Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Generiamo modelli di pesci zebra di malattie sviluppative complesse, collegando il sequenziamento del paziente alla genomica funzionale, per supportare l'interpretazione delle varianti e anche i test preclinici dei farmaci. Nonostante sensori FRET migliorati, manca un robusto saggio in vivo che rilevi sottili cambiamenti patogeni della segnalazione Ras-MAPK con sufficiente sensibilità spaziotemporale. Per cominciare, posizionare la piastra di microiniezione personalizzata contenente il 2%agarosio stampato in mezzo E3 su una piattaforma di lavoro.

Disposizionere e allineare le uova di pesce zebra adolescenti fecondate nella piastra alle corsie appropriate per limitare il movimento delle uova durante la microiniezione. Ricarica l'ago con due microlitri di materiale iniettabile usando una pipetta microcaricatrice. Regola le impostazioni di pressione e tempo per calibrare ogni iniezione in base all'ago e alla qualità dell'embrione sul dispositivo di microiniezione.

Iniettare la soluzione nello stadio unicellulare degli embrioni adolescenti di pesce zebra. Allevare embrioni adolescenti microiniettati in condizioni di allevamento controllato. Pulisci eventuali uova che appaiono torbide o degenerate entro tre ore dalla deposizione.

A circa quattro ore dalla feconditazione, utilizzando un microscopio stereo a fluorescenza standard, impostato su un intervallo di lunghezze d'onda da 465 a 500 nanometri. Esaminare gli embrioni per l'espressione del reporter di fluorescenza. Seleziona i pesci adolescenti positivi per l'imaging FRET e riserva i fratelli negativi per valutazioni immunoistochimiche.

Posizionare pool embrionali di pari numero in diversi pozzi di una piastra a sei pozzi. Per iniziare il trattamento, immergere gli embrioni in tre millilitri di mezzo E3 contenente il controllo del veicolo come DMSO o MEK diluito alla concentrazione desiderata. Per cominciare, sciogliere l'aliquota di agarosio che si scioglie lentamente dall'1,5% al 2% in un ThermoMixer a 50 gradi Celsius.

Una volta dissolto, abbassare la temperatura a circa 30 gradi Celsius. Posizionare un singolo embrione positivo per adolescenti iniettato al centro di una ciotola di vetro da 35 millimetri per l'imaging dal vivo. Rimuovere il mezzo E3 in eccesso e aggiungere una goccia di agarosio a bassa fusione per immobilizzare l'embrione.

Lascia polimerizzare l'agarosio a temperatura ambiente. Accendi il controller dell'incubatrice almeno un'ora prima dell'acquisizione e imposta la temperatura a 28 gradi Celsius per mantenere la salute dell'embrione. Una volta che l'incubatrice si stabilizza, posiziona la piastra di imaging con l'embrione sul portacampioni e usa un obiettivo 10x asciutto per visualizzare il campione.

Accendi il laser ionico di argon e regola la potenza del laser al 50%. Nelle impostazioni hardware, scegli la risoluzione a otto bit per acquisire immagini. Successivamente, nel pannello Acquisizione, seleziona la modalità di scansione spettrale di rilevamento xy, gamma, lambda, z e imposta il formato immagine su 512 per 512 pixel, velocità di scansione di 400 hertz e zoom ottico di 0,75. Attiva la linea laser a 458 nanometri del laser ionico di argon e imposta il suo valore di intensità all'8,5%. Poi seleziona un rivelatore ibrido e imposta la sua sensibilità a un guadagno di 500.

Apri il menu a tendina nella barra del rivelatore per selezionare la curva di emissione della proteina di fluorescenza ciano o ECFP. Per visualizzare la curva di emissione YPET, attiva un secondo rivelatore. Poi seleziona la curva di emissione YFP della proteina fluorescente gialla.

Per iniziare acquisizioni in tempo reale, posiziona il cursore di rilevamento nell'intervallo del segnale YFP più intenso per visualizzare il campione. Imposta le posizioni iniziali e finali dello spessore del campione nella finestra LASX dello Z-Stack. Imposta le proprietà della gamma della gamma a partire da 460 nanometri e terminare a 570 nanometri della distanza di rilevamento.

Definire la larghezza di banda di rilevamento come cinque nanometri e la dimensione del passo di scansione come cinque nanometri. Avvia l'acquisizione z-stack. Inserire e salvare due spettri di emissione di riferimento adattati per CFP e YFP nel database dei coloranti disponibile nella finestra di Configurazione per escludere il flusso spettrale attraverso il canale.

Seleziona il file immagine spettrale risultante dalla sessione di imaging e apri la finestra del processo. Poi, nello strumento di separazione dei coloranti, seleziona Separazione spettrale dei coloranti e configura le impostazioni per la separazione dei coloranti. Nei menu a tendina sul lato sinistro del dialogo, seleziona il nuovo spettro di emissione CFP nella prima posizione e il nuovo spettro di emissioni YFP dal database dello spettro.

Nella scansione gamma delle immagini, identificare l'immagine con la maggiore intensità del segnale. Poi spostati lungo la z-scan per selezionare la sezione ottica che evidenzia l'area di interesse sulla zona di margine. Attiva la modalità di selezione del ROI sulla zona di margine del polo animale per definire l'area con lo spettro migliore.

Clicca su mirino ROI nella finestra di visualizzazione e regola la dimensione del ROI di riferimento a 40 voxel nell'area di misurazione. Apri il file appena generato contenente i due canali separati. Produrre un'immagine proiettiva bidimensionale dalla serie di immagini tridimensionali utilizzando la proiezione di massima intensità.

Nella finestra Processo, seleziona il ritaglio per separare i canali in due file separati, il canale uno e il canale due. Nella finestra Processo, seleziona Combina immagini, poi seleziona il file del canale due e inseriscilo nella prima opzione. Poi seleziona il file del canale uno e inseriscilo nella seconda opzione.

Imposta una riscalatura con un fattore cinque e scegli l'operazione di rapporto. Clicca su Applica per generare il nuovo file contenente l'immagine metrica del rapporto. Salva il file per l'analisi dei dati.

Importare i file immagine di imaging spettrale e separazione dei coloranti nel software open source Fiji per l'analisi. Configurare i parametri per le misurazioni di lettura nelle Fiji utilizzando Analizza e Imposta le Misurazioni. Selezionare area, densità integrata e valore medio grigio come parametri di interesse.

Utilizzando lo strumento di selezione poligonale dalla barra degli strumenti, seleziona la regione di interesse corrispondente al margine della gastrula. In sequenza, clicca su Analizza, Strumenti e ROI Manager per salvare le specifiche ROI xy. Per effettuare misurazioni in un ROI selezionato, clicca su Analizza e Misura.

Organizza i FRET per i valori del rapporto CFP per ogni ROI in un foglio di lavoro con gruppi sperimentali nelle colonne e valori grezzi nelle righe. Per una singola replica biologica, si crea una tabella a colonne con una variabile di raggrupamento, dove ogni gruppo è definito da una colonna. Al termine della gastrulazione, fissare gli embrioni tramite immersione in paraldeide al 4% preparato in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la fissazione, lavare gli embrioni più volte con PBS. Utilizzando una pipetta pastor, orientare gli embrioni lateralmente in un unico pozzetto di una piastra a 12 pozzi contenente PBS fresco. Utilizzando un microscopio stereo con un obiettivo di ingrandimento 2,7x, obiettivo di scansione 0,63x e fattore di zoom 8,6, cattura le immagini in modalità campo luminoso per valutare la presenza di una forma ovale.

Importa l'immagine dell'embrione catturata nel software delle Fiji. Per misurare la lunghezza degli assi dell'embrione, seleziona lo strumento dritto dalla barra degli strumenti e clicca su Analizza, seguito da Misura. Dopo aver effettuato misurazioni selezionate, aggiungile all'elenco del gestore ROI e salva il file ROI.

Esporta i dati in un foglio di lavoro. Calcola il rapporto degli assi dividendo la lunghezza dell'asse maggiore per la lunghezza dell'asse minore. Calcola la media, la deviazione standard della media o l'errore standard della media delle repliche diverse.

La nostra pipeline FRET viva nel zebrafish consente la rilevazione precoce e sensibile dell'attivazione patogena della segnalazione ERK, supportando l'interpretazione delle varianti e test di efficienza degli inibitori MEK.