Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'effetto di modulatori fenotipici come il silenziamento genico dell'ospite o l'impatto di piccole molecole sul mycobacterium tuberculosis, la replicazione intracellulare. Ciò si ottiene dispensando prima piccole molecole e piastre a 384 pozzetti o sezionando le cellule con irna e trasfettando in complesso. Il passo successivo consiste nell'infettare le cellule con la proteina fluorescente verde che esprime il mycobacterium tuberculosis o G-F-P-M-T-B, aggiungere cellule alla piccola molecola contenente pozzetti e incubare la micropiastra per cinque giorni.

Per l'approccio RNAi, aggiungere cellule al complesso di trasfettazione RNAi contenente pozzetti. Incubare la micropiastra per tre giorni e poi infettare le cellule con G-F-P-M-T-B che esprime il micobatterio della tubercolosi. Dopo aver colorato le cellule, il passaggio finale consiste nel leggere le piastre utilizzando un microscopio confocale automatizzato.

In definitiva, la microscopia a fluorescenza automatizzata seguita da un'analisi basata su immagini viene utilizzata per misurare i cambiamenti nella crescita intracellulare di G-F-P-M-T-V. Il vantaggio principale di questa tecnica del metodo esistente come la caccia all'università che forma colonie è che risparmia un lungo periodo di incubazione e consente una maggiore produttività. A dimostrare questa procedura saranno Christophe Keval o SONG e tre borsisti post-dottorato del mio team di ricerca.

I protocolli per lo screening della libreria di RNA SI e della libreria di composti utilizzano colture RV di MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 di GFP di due settimane. Per preparare la sospensione batterica G-F-P-M-T-B, centrifugare prima la coltura a 4.000 Gs per cinque minuti, scartare i surnatanti Resus, sospendere la coltura in DPBS e centrifugare nuovamente in questo modo. Lavare la coltura tre volte con DPBS.

Dopo il terzo lavaggio, scartare il supernat e risospendere il pellet batterico in 10 millilitri di terreno RPMI 1640 contenente 10% FBS. Lasciare la sospensione per un'ora a temperatura ambiente per permettere agli aggregati batterici di sedimentare. Raccogli il supernat batterico e misura il diametro esterno a 600 nanometri e la fluorescenza GFP.

Utilizzando un lettore di micropiastre per determinare la concentrazione batterica, l'OD a 600 nanometri dovrebbe essere compreso tra 0,6 e 0,8. Calcolare il titolo della sospensione utilizzando una linea di regressione di riferimento, visualizzando il valore RFU in funzione del valore CFU generato prima degli esperimenti su un'altra coltura preparata nelle stesse condizioni. Una concentrazione tipica è di una volta 10 per otto batteri per millilitro.

Iniziare questa procedura sospendendo con Resus la libreria di RNA SI essiccato che è conservata in 96. Piastre madri a pozzetto con un tampone X-S-I-R-N-A a una concentrazione di due micromolari. Trasferire 10 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra figlia da 384 pozzetti, trasferire 2,5 microlitri di RNA SI da ciascun pozzetto della piastra figlia in una piastra di saggio da 384 pozzetti alla stessa piastra di analisi.

Aggiungere 2,5 microlitri ciascuno di un IRNA di controllo negativo e positivo ai rispettivi pozzetti. Se la piastra figlia non verrà utilizzata, sigillarla immediatamente con una guarnizione in alluminio pelabile. La piastra sigillata può essere conservata a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per almeno sei mesi e possibilmente fino a due o tre anni a seconda dell'IRNA.

Raccomandazioni del produttore della libreria. Preparare i reagenti di trasfezione diluendoli in un X-D-P-B-S per ottenere una soluzione sufficiente a fornire 0,1 microlitri per ciascuno. Preincubare bene la soluzione di trasfezione diluita a temperatura ambiente per cinque minuti.

Aggiungere 7,5 microlitri della soluzione di trasfezione diluita a ciascun pozzetto della piastra del saggio a 384 pozzetti e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in ciascun pozzetto della piastra del saggio a 40 microlitri di pneumociti umani di tipo 2, A 5, 4, 9 cellule sospese in terreno RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10%. Mantenere le cellule per un periodo di incubazione di tre giorni a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Queste cellule si dividono ogni 24 ore, quindi circa 12.000 cellule sono in ogni pozzetto tre giorni dopo la trasfezione.

Tre giorni dopo si. La trasfezione dell'RNA di 5 49 cellule prepara una sospensione batterica MTBH 37 RV GFP. Come dimostrato in precedenza.

La sospensione dovrebbe contenere da 2,4 volte 10 a sei batteri per millilitro, che corrisponde a una molteplicità di infezioni di cinque. Rimuovere il terreno nella piastra del saggio a 384 pozzetti e aggiungere 25 microlitri di sospensione batterica per pozzetto. Incubare la piastra del saggio a 384 pozzetti a 37 gradi Celsius per cinque ore in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica.

Dopo cinque ore. Rimuovere il terreno e lavare delicatamente le cellule tre volte con il terreno RPMI integrato con il 10% di FBS per uccidere i batteri extracellulari rimanenti. Trattare le cellule in ogni pozzetto con 50 microlitri.

Un terreno fresco R-P-M-I-F-B-S contenente 50 microgrammi per millilitro di Amikacina. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Infine, rimuovere il terreno contenente Amikacina e aggiungere 50 microlitri di terreno RPMI fresco integrato con il 10% di FBS per. Bene.

Incubare la piastra del saggio a 37 gradi Celsius per cinque giorni in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica prima di eseguire lo screening mediante microscopia confocale. Per iniziare questa procedura, scongelare una piastra madre da 384 pozzetti contenente la libreria di composti solubilizzati in DMSO al 100% a temperatura ambiente, trasferire 0,5 microlitri dei composti dalla piastra madre a una piastra figlia da 384 pozzetti contenente 10 microlitri per pozzetto di RPMI 1640. Terreno integrato con macrofagi umani primari di sei giorni al raccolto successivo al raccolto quattro volte 10 per cinque cellule per millilitro in RPMI 1640.

Medium integrato con il 10% di FPS e 50 nanogrammi per millilitro. MCSF umano ricombinante incubare le cellule primarie diluite con basia a diversi MOI che vanno da uno a cinque in sospensione con lieve agitazione a 90 RPM per due ore a 37 gradi Celsius. Lavare le cellule infette mediante centrifugazione a 350 GS per cinque minuti per rimuovere i batteri extracellulari.

Sospendere nuovamente i pallini in RPMI 1640. Medium integrato con 10% FPS e centrifuga. Ancora una volta, ripeti l'operazione, lava due volte dopo il lavaggio finale.

Resus sospendere le cellule infette in terreno RPMI 1640 integrato con il 10% di FBS e 50 microgrammi per millilitro. L'amikacina incubare la sospensione con un leggero agitamento per un'ora a 37 gradi Celsius, centrifugare a 350 GS per cinque minuti. Rimuovere il terreno contenente amikacina e lavare le cellule infette con RPMI 1640 completo.

Terreno integrato con il 10% di FBS e 50 nanogrammi per millilitro. MCSF umano ricombinante. Ripetere questo lavaggio una volta.

Aggiungere 40 microlitri per pozzetto della sospensione di macrofagi infetta alla stessa piastra di analisi a 384 pozzetti preparata in precedenza, che contiene già 10 microlitri di diluizioni del composto. La concentrazione finale di DMSO in ciascun pozzetto è ora dell'1%Incubare le piastre del saggio per cinque giorni a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica prima di eseguire lo screening mediante microscopia confocale per la libreria di RNA SI. Screening prima dell'acquisizione dell'immagine, aggiungere a ciascun pozzetto della piastra di saggio 10 microlitri di 30 microgrammi per millilitro DPI appena preparati in PBS e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius.

Per lo screening dei composti Prima dell'acquisizione dell'immagine, colorare le cellule vive con un colorante fluorescente rosso lontano permeans per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Caricare le piastre di analisi in un microscopio confocale automatizzato. Impostare i parametri di esposizione, registrare la fluorescenza DPI utilizzando un laser di eccitazione a 405 nanometri con un filtro di emissione a 450 nanometri.

Registra la fluorescenza GFP utilizzando un laser di eccitazione a 488 nanometri con un filtro di emissione a 520 nanometri. Selezionare i pozzetti e i campi in ogni pozzetto da acquisire, che vengono quindi indicati come layout e sottolayout. I parametri generano il file degli esperimenti utilizzando i parametri impostati ed eseguono l'acquisizione automatica.

In questo caso, vengono registrate quattro immagini diverse dello stesso pozzo e campo, che trasferiscono le immagini a un server remoto. Successivamente le immagini vengono valutate utilizzando il software di analisi delle immagini acapella 2.6 per lo screening dell'RNA SI. Ogni campo contiene due canali o colori.

Verde per i batteri e blu per la cellula. I nuclei rilevano i nuclei cellulari dal canale DAPI utilizzando un algoritmo di rilevamento dei nuclei e l'area batterica dal canale GFP utilizzando un algoritmo delle proprietà di intensità dei pixel. Unendo i canali e contando il numero di pixel condivisi sia dai batteri che dalle cellule, si quantificano i batteri intracellulari.

I risultati finali espressi come media dei quattro campi sono l'area batterica totale, il numero totale di cellule, la percentuale di cellule infette e l'area batterica per cellula. Per lo screening dei composti, ogni campo contiene due canali o colori, verde per i batteri e rosso lontano per la cellula. I nuclei e il citoplasma rilevano l'area cellulare dal canale rosso lontano e l'area batterica dal canale GFP utilizzando un algoritmo di proprietà dell'intensità dei pixel.

Unendo i canali e contando il numero di pixel condivisi sia dai batteri che dai nuclei, si quantificano i batteri intracellulari. I risultati finali espressi come media dei quattro campi sono l'area batterica totale, l'area cellulare totale, l'area totale dei batteri intracellulari e il rapporto tra l'area batterica intracellulare e l'area totale delle cellule. I risultati rappresentativi dello screening dell'RNA SI ad alto rendimento sono presentati qui, silenziando l'espressione di din one con SI RNA ha portato a una diminuzione della quantità di micobatteri intracellulari in 5 49 cellule.

Come mostrato in queste immagini confocali rappresentative di 5, 49 cellule trasfettate con IRNA non-target o con RNA SI specifico per din uno e infettate con GFP che esprime MTB per cinque giorni. GFP MT BH 37 RV è stato visualizzato in verde e le celle in rosso. Il numero di cellule e il carico intracellulare del G-F-P-M-T-B-H 37 RV sono stati determinati utilizzando un software di analisi basato su immagini.

Questo grafico mostra la percentuale di cellule infette in 5 49 cellule in cinque repliche di IRNA scramble rappresentate da cerchi blu e din uno irna rappresentato da cerchi rossi. Dopo tre giorni di silenziamento e cinque giorni di infezione, la percentuale di cellule infette si riduce della metà in un din uno silenziato a 5 49 cellule rispetto alle cellule trasfettate con IRNA scramble non-target. Per definire lo Z-score è stata applicata una normalizzazione basata su campioni di SI RNA mirato a DIN rispetto allo scramble.

Una media del punteggio Z intorno a 15 è stata ottenuta per SI e DIN mirato. I tre asterisco rappresentano un valore P inferiore a 0,0001. Questi risultati indicano che DIN one può essere utilizzato come controllo positivo per il si, uno screening per scoprire altri nuovi fattori dell'ospite coinvolti nella colonizzazione di MTB e pneumociti che potrebbero avere lo stesso fenotipo di quello con dins IRNA nello screening di composti ad alto contenuto.

L'efficienza dei composti sulla crescita batterica intracellulare è stata valutata stabilendo una curva dose-risposta o DRC e normalizzandola ai composti positivi e negativi di riferimento. In questo esempio, i macrofagi primari umani infettati da A GFP che esprime il ceppo MTBH 37 RV sono stati incubati con DMSO all'1% come controllo negativo o con concentrazioni crescenti di due composti di riferimento, isid, INH e rifampicina. RIF. I macrofagi sono marcati con un colorante a fluorescenza rosso e il colore verde indica che l'analisi MTB delle immagini di fluorescenza confocale dei macrofagi umani infetti ha rivelato che i composti attivi influenzano la replicazione intracellulare di MTB nelle cellule ospiti portando a una diminuzione della carica micobatterica, che corrisponde all'area del segnale GFP nelle cellule.

Il rapporto tra l'area batterica intracellulare e l'area cellulare totale è stato calcolato e quindi tracciato in funzione della concentrazione dei composti per generare il DRC, mostrato qui sono i DRC di isid e rifampicina in ogni grafico. Il DRC del composto è stato normalizzato a quello dell'1% di DMSO, il controllo negativo e 0,1 microgrammi per millilitro è il controllo positivo. Queste curve consentono di determinare sia la concentrazione necessaria per inibire il 50% della colonizzazione batterica sia la concentrazione minima richiesta per inibire il 99% della replicazione batterica in un semestre.

Questa tecnica può essere eseguita in 10 ore suddivise come segue, due ore per la trasfezione cellulare o la preparazione del composto, sei ore per l'infezione cellulare e la dispensazione in micropiastra e due ore per sostenere l'acquisizione di un'immagine. Questo per un periodo di otto giorni, non dimenticare che lavorare con il mycobacterium tuberculosis può essere estremamente artistico e che precocemente, come indossare dispositivi di protezione individuale, inclusa una maschera, dovrebbe sempre essere preso durante l'esecuzione di questa procedura.