Valutazione della permeabilità dello strato cellulare nel Mycobacterium tuberculosis persistente non replicante

Si inizia con tubi contenenti lo stadio persistente non replicante, o NRP, di Mycobacterium tuberculosis, che presenta uno strato esterno ispessito.

Aggiungi delle perline di vetro in un tubo e scuotilo per disturbare meccanicamente lo strato esterno dei micobatteri, aumentando la permeabilità.

Successivamente, trasferire la sospensione micobatterica scomposta dalla perla in un tubo fresco.

Aggiungi rifampicina marcata con fluorescenza, un antibiotico antitubercolosico, sia alle sospensioni cellulari non trattate che a quelle battute con perle.

Incubare con scuotere per permettere alla rifampicina marcata con fluorescente di entrare nei micobatteri.

Col tempo, più rifampicina entra nei micobatteri.

Centrifugare i campioni per separare le cellule e rimuovere il soprantantante contenente rifampicina non legata.

Risospendere i micobatteri in un substrato fresco.

Analizza i campioni utilizzando la citometria a flusso. Quando le cellule attraversano un fascio laser, emettono fluorescenza proporzionale alla rifampicina fluorescente intracellulare.

In diversi momenti, le cellule NRP non trattate mostrano una fluorescenza inferiore rispetto a quelle battute dalle perle.

Ciò indica che lo strato esterno ispessito limita l'ingresso nella rifampicina, supportando la persistenza batterica durante l'interazione ospite–patogeno.