Test di coinfiltrazione per lo screening degli effettori patogeni che sopprimono il silenziamento dell'RNA vegetale

Prendi una miscela contenente volumi uguali di due sospensioni di Agrobacterium tumefaciens , ciascuna con un plasmide: uno codifica la GFP e l'altro una proteina effettrice.

Perforare un foro e usare una siringa senza ago per infiltrare la miscela nella superficie inferiore delle foglie sane e completamente espanse di Nicotiana benthamiana 16c.

Tampona qualsiasi eccesso di sospensione con tessuti molli per prevenire la crescita batterica eccessiva.

Segna le aree infiltrate e incuba le piante in condizioni ottimali di crescita.

Agrobacterium trasferisce i DNA plasmidi nelle cellule vegetali, dove i geni GFP ed effettori vengono trascritti in mRNA e tradotti in proteine.

Il sistema di difesa dell'impianto utilizza il silenziamento dell'RNA, dove i siRNA duplex vengono caricati in RISC. Il filamento passeggero viene rimosso e il filamento guida indirizza il complesso a degradare l'mRNA GFP bersaglio.

Tuttavia, le proteine effettrici si legano ai siRNA, impedendo la loro associazione con RISC e permettendo alla fluorescenza GFP di persistere.

Ciò consente l'identificazione di effettori patogeni che sopprimono il silenziamento dell'RNA vegetale.

Mescolare volumi uguali di una coltura di Agrobacterium contenente una proteina fluorescente verde 35S con una coltura di Agrobacterium contenente soppressore del virus mosaico del cetriolo 35S 2b, un presunto effettore o vettore vuoto. Utilizzando una siringa senza ago da 1 millilitro, infiltra con attenzione e lentamente le sospensioni miste di Agrobacterium sui lati abaxiali delle foglie di Nicotiana bethamiana 16c.

Rimuovere la sospensione batterica residua dalle foglie con salviette per tessuti molli e cerchiare i margini delle chiazze infiltrate con un pennarello.