Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare una strategia semplice ed efficiente per immobilizzare qualsiasi proteina di interesse su idrogeli di poliacrilammide, al fine di controllare in modo indipendente diversi parametri del microambiente cellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto stendendo la soluzione proteica sulla superficie dello stampo in PDMS. Il secondo passaggio consiste nell'essiccare con attenzione la superficie strutturata dello stampo in PDMS mediante un flusso costante di gas azoto ad alta purezza.

Successivamente, il timbro rivestito di proteine viene posizionato con la superficie strutturata a contatto con la superficie del idrogel essiccato, applicando brevi pressioni sulla parte superiore del timbro in PDMS per garantire un buon contatto tra le microstrutture del timbro e la superficie dell'idrogel. L'ultimo passaggio consiste nel rimuovere delicatamente il timbro in PDMS dalla superficie dell'idrogel e nel pulire il timbro dopo l'attivazione delle zone non stampate. Con BSA, le cellule possono aderire sulla superficie micropatterningata dell'idrogel. Infine, si utilizza un microscopio a fluorescenza invertito per osservare le microstrutture proteiche.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della mecanotrasduzione, come il contributo relativo delle proprietà della matrice extracellulare, ad esempio la rigidità, la densità di ligandi cellulari o la natura delle proteine. Nel processo di ano transazione, si raccomanda di eseguire questa procedura all'interno di una cappa chimica. Iniziare posizionando coprioggetti circolari di vetro di 25 millimetri di diametro in una piastra di Petri e spalmando su di essi una soluzione di idrossido di sodio 0,1 molare per cinque minuti.

Rimuovere la soluzione di idrossido di sodio e immergere completamente le lamelle in acqua DD sterile H2O, agitando delicatamente per 20 minuti su una piastra agitatrice; svuotare l’acqua DD sterile H2O, aggiungere altra acqua DD sterile H2O per immergere completamente le lamelle e agitare delicatamente per altri 20 minuti. Rimuovere le lamelle con pinzette sterili e posizionarle in una nuova piastra di Petri. Con il lato attivato rivolto verso l’alto, asciugare le lamelle con un flusso costante di gas azoto ad alta purezza.

Una volta che i coperchi sono asciutti, riportarli nella cappa sterile e spalmare uno strato sottile di tre trimetil propil acrl sul lato attivato di ciascun coperchio. Lasciare agire per un'ora. Lavare abbondantemente i coperchi di vetro con acqua DD H2O sterile.

Successivamente immergere i coprioggetti in acqua DD H2O sterile in una nuova piastra di Petri. Sigillare la piastra di Petri con pellicola parafilm e posizionarla su una piastra oscillante con agitazione delicata per 10 minuti. Infine, utilizzare pinzette sterili con punte fini per trasferire i coprioggetti dall'H2O DD a una nuova piastra di Petri.

Con la superficie attivata rivolta verso l'alto. Coprire la piastra con pellicola di alluminio per evitare che la polvere aderisca ai coverslip e conservare a temperatura ambiente in un luogo asciutto. Per iniziare questa procedura, preparare cinque millilitri di una soluzione sterile di idrogel di poliacrilamide idrossi e 100 microlitri di una soluzione fresca di persolfato di ammonio al 10%.

Come descritto nel testo del protocollo, aggiungere 2,5 µL di tetra metilene diamina e 25 µL di soluzione di perossosolfato di ammonio alla soluzione di idrogel di idrossi poli acrilamide. Per avviare la polimerizzazione, mescolare la soluzione mediante tre pipettaggi successivi senza introdurre bolle, in condizioni sterili sotto cappa sterile; quindi depositare una goccia da 25 µL della soluzione di idrogel di idrossi poli acrilamide su un coprioggetto circolare da 25 mm e immediatamente posizionare sopra la goccia un coprioggetto circolare in vetro da 22 mm per schiacciare la soluzione di idrogel di idrossi poli acrilamide. Il coprioggetto in vetro da 22 mm era stato precedentemente attivato mediante esposizione di sette minuti a un pulitore a ozono UV.

Centrare il vetrino di vetro con pinzette sterili ed eliminare eventuali bolle d'aria. Lasciare polimerizzare l'idrogel di idrossi poli acrilammide a temperatura ambiente per 15 minuti. Invertire manualmente la soluzione rimanente di idrogel di idrossi poli acrilammide nel tubo.

Per seguire il completamento del processo di polimerizzazione, immergere completamente le lamelle in D DH sterile o. Separare con attenzione la lamella di vetro da 22 millimetri inserendo il bordo di una lama di rasoio tra la lamella di vetro da 22 millimetri e lo strato di idrogel di idrossi poliacrilamide. Lavare l'idrogel di idrossi poliacrilamide tre volte con PBS sterile e lasciare il gel completamente immerso in PBS sterile per mantenerne l'idratazione.

I microstammi in poli dimetil silossano o PDMS utilizzati in questa procedura sono stati realizzati come descritto nel protocollo testuale. Posizionare i microstammi in una soluzione di etanolo e acqua al 50 a 50 e sottoporli a sonificazione per 15 minuti. Asciugare gli stammi con un flusso di azoto e posizionarli con il motivo rivolto verso l'alto in un apparecchio di pulizia a ozono UV per sette minuti.

Sotto una cappa sterile, posizionare una goccia da 150 microlitri di una soluzione proteica desiderata sulla superficie microstrutturata di A-P-D-M-S. Nella presente dimostrazione viene utilizzato lo stampo FI nin. Distribuire la soluzione proteica sulla superficie dello stampo muovendola con la punta sterile di una pipetta verso ciascun angolo dello stampo.

Lasciare la soluzione proteica in assorbimento sul timbro in PDMS per 60 minuti. All'interno della cappa sterile, spegnere le lampade per evitare danni alle proteine. Successivamente, trasferire le lamelle rivestite con idrogel di idrossi poliacrilamide in una nuova piastra di Petri.

Rimuovere l'eccesso di PBS dalla superficie dei substrati di idrogel di idrossi poliacrilammide utilizzando un flusso leggero di azoto in condizioni sterili. Interrompere la procedura non appena non si osserva alcuna traccia di acqua stagnante sulla superficie del gel.

Il gel non deve essere asciugato completamente in questa fase. Asciugare con attenzione la superficie strutturata del timbro in PDMS con un flusso costante di gas azoto ad alta purezza. Afferrare il timbro rivestito di proteine con pinzette per garza e porre la superficie strutturata a contatto con la superficie del idrogel asciutto.

Applicare brevi pressioni con la punta delle pinzette sulla parte superiore del timbro in PDMS per garantire un buon contatto tra le microstrutture del timbro e la superficie dell'idrogel; lasciare il timbro in PDMS a contatto con la superficie dell'idrogel per un'ora a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il timbro in PDMS dall'idrogel di idrossi poli acrilamide utilizzando pinzette sterili e pulire il timbro immergendolo in una soluzione acquosa di etanolo per 15 minuti. Lavare accuratamente l'idrogel di idrossi poli acrilamide stampato effettuando tre cambi di PBS in condizioni sterili, per 10 minuti ogni cambio.

Dopo l'ultimo lavaggio con PBS, aggiungere una soluzione sterile di BSA e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius sotto lieve agitazione su una piastra oscillante. Questo permetterà di bloccare le zone non stampate il giorno successivo. Lavare estesamente l'idrogel di idrossi poli acrilammide stampato mediante tre cambi di PBS in condizioni sterili, per 10 minuti ogni cambio.

Idrogeli di idrossi poli acrilamide stampati possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un periodo massimo di una settimana. I risultati mostrano una correlazione lineare tra l'evoluzione della rigidità degli idrogeli di idrossi poli acrilamide e la quantità di crosslinker bis acrilamide. Immagini epi fluorescenti di microstrutture rettangolari laminate depositate su idrogeli di idrossi poli acrilamide con tre diverse rigidità dimostrano la possibilità di regolare in modo indipendente la geometria del micropattern e la rigidità della matrice. La densità dei ligandi cellulari può essere modulata variando la concentrazione della soluzione proteica utilizzata per incubare gli stampi in PDMS.

Qui sono mostrate due immagini fluorescenti ottenute da stampe microcontatto sequenziali. Strisce di fibronectina in rosso e laminina in verde, incrociate a 90 gradi, e strisce di laminina fibrinica e collagene stampate in microcontatto sequenzialmente su un substrato di idrogel di idrossi poliacrilammide da 25 chilo pascal. Quando cellule primarie sono state seminate su superfici di idrogel di idrossi poliacrilammide rivestite in modo omogeneo e microstrutturate, la vitalità cellulare è stata almeno dell'80% fino a tre giorni dopo la semina.

È stato inoltre osservato che le cellule proliferano maggiormente su substrati rigidi rispetto a quelli morbidi. Quando piastrate su modelli microscopici rettangolari rivestiti di fibronectina depositati su idrogeli di idrossi poliacrilamide con tre diverse rigidità, le cellule endoteliali primarie mostrano una bassa densità di fibre di actina e un nucleo arrotondato sul substrato morbido.

Su substrati più rigidi, le fibre di actina sono più dritte e spesse e il nucleo è deformato dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della trasduzione meccanica per esplorare il ruolo individuale dei parametri del microambiente cellulare in una vasta gamma di sistemi cellulari, come cellule primarie o staminali, livello tissutale, organismi modello, sistemi organici, aspetti demografici o modelli di organi.