Name: Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dellattività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri un protocollo di imaging FRET in vivo nel pesce zebra per valutare l'attivazione di ERK nelle RASopatie. Questo metodo consente di validare varianti patogeniche e testare farmaci in tempo reale.

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<ol><li>Iroegbu, J. D., Ijomone, O. K., Femi-Akinlosotu, O. M., Ijomone, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%2FMAPK+signalling+in+the+developing+brain%3A+Perturbations+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">ERK/MAPK signalling in the developing brain: Perturbations and consequences.</a> Neurosci Biobehav Rev. 131, 792-805 (2021).</li>
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<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531 (2), 245-249 (2002).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>Plastica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7 L Acquario di riproduzione - Design in stile spiaggia</td><td>Tecniplast</td><td>1.7L INCLINATA</td><td>Vasca riproduttiva</td></tr><tr><td>Capillari GC100F-10</td><td>Apparecchiatura Harvard</td><td>30-0019</td><td>Microiniezione embrionale a stadio unicellulare</td></tr><tr><td>Piastre di coltura cellulare e tissutale - 12 pozzi</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011012</td><td>Raccolta e trattamento degli embrioni</td></tr><tr><td>Piastre di coltura cellulare e tissutale - 6 pozzi</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011006</td><td>Raccolta e trattamento degli embrioni</td></tr><tr><td>Piatto di coltura cellulare</td><td>SPL Scienze della Vita</td><td>20100</td><td>Raccolta embrionali&nbsp;</td></tr><tr><td>Piatti di vetro Nunc 12mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>150680</td><td>Imaging spettrale FRET dell'embrione</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur</td><td>Corning</td><td>357524</td><td>Trasferimento embrionale</td></tr><tr><td>Tubi Lobind proteici 2ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td><forti>reagenti e altri</forti></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caviale 500-800 & micro; m</td><td>Rettenmaier Italia</td><td>BE2269 (500-800)</td><td>Cibo secco per pesci</td></tr><tr><td>Cisti di artemia blu del Grande Lago Salato</td><td>Sanders</td><td>00004727</td><td>Cibo per pesci vivi</td></tr><tr><td>Sale oceanico istantaneo</td><td>Tecniplast</td><td>XPSIO25R</td><td>Sale marino disidratato per la preparazione di cibi vivi</td></tr><tr><td>Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Adolescente)</td><td>Contatti per ordinare*: Progetto Nazionale BioResource Zebrafish, Unità di Supporto per lo Sviluppo delle Risorse Animali, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Giappone. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *sulla firma MTA.&nbsp; </loro></td><td>-</td><td>Fornitore della linea ERK Reporter per pesci zebra. Gli embrioni di pesce possono essere ottenuti tramite firma MTA dal National BioResource Project del Giappone per il pesce zebra (RIKEN, Giappone). La linea di pesci zebra è depositata dal Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) e dal National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, brevetto per il sistema Tol2) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto e Ishioka, 2010).</td></tr><tr><td>6x colorante di carico</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>B7024S</td><td>Elecroforesi su gel</td></tr><tr><td>Scala del DNA a 100 pb</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td>Elecroforesi su gel</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,01,236</td><td>Elecroforesi su gel</td></tr><tr><td>Agarosio, bassa temperatura di gelificazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Montaggio dell'embrione per immagini spettrali FRET e test IHC</td></tr><tr><td>Albumina Sirica Bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td>Componente medio E3</td></tr><tr><td>Nitrato di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124</td><td>Componente della soluzione di Danieau</td></tr><tr><td>Dimetil Solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Componente tampone TBE per la preparazione del gel</td></tr><tr><td>Etanolo 99%+</td><td>Fisher Scientific</td><td>10048291</td><td>Purificazione in vitro dell'RNA</td></tr><tr><td>Formaldeide 16%</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Fissazione embrionale</td></tr><tr><td>Formamide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Elecroforesi su gel</td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II (PAGINA Denaturante)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM8546G</td><td>Trascrizione in vitro dell'RNA</td></tr><tr><td>Acido Acetico Glaciale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>Componente tampone TBE per la preparazione del gel</td></tr><tr><td>Glicerolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-topo per capre</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>Anti-coniglio per capre Alexa Fluor 633</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21070</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Componente della soluzione di Danieau</td></tr><tr><td>KpnI - HF (Enzima + tampone rCutSmart)</td><td>NEB</td><td>R3142</td><td>Linearizzazione plasmidiale&nbsp;</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Componente medio E3/componente di soluzione Danieau stock</td></tr><tr><td>Marcatori RNA del Millennio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7150</td><td>Elecroforesi su gel</td></tr><tr><td>Kit di purificazione del DNA genomico Monarch</td><td>NEB</td><td>T3010L</td><td>Linearizzazione plasmidiale&nbsp;</td></tr><tr><td>MAPK monoclonale topino p44/42</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4696S</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione mMACHINE SP6 &nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1340</td><td>Trascrizione in vitro dell'RNA</td></tr><tr><td>Siero normale per capra (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>Ambione dell'acqua privo di nucleasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>Trascrizione in vitro dell'RNA</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>Inibitore MEK</td></tr><tr><td>Soluzione rossa di fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>Componente della miscela microiniezione &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di coda Poly A</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td>Trascrizione in vitro dell'RNA</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio bioxtra&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Componente medio E3/componente soluzione Danieau stock/componente soluzione stock PBS</td></tr><tr><td>Fosfato diidrogeno di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Componente della soluzione stock PBS</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>Fosfo-p44/42 policlonale coniglio MAPK&nbsp;</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4695S</td><td>Analisi IHC</td></tr><tr><td>Colorazione con gel di DNA sicura per SYBR</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td>Elecroforesi su gel</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-M</td><td>Componente medio E3/componente soluzione Danieau stock/componente soluzione stock PBS</td></tr><tr><td>Dibase fosfato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>Componente della soluzione stock PBS</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Componente tampone TBE per la preparazione del gel</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Componente buffer PBSTr</td></tr><tr><td><forte>Equipaggiamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alliance Mini HD9 & nbsp;</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>Sistema di imaging</td></tr><tr><td>Centrifuga 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000205</td><td>Microcentrifuga</td></tr><tr><td>Termomixer Eppendorf C</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>Montaggio embrionale &nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet 4x</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>Sistema di microiniezione</td></tr><tr><td>Infinite M Plex&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>-</td><td>Lettore di piastre multimodalità</td></tr><tr><td>Leica M205FA</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Microscopio stereo a fluorescenza</td></tr><tr><td>Leica TCS-SP8X equipaggiata con incubatore (OkoLab)</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Microscopio confocale</td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi Horizionale GT Mini-sottocella &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Elecroforesi su gel</td></tr><tr><td>PC-100 Estrattore verticale</td><td>Narishige</td><td>-</td><td>Estrazione di ago</td></tr><tr><td>Alimentatore universale PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td>Elecroforesi su gel</td></tr><tr><td>Stellaris 5&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Microscopio confocale</td></tr><tr><td>Vortex MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>-</td><td>Preparazione dei plasmidi</td></tr><tr><td><forte>Software</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td>Licenza CC-BY 4.0</td><td>Elaborazione di cartoni animati per Figure</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2019</td><td>-</td><td>Analisi dei dati</td></tr><tr><td>Software delle Figi</td><td>ImageJ</td><td>15.3t</td><td>Rendering di imaging e analisi quantitative (misurazioni dei segnali FRET, intensità di fluorescenza ERK nell'analisi IHC, lunghezza degli assi embrionali)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp;</td><td>GraphPad Software LLC</td><td>v. 9</td><td>Analisi dei dati statistici</td></tr><tr><td>Software per lo spettrofotometro iControl</td><td>Tecan</td><td>v. 2.0</td><td>Quantificazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Illustratore</td><td>Adobe</td><td>26.0.3 (64 bit)</td><td>Assemblaggio delle figure</td></tr><tr><td>Software LASX</td><td>Leica Microsystems</td><td>v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)</td><td>Acquisizione di immagini per esperimenti spettrali FRET e imaging embrionale per misurazioni della lunghezza degli assi</td></tr><tr><td>Software Q9 Mini 18.02-SN</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>Acquisizione dell'immagine in gel</td></tr></tbody></table>

un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di erk nei primi modelli di sindrome di noonan del pesce zebra tramite microscopia fret dal vivo e immunofluorescenza

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

an-efficient-protocol-to-assess-erk-activity-modulation-early

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Questo video dimostra un test non invasivo per studiare l'elettrofisiologia dei motoneuroni negli embrioni di zebrafish. Dopo aver misurato l'avvolgimento della coda negli embrioni a seguito della depolarizzazione spontanea dei motoneuroni del midollo spinale, viene applicato un bloccante del canale del sodio per ridurre la frequenza di avvolgimento. Successivamente, gli embrioni vengono immobilizzati in agarosio e posti sotto un microscopio a fluorescenza. I motoneuroni geneticamente...

Un approccio non invasivo per studiare l'elettrofisiologia dei motoneuroni negli embrioni di zebrafish

Il pesce zebra è ora uno strumento consolidato e potente per modellare distrofie muscolari, miopatie congenite e malattie neuromuscolari correlate. La birifrangenza e il comportamento di fuga evocato dal tatto sono due comuni test non invasivi utilizzati per determinare il grado di disorganizzazione muscolare e compromissione locomotiva degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo precoce.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Presentiamo un metodo per l'analisi elettroretinografica (ERG) delle larve di zebrafish utilizzando tecniche di micromanipolazione ed elettroretinografia. Questo è un metodo semplice e diretto per saggiare la funzione visiva delle larve di zebrafish in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la caratterizzazione di un modello di epilessia zebrafish derivante dall'inibizione transitoria del gene DEPDC5.

Analisi comportamentale e fisiologica in un modello di zebrafish di epilessia

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare la sollecitazione comportamentale in un pesce zebra adulto. L'approccio sfrutta la tendenza innata che il pesce zebra preferisce la metà inferiore di un serbatoio quando è in uno stato stressante. Descriviamo anche i metodi per accoppiare il saggio con la farmacologia.

Approcci comportamentali allo studio dello stress innato nel zebrafish

La chiarezza ottica è un grande vantaggio per il lavoro biologico e fisiologico delle cellule nel pesce zebra. Vengono descritti metodi robusti per la misurazione della crescita cellulare nei singoli animali che consentono nuove intuizioni su come la crescita del muscolo scheletrico e dei tessuti vicini sono integrati con la crescita di tutto il corpo.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) è un metodo basato sulla biologia chimica per lo studio della segnalazione reattiva di piccole molecole. Questa tecnica può essere applicata a pesci vivi di diversi stadi di sviluppo. Qui, abbiniamo saggi standard nel pesce zebra con Z-REX per l'analisi del percorso di segnalazione.

Monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - Z-REX smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti

La manipolazione optogenetica delle vie di segnalazione può essere una potente strategia per studiare come la segnalazione viene decodificata nello sviluppo, nella rigenerazione, nell'omeostasi e nella malattia. Questo protocollo fornisce linee guida pratiche per l'utilizzo di attivatori di segnalazione della proteina morfogenica (BMP) nodale e della proteina morfogenica ossea (BMP) basati sul dominio di rilevamento della luce-ossigeno-voltaggio nell'embrione precoce di zebrafish.

Attivazione della segnalazione optogenetica negli embrioni di zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per esaminare l'attività neurale nelle regioni cerebrali del pesce zebra transgenico che esprimono indicatori di calcio GCaMP utilizzando la microscopia confocale.

In vivo Imaging a fluorescenza confocale dell'attività neurale indotta dalla stimolazione sensoriale in larve di pesce zebra parzialmente trattenute

Scopri un protocollo di imaging FRET in vivo nel pesce zebra per valutare l'attivazione di ERK nelle RASopatie. Questo metodo consente di validare varianti patogeniche e testare farmaci in tempo reale.

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