idrossipoliacrilammide stampati possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. I risultati mostrano una correlazione lineare tra l'evoluzione della rigidità degli idrogel di idrossipoliacrilammide e la quantità di reticolante di acrilammide bis immagini fluorescenti di micro pattern rettangolari laminati depositati su idrossili poliacrilammide Gli idrogel di tre diverse rigidità dimostrano la regolazione indipendente della geometria del micropattern e della rigidità della matrice. La densità del ligando cellulare può essere modulata variando la concentrazione della soluzione proteica utilizzata per incubare i timbri PDMS.

Qui sono mostrate due immagini fluorescenti da stampe sequenziali a micro contatto. Strisce di fibronectina in rosso e laminina in verde, incrociate a 90 gradi e strisce di fibrina, laminina e collagene microstampate in sequenza su un substrato di idrogel di idroclilammide idrossilato pascal da 25 chili. Quando le cellule primarie sono state piastrate su superfici di idrogel idrossipoliacrilammide rivestite in modo omogeneo e con pattern micro, la vitalità cellulare era almeno dell'80% fino a tre giorni dopo la placcatura.

È stato anche osservato che le cellule proliferano maggiormente su substrati rigidi rispetto a substrati morbidi. Quando placcato su micro modelli rettangolari rivestiti di fibronectina depositati su idrogel di idrossipoliacrilammide di tre diverse rigidità. Le cellule endoteliali primarie mostrano una bassa densità di fibre di actina e un nucleo arrotondato sulla parte morbida.

I substrati su substrati più rigidi, le fibre di actina sono più dritte e più spesse e il nucleo si deforma dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della trasduzione meccanica per esplorare il ruolo individuale dei parametri dei microambienti cellulari in un'ampia gamma di sistemi cellulari come cellule primarie o staminali, livello tissutale, organismo modello, moda, demografia o sistemi di organi.