Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

Questo metodo può rispondere a domande sull'interazione ospite-patogeno e sulla scoperta di farmaci, come l'importanza di vari fattori di virulenza e la capacità di piccole molecole di migliorare con la genesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che avviene in un formato liquido con piccoli volumi. Per iniziare, mentre si lavora all'interno di una cappa di biosicurezza BSL 2, striare P.aeruginosa da un brodo congelato su una piastra LB Agar.

Incubare la piastra a 37 gradi C per 16-24 ore, quindi conservare la piastra a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Due giorni prima dell'installazione delle piastre di analisi, utilizzare una singola colonia dalla piastra per inoculare da tre a cinque millilitri di brodo LB sterile. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 12-16 ore.

Dopo aver preparato il terreno a lenta uccisione o SK secondo il protocollo di testo, con 350 millilitri di p. Aeruginosa dalla coltura LB fresca durante la notte, seminare ogni piastra SK da 10 centimetri. Utilizzare uno spandiconcime batterico sterile per diffondere uniformemente i batteri e lasciare asciugare le piastre nella cabina di biosicurezza.

Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per testare più ceppi batterici di RNAi in parallelo in un singolo pozzetto di una piastra a pozzetti profondi da 24 pozzetti, inoculare una singola colonia da ciascun clone di RNAi contenente batteri precedentemente preparati in quattro millilitri di LB integrato con carbenicillina. Posizionare le piastre in un incubatore a scuotimento ottimizzato per piastre multipozzetto a 37 gradi Celsius e 950 giri/min per 16 ore, quindi raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 2.000 g per 5 minuti. Decantare il surnatante capovolgendo la piastra e agitandola energicamente.

Utilizzando 100 microlitri di S Basal risospendere i batteri RNAi. Pipettare i batteri risospesi in un numero appropriato di pozzetti di una piastra NGM a più pozzetti integrata con IPTG e carbenicillina e lasciare asciugare la piastra. Dopo aver preparato i vermi L1 secondo il protocollo di testo, preparare le piastre per gli esperimenti di base pipettando circa 5.000 vermi per piastra da 10 centimetri, seminati con RNAi o superfood OP50.

Per prepararsi a uno screening dell'RNAi, pipettare circa 300 vermi per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti seminata con RNAi. Se il ceppo utilizzato è a temperatura sterile, incubare i vermi a 15 gradi Celsius per circa 16 ore e poi trasferirli a 25 gradi Celsius per 44 ore per completare lo sviluppo e prevenire l'embriogenesi. Per effettuare un saggio di uccisione dei liquidi, utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere la P.aeruginosa da una piastra SK e risospendere i batteri in circa 5 millilitri di S.Basal.

Utilizzando uno spettrofotometro misurare l'OD 600 della sospensione batterica. Preparare 24 millilitri di stock diluito di P.Aeruginosa in S.Basal a un OD 600 pari a 09, quindi aggiungere 21 millilitri di terreno SK liquido e, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 45 microlitri di batteri e terreni in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. Lava i vermi dalla loro fonte in un tubo conico da 50 millilitri e lasciali depositare sotto la forza gravitazionale.

Aspirare il surnatante a 5 millilitri, quindi utilizzare un totale di 50 millilitri di S.Basal per risospendere i vermi e ripetere il lavaggio altre due volte. Utilizzando una selezionatrice di vermi, smistare circa 22 vermi in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti, secondo il protocollo di testo, quindi utilizzare una pellicola permeabile ai gas per sigillare la piastra e incubarla a 25 gradi Celsius per 24-48 ore. All'ora desiderata, utilizzare una lavatrice per micropiastre e S.Basal per lavare la piastra a 384 pozzetti per un totale di 5 volte.

Uno degli errori più facili da commettere è quello di aspirare la piastra a 384 pozzetti prima che i vermi si siano completamente depositati. Ci vuole pratica per vedere con precisione se i vermi si sono depositati completamente. Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino a 20 microlitri.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di colorante di acido nucleico 98 micromolari per pozzetto, per una concentrazione finale di 0,7 micromolari. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 12-16 ore. Dopo il periodo di incubazione desiderato, utilizzare la lavatrice per micropiastre per lavare le piastre almeno tre volte.

Per l'acquisizione dei dati, utilizzare uno spettrofotometro o un microscopio automatizzato per visualizzare sia la luce trasmessa che la fluorescenza. Aggiungere un millilitro di S Basal per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 300 vermi per pozzetto. Agitare delicatamente i vermi agitando la piastra, quindi trasferirli in una piastra vuota e sterile a 24 pozzetti.

Lascia che i vermi si stabiliscano gravitazionalmente, circa cinque minuti. Aspirare il surnatante, lasciando circa un millilitro per pozzetto, quindi aggiungere 7 millilitri di S Basal a ciascun pozzetto. Ripetere il lavaggio altre due volte, quindi dopo il lavaggio finale aspirare tutti i microlitri di surnatante tranne circa 400

Dopo aver pipettato i batteri in piastre da 384 pozzetti per evitare la fame, utilizzando la funzione di ricampionamento del selezionatore di vermi, smistare 22 vermi in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. Infine, dopo la cernita, aggiungere piccole molecole o altri materiali specifici per l'esperimento. Come illustrato in questo grafico, quando si seguono i passaggi descritti in questo video, si osserverà un'uccisione dipendente dal tempo di C.elegans solo in presenza di P.aeruginosa.

Al contrario, in assenza di integratori alimentari batterici chiave, si osserverà poca o nessuna uccisione. Come mostrato qui, l'incubazione in due fasi di P. aeruginosa a 37 gradi Celsius e poi a 25 gradi Celsius, che è fondamentale per i saggi convenzionali di uccisione lenta, ed è stata originariamente implementata nell'uccisione liquida, è superflua in questo test. Il protocollo tollera un'ampia gamma di concentrazioni batteriche iniziali, da un minimo di 600 OD pari a 0025, e mostra ancora uccisioni dipendenti dal tempo e dalla concentrazione, anche se i tempi cambiano.

Inoltre, anche solo quattro pozzi sono spesso sufficienti per ottenere dati statisticamente significativi. Un esempio dell'utilità dell'elaborazione è mostrato qui quando il rapporto segnale/rumore è elevato, poiché in questo esempio l'analisi è semplice e discriminare tra condizioni positive e negative è banale. In questi casi, anche i colpi deboli possono essere facilmente identificati.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 60-75 minuti di tempo di utilizzo manuale per piastra da 384 pozzetti, escluso lo smistamento. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale ricordarsi di aggiungere tutti i componenti al supporto o la virulenza sarà compromessa. Questo test semplifica l'applicazione dello screening basato sul fenotipo dell'intero organismo alla scoperta di farmaci nella ricerca ospite-patogeno.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire saggi di patogenesi del C elegans a base liquida. Questa procedura può essere modificata sostituendo con altri agenti patogeni, come E.Faecalis per P.Aeruginosa, facilitando la ricerca di trattamenti per altre infezioni batteriche. Non dimenticare che lavorare con batteri infettivi come P.Aeruginosa o E.Faecalis può essere pericoloso.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni adeguate, come un'adeguata formazione, buoni dispositivi di protezione individuale e una tecnica adeguata.