Valutazione della frequenza delle mutazioni nei batteri utilizzando il test della beta-glucosidasi

Prendete una coltura di batteri geneticamente modificati.

I batteri sono indotti ad esprimere una variante mutante della DNA polimerasi con attività di correzione di bozze difettosa, che aumenta le possibilità di errore di replicazione.

Questi errori possono portare a mutazioni spontanee nella regione regolatoria, che dereprimono il gene della beta-glucosidasi e innescano l'espressione dell'enzima beta-glucosidasi.

Raccogli campioni a intervalli di tempo regolari e valuta il numero di generazioni batteriche in ciascuna coltura. Centrifugare i campioni ed eliminare il surnatante.

Risospendere il pellet in un tampone.

Aggiungere una soluzione permeabilizzante e mescolare per permeabilizzare la membrana batterica.

Trasferire i campioni batterici permeabilizzati in una piastra a più pozzetti.

Aggiungere un substrato che entra nei batteri e reagisce con l'enzima beta-glucosidasi, producendo un prodotto colorato.

Misurare l'intensità del colore per determinare l'attività della beta-glucosidasi.

Analizzare l'attività della beta-glucosidasi nelle colture batteriche per determinare la frequenza delle mutazioni tra le generazioni.

Trasferire una singola colonia di E. coli TOP10 contenente i vettori pB