Valutazione della frequenza delle mutazioni nei batteri utilizzando il test della beta-glucosidasi

Prendete una coltura di batteri geneticamente modificati.

I batteri sono indotti ad esprimere una variante mutante della DNA polimerasi con attività di correzione di bozze difettosa, che aumenta le possibilità di errore di replicazione.

Questi errori possono portare a mutazioni spontanee nella regione regolatoria, che dereprimono il gene della beta-glucosidasi e innescano l'espressione dell'enzima beta-glucosidasi.

Raccogli campioni a intervalli di tempo regolari e valuta il numero di generazioni batteriche in ciascuna coltura. Centrifugare i campioni ed eliminare il surnatante.

Risospendere il pellet in un tampone.

Aggiungere una soluzione permeabilizzante e mescolare per permeabilizzare la membrana batterica.

Trasferire i campioni batterici permeabilizzati in una piastra a più pozzetti.

Aggiungere un substrato che entra nei batteri e reagisce con l'enzima beta-glucosidasi, producendo un prodotto colorato.

Misurare l'intensità del colore per determinare l'attività della beta-glucosidasi.

Analizzare l'attività della beta-glucosidasi nelle colture batteriche per determinare la frequenza delle mutazioni tra le generazioni.

Trasferire una singola colonia di E. coli TOP10 contenente i vettori pBAD-ε e pGOOD1-εD12A11 in un millilitro di terreno LB trattato con antibiotici.

Incubare la coltura per una notte a 37 gradi Celsius. La mattina successiva, diluire la precoltura da 1 a 250 in tre fiasche contenenti 10 millilitri di terreno fresco. Aggiungere agli induttori un millimolare ciascuno di arabinosio, IPTG o arabinosio e IPTG e incubare la coltura indotta a 37 gradi Celsius per otto ore.

Preparare le colture non indotte in parallelo. Raccogliere un millilitro di aliquote e diluirle da uno a 500 in nuovi flaconi contenenti 10 millilitri di terreno fresco, integrati o non integrati con induttori. Quindi incubare la miscela per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, ripetere i passaggi iniziando con la diluizione della precoltura e raccogliere un millilitro di aliquote. Le aliquote vengono poi messe in congelatore.

Quindi, determinare il numero di generazioni che si sono verificate in ogni lingua. Trasferire 100 microlitri di appropriate diluizioni seriali di inoculo e coltura su piastre LB.

Incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, conta le colonie sulle piastre LB.

Calcolare il log del numero di cellule presenti nell'inoculo o log I e nella coltura alla fine della crescita o log C, e determinare il numero di generazioni.

Quindi centrifugare la coltura a 5.000 g per 20 minuti e risospendere le cellule in un millilitro di tris HCL da 50 millimolari, pH 7,6, NaCl da 50 millimolari.

Per permeabilizzare le cellule, aggiungere due o tre gocce di cloroformio e agitare per 20 secondi.

Infine, determinare l'attività della glucosidasi di ciascuna aliquota in una micropiastra a 96 pozzetti.

Aggiungere 100 microlitri di cellule permeabilizzate e 100 microlitri di substrato utilizzando p-nitrofenil-D-glucopiranoside in ogni pozzetto, evitando la creazione di bolle d'aria nei pozzetti.

Leggere l'assorbanza a 420 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre e un filtro.