Pronostico di HIV-1 Uso corecettore (tropismo) mediante analisi della sequenza utilizzando un approccio genotipica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di prevedere l'utilizzo del co-recettore dell'HIV per la somministrazione di una nuova classe di farmaci antiretrovirali. Ciò si ottiene isolando gli acidi nucleici genomici virali, l'RNA virale o il DNA provirale dal sangue del paziente in seguito all'amplificazione della regione dell'involucro. La regione virale V tre, che è il principale determinante per il tropismo, è amplificata dalla PCR nidificata.

Successivamente, l'amplicone V three viene sequenziato con diversi primer per generare un file fasta. Si ottengono risultati che mostrano il tropismo virale e la suscettibilità all'antagonista del corecettore in base al tasso di falsi positivi o FPR ottenuto dallo strumento di interpretazione online da geno a fenocettore. A seconda dell'uso di CORECEPTOR, i virus dell'HIV sono classificati come R cinque o X quattro.

La roccia miri si lega attraverso il recettore CCR 5, inibendo l'ingresso dei virus R 5 nella cellula bersaglio. Durante il decorso della malattia, i virus X four possono emergere e superare i virus R five. La cessazione dell'uso del recettore, chiamata anche tropismo, è quindi obbligatoria prima della somministrazione di maraviroc, come richiesto dall'EMA e dalla FDA.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può fare una determinazione parallela della resistenza ad altre classi di farmaci antiretrovirali molto facilmente. Questo metodo consente una medicina molto più personalizzata in quanto i limiti per i risultati del tropismo possono essere modificati in base alle esigenze del paziente. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta all'inizio degli anni novanta, quando volevamo conoscere le basi molecolari della diversa crescita in coltura cellulare dei ceppi di HIV e la progressione della malattia nei pazienti, dimostrando che la procedura sarà data da un tecnico del nostro gruppo Prima dell'inizio di questo protocollo.

I campioni vengono raccolti come sangue EDTA presso il sito clinico e inviati al laboratorio per iniziare a isolare gli acidi nucleici dell'HIV da 1000 microlitri di siero o plasma di sangue intero utilizzando il sistema compatto mag pure e il kit di isolamento degli acidi nucleici secondo le istruzioni del produttore. L'RNA o il DNA guadagnato viene quindi alluso in un tampone TE da 50 microlitri. Il passo successivo è quello di amplificare la regione dell'involucro dell'acido nucleico mediante PCR a trascrizione inversa per l'RNA o semplicemente PCR per il DNA come descritto nel testo, la reazione dovrebbe generare un prodotto lungo 1.245 coppie di basi che comprende la maggior parte della regione proteica dell'involucro per amplificare la regione V tre della proteina dell'involucro seguita con la PCR nidificata utilizzando cinque microlitri dalla prima reazione PCR come modello.

Preparare le reazioni utilizzando la miscela master per la PCR interna nidificata come descritto nel testo. Qui sono descritti anche i parametri di esecuzione della PCR nidificata. Dopo l'amplificazione della regione V tre, analizzare il prodotto PCR per verificare il prodotto atteso a 902 coppie di basi di lunghezza mediante elettroforesi su gel prima del sequenziamento.

Purificare il prodotto PCR come descritto nel protocollo scritto. Una volta che il prodotto della PCR è stato purificato, eseguire la reazione di sequenziamento come descritto nel testo al termine della reazione. Purificare i campioni di sequenziamento utilizzando cidex G 50 superfine e una piastra filtrante multischermo con membrana durapore seguendo le istruzioni nella parte scritta di questa procedura per sequenziare il prodotto purificato, preparare il sequenziatore controllando il polimero e cambiando il tampone.

Quindi caricare i campioni, impostare le condizioni e avviare la corsa. Dopo l'esecuzione del sequenziamento. Il programma genetico laser DNA STAR può essere utilizzato per allineare e modificare le sequenze.

Il V tre amplicone è sequenziato con almeno un innesco in avanti e uno inverso. Il gene laser allinea i file ABI ottenuti dal sequenziatore con le sequenze di riferimento. V tre, il gene del laser a consenso B e inviluppo crea una sequenza consenso del campione analizzato utilizzando tutti i dati grezzi disponibili, ma non i riferimenti e la memorizza come file FASTA.

Il file FASTA è un file di testo che include un'intestazione con il nome del campione e la sequenza nucleotidica. Per iniziare l'interpretazione dei dati e la previsione del tropismo, caricare il file FASTA nel sistema di interpretazione basato sul Web. Il co-recettore Geno Tono seleziona il cutoff FPR fino al quale il virus è classificato come R 5.

Utilizzando le linee guida tedesche, il virus è classificato come R 5. Quando l'FPR è maggiore o uguale al 20% e come X quattro, quando l'FPR è inferiore al 12,5%, selezionare eventuali parametri clinici aggiuntivi, se disponibili, quindi selezionare, allineare e prevedere Questo server traduce la sequenza nucleotidica in amminoacidi, la allinea con la sequenza B di consenso V tre e produce una classificazione dei sottotipi. Inoltre, genera una previsione dell'utilizzo del co-recettore espressa come FPR.

L'output mostra un'interpretazione graduata a seconda della probabilità di utilizzo del co-recettore. Per valori di FPR elevati, si è abbastanza sicuri che il virus non sia X quattro e per un FPR basso non si è sicuri di come appare il virus se l'interpretazione, il testo e il colore di sfondo sono verdi. È indicata una somministrazione sicura per Ravi Rock, mentre il giallo suggerisce un possibile basso rischio per l'uso di Ravi Rock e il rosso indica che il Ravi Rock non deve essere prescritto.

Inoltre, il server genera un rapporto PDF che può essere stampato e inviato al medico. Ulteriori dati come il nome del paziente o la data dell'estrazione del sangue possono essere inclusi manualmente utilizzando un programma di scrittura PDF. Nella privacy del computer dell'utente possono essere aggiunti anche commenti specifici.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare le costolette virali utilizzando lo strumento del recettore del fenotipo geno Durante il tentativo di questa procedura, è importante eseguire regolarmente controlli di qualità. Non dimenticare che lavorare con l'HIV può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario utilizzare sempre precauzioni e laboratori biologici sicuri autorizzati.