Visualizzazione dello stress ossidativo indotto da patogeni in C. elegans utilizzando SKN-1 marcato con GFP

Si inizia con due piastre contenenti vermi C. elegans che esprimono SKN-1 con proteine fluorescenti verdi, un fattore di trascrizione localizzato nel citoplasma intestinale. Questi vermi contengono anche granuli di lipofuscina intestinale che mostrano autofluorescenza.

Una piastra è seminata con batteri non patogeni come gruppo di controllo, l'altra con batteri patogeni come gruppo di test.

Nel gruppo di prova, il perossido di idrogeno prodotto dal patogeno induce stress ossidativo, scatenando la traslocazione di SKN-1 nei nuclei intestinali.

Nel gruppo di controllo, la maggior parte di SKN-1 rimane diffusamente distribuita nel citoplasma.

Lava ogni piastra con un tampone e trasferisci i vermi nei tubi.

Centrifuga per separare i lombrini e rimuovere il tampon.

Aggiungi un mezzo contenente azida di sodio per anestetizzarli.

Montare i vermi su cuscinetti di agarosio, posizionare le coperture e osservare al microscopio a fluorescenza. Usa l'autofluorescenza per visualizzare i confini nucleari.

Un forte segnale nucleare SKN-1 nel test, rispetto al segnale citoplasmatico diffuso nei controlli, indica la rilocalizzazione nucleare e conferma lo stress ossidativo indotto dal patogeno.

Utilizzando una pipetta, aggiungi circa 100 larve L4 a ciascuna piastra con semi di THY streptococcus e con E. coli con NGM. Usa tre piastre per ceppo di batteri.

Incubare le placche per 2-3 ore a 25 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatore. Lavali con M9W e raccogli i vermi in tubi conici da 15 millilitri.

Lava i vermi tre volte rispetto a quanto fatto in precedenza nella fase centrifuga. Rimuovi la maggior parte dell'M9W tramite aspirazione. E aggiungere 500 microlitri di M9W contenenti 2 millimolari azide di sodio o cloridrato tetramisole al pellet per l'anestesia.

Incuba il tubo con pellet di vermi a temperatura ambiente per 15 minuti. Poi, immergi 15 microlitri della sospensione a vermi su un tampone di agarosio preparato. Al microscopio fluorescente, visualizza la localizzazione di SKN-1 utilizzando filtri FITC e DAPI.

Vermi immagine a ingrandimenti di 10 volte e 20 volte. Puntua i worm in base a tre livelli di localizzazione; bassa localizzazione, dove non si osserva localizzazione nucleare, localizzazione media, con SKN-1 BCGFP nella parte anteriore o posteriore del verme, e alta localizzazione, dove la localizzazione nucleare di SKN-1 BCGFP è osservata in tutte le cellule intestinali.