Test di coinfiltrazione per lo screening degli effettori patogeni che sopprimono il silenziamento dell'RNA vegetale

Prendi una miscela contenente volumi uguali di due sospensioni di Agrobacterium tumefaciens , ciascuna con un plasmide: uno codifica la GFP e l'altro una proteina effettrice.

Perforare un foro e usare una siringa senza ago per infiltrare la miscela nella superficie inferiore delle foglie sane e completamente espanse di Nicotiana benthamiana 16c.

Tampona qualsiasi eccesso di sospensione con tessuti molli per prevenire la crescita batterica eccessiva.

Segna le aree infiltrate e incuba le piante in condizioni ottimali di crescita.

Agrobacterium trasferisce i DNA plasmidi nelle cellule vegetali, dove i geni GFP ed effettori vengono trascritti in mRNA e tradotti in proteine.

Il sistema di difesa dell'impianto utilizza il silenziamento dell'RNA, dove i siRNA duplex vengono caricati in RISC. Il filamento passeggero viene rimosso e il filamento guida indirizza il complesso a degradare l'mRNA GFP bersaglio.

Tuttavia, le proteine effettrici si legano ai siRNA, impedendo la loro associazione con RISC e permettendo alla fluorescenza GFP di persistere.

Ciò consente l'identificazione di effettori patogeni che sopprimono il silenziamento dell'RNA vegetale.

Mescolare volumi uguali di una coltura di Agroba