Name: Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri un metodo di screening ad alto contenuto in formato liquido con piccoli volumi per studiare le interazioni ospite-patogeno e facilitare la scoperta di farmaci usando C. elegans e P. aeruginosa.

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Questo studio è stato sostenuto dal Research Institute del Texas (CPRIT) premio RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 e la prevenzione di cancro e dell'istituti nazionali di salute K22 AI110552 assegnato a NVK. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse a divulgare.

Questo saggio (o simili saggi dove altri agenti patogeni vengono sostituiti con p. aeruginosa o E. faecalis) sono utile per una varietà di scopi, tra cui la scoperta di nuovi farmaci. È anche utile per affrontare questioni biologiche fondamentali, come identificare i fattori di virulenza, la delucidazione dei meccanismi di difesa ospite e determinare il regolamentazione macchinari coinvolti nell'interazione ospite-patogeno.
Anche se il dosaggio di uccisione liquido p. aer...

L'identificazione e lo sviluppo di efficaci antibiotici ad ampio spettro, ora quasi un secolo fa, ha portato a un momento di svolta nella sanità pubblica dove c'era una credenza diffusa che infettiva malattia sarebbe un flagello del passato. Entro pochi decenni, questo ottimismo iniziò a scemare, come agente patogeno dopo agente patogeno ha sviluppato meccanismi di resistenza che limitato questi trattamenti una volta miracolosi. Per qualche tempo, la corsa agli armamenti tra azioni di individuazione di droga e gli agenti patogeni sembrava equilibrata. Tuttavia, l'uso improprio degli antimicrobici è recentemente culminato nell'emergere di ceppi di Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescense p. aeruginosa1, pan-farmaco resistenti 2,3,4.
P. aeruginosa è un patogeno di negativo, multi-host di grammo di opportunisti, che è una grave minaccia ai pazienti con gravi ustioni, coloro che sono immunocompromessi, o hanno la fibrosi cistica. È inoltre sempre più identificato come un agente eziologico nelle infezioni nosocomial severa, particolarmente dovuto la sua acquisizione in corso della resistenza antimicrobica. Per cominciare ad affrontare questa minaccia, abbiamo usato la ben documentata elegans del c.-p. aeruginosa infezione sistema5. Il nostro laboratorio ha sfruttato questo sistema per sviluppare una piattaforma di base liquida, ad alta velocità, ad alto contenuto di screening per identificare nuove molecole che limitano la capacità del patogeno di uccidere l' host6. Curiosamente, questi composti sembrano appartenere ad almeno tre categorie generali, compresi gli antimicrobici7 e virulenza inibitori8. Altri saggi di scoperta di droga ad alto contenuto in c. elegans sono stati segnalati per del micobatterio tuberculosum, Chlamydia trachomatis, pestis di Yersinia, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Enterococcus faecalis, tra gli altri9,10,11,12,13,14,15,16. Questi tipi di analisi presentano parecchi vantaggi ben riconosciuti, ad esempio limitando falsi positivi successi che possono essere tossici per sia l'host e l'agente patogeno, probabilità aumentata della biodisponibilità rispetto a uno schermo di chimico e la capacità di identificare successi di là semplicemente limitando la crescita microbica, come anti-virulents, stimolatore immunitario molecole o composti che altrimenti inclinare la bilancia dell'interazione ospite-patogeno in favore della ex. Inoltre, i composti scoperti in queste schermate sono spesso efficaci in mammiferi padroni di casa.
Vale la pena notare che almeno due altri saggi17,18 sono disponibili per realizzare schermi di alto-rendimento in c. elegans in liquido. Tuttavia, ciascuno di questi test è una modifica che permette il dosaggio di colonizzazione intestinale prototipo, conosciuto come lento-uccisione, da eseguirsi in liquido, aumentando la produttività e consentendo di composti più facilmente essere schermato. Un'attenta caratterizzazione ha dimostrato conclusivamente che i meccanismi di virulenza batterica sono diversi tra questi saggi e nostra base liquida schermo7. Poiché entrambi i tipi di virulenza sono osservati nei sistemi mammiferi, è importante considerare quali determinanti di virulenza sono più rilevante per gli interessi dello sperimentatore prima della selezione di test.
Qui dimostriamo una versione ottimizzata del liquido basato su analisi di c. elegans-P. aeruginosa . Segnaliamo anche l'adattamento del nostro metodo di analisi liquido-basata per ospitare l'agente patogeno batterico gram-positivo Enterococcus faecalis. Come p. aeruginosa, E. faecalis è sempre più identificato come una minaccia seria nosocomial con un armamento crescente di resistenza antimicrobica vie1. Anche se esiste un metodo precedente per high throughput screening di E. faecalis 14, richiede preinfection con l'agente patogeno, che complica la procedura e aumenta la probabilità di contaminazione di attrezzature come il FlowSort COPAS. Il nostro protocollo Elimina la necessità di pre-infezione, miglioramento del profilo di sicurezza. Infine, segnaliamo un mezzo mediante il quale uno di questi test possono essere combinato con alimentazione di RNAi, permettendo all'utente di cercare per fattori ospite che giocano un ruolo nella creazione di, o resistenza a, infezione.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica Citometro</td><td></td> a <td>flusso per oggetti di grandi dimensioni/selezionatore di vermi</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Dispenser di rondelle</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Blocco RB a pozzetti profondi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 384 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura per nematodi (NGM)</td><td></td><td></td><td>Quantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di NaCl, 2,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 mL di MgSO4 (1 M), 25 mL di tampone fosfato e 973 mL di</td></tr><tr><td>piastre</td><td></td><td></td> <td>Slow Killing (SK) d'acqua milli-QQuantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di NaCl, 3,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 ml di MgSO4 (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di milli-Q di terreno</td></tr> di <tr><td>coltura</td><td></td><td></td> Slow Killing (SK) in acqua <td>Quantità per litro: 3 grammi di NaCl, 3,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 mL di MgSO4 (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di milli-Q di</td></tr><tr><td>acqua Brodo di lisogenesi (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr>Soluzione <td></td><td></td><td></td><td>di candeggina per vermiQuantità per 100 ml: 10 ml di soluzione di NaOH 5 M, 20 ml di soluzione di ipoclorito di sodio al 5% e 70 ml di acqua sterile</td></tr><tr><td>S Quantità basale</td><td></td><td></td><td>per litro: 5,85 grammi di NaCl, 6 grammi di KH2PO4, 1 grammo di K2HPO4, e 1 litro di acqua milli-Q</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Quantità di tampone</td><td></td><td></td> fosfato <td>per litro: 132 mL di K2HPO4 (1M) e 868 mL di KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ipoclorito di sodio al 5%</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Macchia di acido nucleico arancione</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td><forte>Ceppi batterici</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi esprime batteri (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Strains </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan e Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Il numero di nuovi farmaci identificati da tradizionale, schermi in vitro è scemato, riducendo il successo di questo approccio nella ricerca di nuove armi combattere la Resistenza multifarmaco. Questo ha portato alla conclusione che i ricercatori non solo la necessità di trovare nuovi farmaci, ma anche bisogno di sviluppare nuovi modi di trovare loro. Tra i candidati più promettenti metodi sono intero-organismo, in vivo dosaggi che uso alto-rendimento, fenotipica letture e ospita che vanno da Caenorhabditis elegans di Danio rerio. Questi host presentano parecchi vantaggi potenti, tra cui le riduzioni drammatiche in falsi positivi colpisce, come composti che sono tossici per l'ospite e/o biounavailable vengono in genere eliminati nella schermata iniziale, prima di seguire costosi fino.
Qui vi mostriamo come nostra analisi sono stato utilizzato per interrogare variazione host la ben documentata di c. elegans— patosistema come contributo liquido uccisione diPseudomonas aeruginosa . Inoltre dimostriamo diverse estensioni di questa tecnica ben lavorata fuori. Per esempio, siamo in grado di svolgere high throughput genetiche schermate mediante RNAi in 24 o 96 pozzetti formati piastra di fattori dell'ospite query in questa interazione ospite-patogeno. Usando questa analisi, schermi intero genoma possono essere completati in pochi mesi, che possono di semplificare notevolmente il compito di individuare bersagli farmacologici, potenzialmente senza la necessità di approcci biochimici laboriosa purificazione.
Inoltre segnaliamo qui una variazione del nostro metodo che sostituisce il batterio gram-positivo Enterococcus faecalis per l'agente patogeno gram-negativo p. aeruginosa. Molto come è il caso per p. aeruginosa, uccisione di E. faecalis è dipendente dal tempo. A differenza del precedente c. elegans— saggi diE. faecalis , nostra analisi per E. faecalis non richiede preinfection, migliorando il suo profilo di sicurezza e riducendo le possibilità di contaminazione liquido-per la movimentazione. Il dosaggio è estremamente robusto, mostrando ~ 95% tassi di mortalità 96h post infezione.

Parametri importanti per le prestazioni
Una corretta comprensione della biologia alla base di questa analisi è necessaria per risolvere i problemi e ottimizzare il dosaggio. A tal fine, ci riferiamo in primo luogo a parecchie carte chiave delucidamento dei meccanismi di patogenesi di p. aeruginosa-mediata uccidendo in liquido7,20. Condizione che i passa...

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Questo metodo può rispondere a domande sull'interazione ospite-patogeno e sulla scoperta di farmaci, come l'importanza di vari fattori di virulenza e la capacità di piccole molecole di migliorare con la genesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che avviene in un formato liquido con piccoli volumi. Per iniziare, mentre si lavora all'interno di una cappa di biosicurezza BSL 2, striare P.aeruginosa da un brodo congelato su una piastra LB Agar.Incubare la piastra a 37 gradi C per 16-24 ore, quindi conservare la piastra a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Due giorni prima dell'installazione delle piastre di analisi, utilizzare una singola colonia dalla piastra per inoculare da tre a cinque millilitri di brodo LB sterile. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 12-16 ore.Dopo aver preparato il terreno a lenta uccisione o SK secondo il protocollo di testo, con 350 millilitri di p. Aeruginosa dalla coltura LB fresca durante la notte, seminare ogni piastra SK da 10 centimetri. Utilizzare uno spandiconcime batterico sterile per diffondere uniformemente i batteri e lasciare asciugare le piastre nella cabina di biosicurezza.Quindi, incubare le piastre a 37 gra

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I ricercatori possono innescare un movimento su richiesta in C. elegans applicando un campo elettrico che i vermi percepiscono e a cui rispondono. Questo video introduce il comportamento elettrotattico e mostra un protocollo campione che viene eseguito in un dispositivo microfluidico.

Saggio di elettrotassi: un metodo per osservare la locomozione in C. elegans

Questo articolo descrive la risposta comportamentale del pesce zebra ai composti tossici monitorando la locomozione larvale. Il protocollo esamina inoltre un esempio di risposta delle larve di zebrafish agli inquinanti ambientali.

Saggio di locomozione larvale: metodo ad alto rendimento per studiare la tossicità neurocomportamentale di un composto nelle larve di pesce zebra

Fonte: Anderson, Q. L. et al. Un patosistema C . elegans ad alto rendimento, ad alto contenuto e a base liquida. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra un metodo di screening ad alto rendimento che utilizza Caenorhabditis elegans per studiare i knockdown genici durante le interazioni ospite-patogeno. Descrive la procedura per preparare i vermi knockdown e trasferirli su piastre di saggio per valutare gli effetti dell'uccisione dei vermi indotta da agenti patogeni.

Un test a base liquida multipozzetto per lo screening di abbattimenti di C. elegans

Fonte: Anderson, Q. L., et al. Un patosistema C . elegans ad alto rendimento, ad alto contenuto e a base liquida. J. Vis. Exp. (2018)Il video mostra un test a base liquida in cui larve di C. elegans geneticamente modificate sono esposte a batteri patogeni in una micropiastra. Le tossine batteriche secrete nel mezzo inducono stress e morte dell'ospite. Un colorante fluorescente colora i vermi morti, consentendo la quantificazione della mortalità basata sull'imaging per valutare la suscettibilità...

Valutazione della mortalità indotta da batteri patogeni nelle larve di C. elegans

Descriviamo le fasi dettagliate di un test chimico ad alto rendimento nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzato per valutare la tossicità germinale. In questo test, l'interruzione della funzione germinale a seguito di esposizione chimica viene monitorata utilizzando un reporter fluorescente specifico per embrioni aneuploidi.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Qui, presentiamo un approccio combinatorio utilizzando microscopia ad alta risoluzione, strumenti computazionali, e l'etichettatura a cella singola in vivente embrioni C. elegans per comprendere le singole dinamiche delle cellule durante il neurosviluppo.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Questo protocollo descrive l'imaging time-lapse basato su microfluidica di C. elegans durante l'intero sviluppo post-embrionale.

Imaging ad alta risoluzione di C. elegans in tutti gli stadi larvali

Qui forniamo istruzioni su come utilizzare efficacemente SegElegans, un sistema di deep learning che abbiamo sviluppato per la segmentazione automatizzata di singoli vermi in immagini di microscopia a campo largo, per il successivo utilizzo in software di analisi delle immagini come ImageJ. Forniamo modi per utilizzare il sistema sia online che offline.

Analisi automatizzata delle immagini a fluorescenza di C. elegans utilizzando SegElegans

Scopri un metodo di screening ad alto contenuto in formato liquido con piccoli volumi per studiare le interazioni ospite-patogeno e facilitare la scoperta di farmaci usando C. elegans e P. aeruginosa.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

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