Name: Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri un metodo di screening ad alto contenuto in formato liquido con piccoli volumi per studiare le interazioni ospite-patogeno e facilitare la scoperta di farmaci usando C. elegans e P. aeruginosa.

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Questo studio è stato sostenuto dal Research Institute del Texas (CPRIT) premio RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 e la prevenzione di cancro e dell'istituti nazionali di salute K22 AI110552 assegnato a NVK. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

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<li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse a divulgare.

Questo saggio (o simili saggi dove altri agenti patogeni vengono sostituiti con p. aeruginosa o E. faecalis) sono utile per una varietà di scopi, tra cui la scoperta di nuovi farmaci. È anche utile per affrontare questioni biologiche fondamentali, come identificare i fattori di virulenza, la delucidazione dei meccanismi di difesa ospite e determinare il regolamentazione macchinari coinvolti nell'interazione ospite-patogeno.
Anche se il dosaggio di uccisione liquido p. aer...

L'identificazione e lo sviluppo di efficaci antibiotici ad ampio spettro, ora quasi un secolo fa, ha portato a un momento di svolta nella sanità pubblica dove c'era una credenza diffusa che infettiva malattia sarebbe un flagello del passato. Entro pochi decenni, questo ottimismo iniziò a scemare, come agente patogeno dopo agente patogeno ha sviluppato meccanismi di resistenza che limitato questi trattamenti una volta miracolosi. Per qualche tempo, la corsa agli armamenti tra azioni di individuazione di droga e gli agenti patogeni sembrava equilibrata. Tuttavia, l'uso improprio degli antimicrobici è recentemente culminato nell'emergere di ceppi di Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescense p. aeruginosa1, pan-farmaco resistenti 2,3,4.
P. aeruginosa è un patogeno di negativo, multi-host di grammo di opportunisti, che è una grave minaccia ai pazienti con gravi ustioni, coloro che sono immunocompromessi, o hanno la fibrosi cistica. È inoltre sempre più identificato come un agente eziologico nelle infezioni nosocomial severa, particolarmente dovuto la sua acquisizione in corso della resistenza antimicrobica. Per cominciare ad affrontare questa minaccia, abbiamo usato la ben documentata elegans del c.-p. aeruginosa infezione sistema5. Il nostro laboratorio ha sfruttato questo sistema per sviluppare una piattaforma di base liquida, ad alta velocità, ad alto contenuto di screening per identificare nuove molecole che limitano la capacità del patogeno di uccidere l' host6. Curiosamente, questi composti sembrano appartenere ad almeno tre categorie generali, compresi gli antimicrobici7 e virulenza inibitori8. Altri saggi di scoperta di droga ad alto contenuto in c. elegans sono stati segnalati per del micobatterio tuberculosum, Chlamydia trachomatis, pestis di Yersinia, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Enterococcus faecalis, tra gli altri9,10,11,12,13,14,15,16. Questi tipi di analisi presentano parecchi vantaggi ben riconosciuti, ad esempio limitando falsi positivi successi che possono essere tossici per sia l'host e l'agente patogeno, probabilità aumentata della biodisponibilità rispetto a uno schermo di chimico e la capacità di identificare successi di là semplicemente limitando la crescita microbica, come anti-virulents, stimolatore immunitario molecole o composti che altrimenti inclinare la bilancia dell'interazione ospite-patogeno in favore della ex. Inoltre, i composti scoperti in queste schermate sono spesso efficaci in mammiferi padroni di casa.
Vale la pena notare che almeno due altri saggi17,18 sono disponibili per realizzare schermi di alto-rendimento in c. elegans in liquido. Tuttavia, ciascuno di questi test è una modifica che permette il dosaggio di colonizzazione intestinale prototipo, conosciuto come lento-uccisione, da eseguirsi in liquido, aumentando la produttività e consentendo di composti più facilmente essere schermato. Un'attenta caratterizzazione ha dimostrato conclusivamente che i meccanismi di virulenza batterica sono diversi tra questi saggi e nostra base liquida schermo7. Poiché entrambi i tipi di virulenza sono osservati nei sistemi mammiferi, è importante considerare quali determinanti di virulenza sono più rilevante per gli interessi dello sperimentatore prima della selezione di test.
Qui dimostriamo una versione ottimizzata del liquido basato su analisi di c. elegans-P. aeruginosa . Segnaliamo anche l'adattamento del nostro metodo di analisi liquido-basata per ospitare l'agente patogeno batterico gram-positivo Enterococcus faecalis. Come p. aeruginosa, E. faecalis è sempre più identificato come una minaccia seria nosocomial con un armamento crescente di resistenza antimicrobica vie1. Anche se esiste un metodo precedente per high throughput screening di E. faecalis 14, richiede preinfection con l'agente patogeno, che complica la procedura e aumenta la probabilità di contaminazione di attrezzature come il FlowSort COPAS. Il nostro protocollo Elimina la necessità di pre-infezione, miglioramento del profilo di sicurezza. Infine, segnaliamo un mezzo mediante il quale uno di questi test possono essere combinato con alimentazione di RNAi, permettendo all'utente di cercare per fattori ospite che giocano un ruolo nella creazione di, o resistenza a, infezione.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica Citometro</td><td></td> a <td>flusso per oggetti di grandi dimensioni/selezionatore di vermi</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Dispenser di rondelle</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Blocco RB a pozzetti profondi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 384 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura per nematodi (NGM)</td><td></td><td></td><td>Quantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di NaCl, 2,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 mL di MgSO4 (1 M), 25 mL di tampone fosfato e 973 mL di</td></tr><tr><td>piastre</td><td></td><td></td> <td>Slow Killing (SK) d'acqua milli-QQuantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di NaCl, 3,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 ml di MgSO4 (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di milli-Q di terreno</td></tr> di <tr><td>coltura</td><td></td><td></td> Slow Killing (SK) in acqua <td>Quantità per litro: 3 grammi di NaCl, 3,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl2 (1 M), 1 mL di MgSO4 (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di milli-Q di</td></tr><tr><td>acqua Brodo di lisogenesi (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr>Soluzione <td></td><td></td><td></td><td>di candeggina per vermiQuantità per 100 ml: 10 ml di soluzione di NaOH 5 M, 20 ml di soluzione di ipoclorito di sodio al 5% e 70 ml di acqua sterile</td></tr><tr><td>S Quantità basale</td><td></td><td></td><td>per litro: 5,85 grammi di NaCl, 6 grammi di KH2PO4, 1 grammo di K2HPO4, e 1 litro di acqua milli-Q</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Quantità di tampone</td><td></td><td></td> fosfato <td>per litro: 132 mL di K2HPO4 (1M) e 868 mL di KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ipoclorito di sodio al 5%</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Macchia di acido nucleico arancione</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td><forte>Ceppi batterici</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi esprime batteri (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Strains </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan e Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Il numero di nuovi farmaci identificati da tradizionale, schermi in vitro è scemato, riducendo il successo di questo approccio nella ricerca di nuove armi combattere la Resistenza multifarmaco. Questo ha portato alla conclusione che i ricercatori non solo la necessità di trovare nuovi farmaci, ma anche bisogno di sviluppare nuovi modi di trovare loro. Tra i candidati più promettenti metodi sono intero-organismo, in vivo dosaggi che uso alto-rendimento, fenotipica letture e ospita che vanno da Caenorhabditis elegans di Danio rerio. Questi host presentano parecchi vantaggi potenti, tra cui le riduzioni drammatiche in falsi positivi colpisce, come composti che sono tossici per l'ospite e/o biounavailable vengono in genere eliminati nella schermata iniziale, prima di seguire costosi fino.
Qui vi mostriamo come nostra analisi sono stato utilizzato per interrogare variazione host la ben documentata di c. elegans— patosistema come contributo liquido uccisione diPseudomonas aeruginosa . Inoltre dimostriamo diverse estensioni di questa tecnica ben lavorata fuori. Per esempio, siamo in grado di svolgere high throughput genetiche schermate mediante RNAi in 24 o 96 pozzetti formati piastra di fattori dell'ospite query in questa interazione ospite-patogeno. Usando questa analisi, schermi intero genoma possono essere completati in pochi mesi, che possono di semplificare notevolmente il compito di individuare bersagli farmacologici, potenzialmente senza la necessità di approcci biochimici laboriosa purificazione.
Inoltre segnaliamo qui una variazione del nostro metodo che sostituisce il batterio gram-positivo Enterococcus faecalis per l'agente patogeno gram-negativo p. aeruginosa. Molto come è il caso per p. aeruginosa, uccisione di E. faecalis è dipendente dal tempo. A differenza del precedente c. elegans— saggi diE. faecalis , nostra analisi per E. faecalis non richiede preinfection, migliorando il suo profilo di sicurezza e riducendo le possibilità di contaminazione liquido-per la movimentazione. Il dosaggio è estremamente robusto, mostrando ~ 95% tassi di mortalità 96h post infezione.

Parametri importanti per le prestazioni
Una corretta comprensione della biologia alla base di questa analisi è necessaria per risolvere i problemi e ottimizzare il dosaggio. A tal fine, ci riferiamo in primo luogo a parecchie carte chiave delucidamento dei meccanismi di patogenesi di p. aeruginosa-mediata uccidendo in liquido7,20. Condizione che i passa...

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Questo metodo può rispondere a domande sull'interazione ospite-patogeno e sulla scoperta di farmaci, come l'importanza di vari fattori di virulenza e la capacità di piccole molecole di migliorare con la genesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che avviene in un formato liquido con piccoli volumi. Per iniziare, mentre si lavora all'interno di una cappa di biosicurezza BSL 2, striare P.aeruginosa da un brodo congelato su una piastra LB Agar.Incubare la piastra a 37 gradi C per 16-24 ore, quindi conservare la piastra a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Due giorni prima dell'installazione delle piastre di analisi, utilizzare una singola colonia dalla piastra per inoculare da tre a cinque millilitri di brodo LB sterile. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 12-16 ore.Dopo aver preparato il terreno a lenta uccisione o SK secondo il protocollo di testo, con 350 millilitri di p. Aeruginosa dalla coltura LB fresca durante la notte, seminare ogni piastra SK da 10 centimetri. Utilizzare uno spandiconcime batterico sterile per diffondere uniformemente i batteri e lasciare asciugare le piastre nella cabina di biosicurezza.Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per testare più ceppi batterici di RNAi in parallelo in un singolo pozzetto di una piastra a pozzetti profondi da 24 pozzetti, inoculare una singola colonia da ciascun clone di RNAi contenente batteri precedentemente preparati in quattro millilitri di LB integrato con carbenicillina. Posizionare le piastre in un incubatore a scuotimento ottimizzato per piastre multipozzetto a 37 gradi Celsius e 950 giri/min per 16 ore, quindi raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 2.000 g per 5 minuti. Decantare il surnatante capovolgendo la piastra e agitandola energicamente.Utilizzando 100 microlitri di S Basal risospendere i batteri RNAi. Pipettare i batteri risospesi in un numero appropriato di pozzetti di una piastra NGM a più pozzetti integrata con IPTG e carbenicillina e lasciare asciugare la piastra. Dopo aver preparato i vermi L1 secondo il protocollo di testo, preparare le piastre per gli esperimenti di base pipettando circa 5.000 vermi per piastra da 10 centimetri, seminati con RNAi o superfood OP50.Per prepararsi a uno screening dell'RNAi, pipettare circa 300 vermi per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti seminata con RNAi. Se il ceppo utilizzato è a temperatura sterile, incubare i vermi a 15 gradi Celsius per circa 16 ore e poi trasferirli a 25 gradi Celsius per 44 ore per completare lo sviluppo e prevenire l'embriogenesi. Per effettuare un saggio di uccisione dei liquidi, utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere la P.aeruginosa da una piastra SK e risospendere i batteri in circa 5 millilitri di S.Basal.Utilizzando uno spettrofotometro misurare l'OD 600 della sospensione batterica. Preparare 24 millilitri di stock diluito di P.Aeruginosa in S.Basal a un OD 600 pari a 09, quindi aggiungere 21 millilitri di terreno SK liquido e, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 45 microlitri di batteri e terreni in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. Lava i vermi dalla loro fonte in un tubo conico da 50 millilitri e lasciali depositare sotto la forza gravitazionale.Aspirare il surnatante a 5 millilitri, quindi utilizzare un totale di 50 millilitri di S.Basal per risospendere i vermi e ripetere il lavaggio altre due volte. Utilizzando una selezionatrice di vermi, smistare circa 22 vermi in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti, secondo il protocollo di testo, quindi utilizzare una pellicola permeabile ai gas per sigillare la piastra e incubarla a 25 gradi Celsius per 24-48 ore. All'ora desiderata, utilizzare una lavatrice per micropiastre e S.Basal per lavare la piastra a 384 pozzetti per un totale di 5 volte.Uno degli errori più facili da commettere è quello di aspirare la piastra a 384 pozzetti prima che i vermi si siano completamente depositati. Ci vuole pratica per vedere con precisione se i vermi si sono depositati completamente. Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino a 20 microlitri.Quindi, aggiungere 50 microlitri di colorante di acido nucleico 98 micromolari per pozzetto, per una concentrazione finale di 0,7 micromolari. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 12-16 ore. Dopo il periodo di incubazione desiderato, utilizzare la lavatrice per micropiastre per lavare le piastre almeno tre volte.Per l'acquisizione dei dati, utilizzare uno spettrofotometro o un microscopio automatizzato per visualizzare sia la luce trasmessa che la fluorescenza. Aggiungere un millilitro di S Basal per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 300 vermi per pozzetto. Agitare delicatamente i vermi agitando la piastra, quindi trasferirli in una piastra vuota e sterile a 24 pozzetti.Lascia che i vermi si stabiliscano gravitazionalmente, circa cinque minuti. Aspirare il surnatante, lasciando circa un millilitro per pozzetto, quindi aggiungere 7 millilitri di S Basal a ciascun pozzetto. Ripetere il lavaggio altre due volte, quindi dopo il lavaggio finale aspirare tutti i microlitri di surnatante tranne circa 400.Dopo aver pipettato i batteri in piastre da 384 pozzetti per evitare la fame, utilizzando la funzione di ricampionamento del selezionatore di vermi, smistare 22 vermi in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. Infine, dopo la cernita, aggiungere piccole molecole o altri materiali specifici per l'esperimento. Come illustrato in questo grafico, quando si seguono i passaggi descritti in questo video, si osserverà un'uccisione dipendente dal tempo di C.elegans solo in presenza di P.aeruginosa.Al contrario, in assenza di integratori alimentari batterici chiave, si osserverà poca o nessuna uccisione. Come mostrato qui, l'incubazione in due fasi di P. aeruginosa a 37 gradi Celsius e poi a 25 gradi Celsius, che è fondamentale per i saggi convenzionali di uccisione lenta, ed è stata originariamente implementata nell'uccisione liquida, è superflua in questo test. Il protocollo tollera un'ampia gamma di concentrazioni batteriche iniziali, da un minimo di 600 OD pari a 0025, e mostra ancora uccisioni dipendenti dal tempo e dalla concentrazione, anche se i tempi cambiano.Inoltre, anche solo quattro pozzi sono spesso sufficienti per ottenere dati statisticamente significativi. Un esempio dell'utilità dell'elaborazione è mostrato qui quando il rapporto segnale/rumore è elevato, poiché in questo esempio l'analisi è semplice e discriminare tra condizioni positive e negative è banale. In questi casi, anche i colpi deboli possono essere facilmente identificati.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 60-75 minuti di tempo di utilizzo manuale per piastra da 384 pozzetti, escluso lo smistamento. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale ricordarsi di aggiungere tutti i componenti al supporto o la virulenza sarà compromessa. Questo test semplifica l'applicazione dello screening basato sul fenotipo dell'intero organismo alla scoperta di farmaci nella ricerca ospite-patogeno.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire saggi di patogenesi del C elegans a base liquida. Questa procedura può essere modificata sostituendo con altri agenti patogeni, come E.Faecalis per P.Aeruginosa, facilitando la ricerca di trattamenti per altre infezioni batteriche. Non dimenticare che lavorare con batteri infettivi come P.Aeruginosa o E.Faecalis può essere pericoloso.Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni adeguate, come un'adeguata formazione, buoni dispositivi di protezione individuale e una tecnica adeguata.

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