Raccolta variabile concentrazione dataset Calorimetria isotermica di titolazione per determinare meccanismi vincolanti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare il modello fisico corretto che descriva il legame di una macromolecola al suo ligando e di determinare i parametri termodinamici associati. Ciò si ottiene preparando prima una soluzione madre della macromolecola attraverso un'ampia dialisi. Il ligando di interesse viene quindi disciolto nel tampone di dialisi finale e le concentrazioni di tutti i componenti vengono determinate nella seconda fase.

I campioni di macromolecole e ligandi vengono accuratamente diluiti in una serie di concentrazioni diverse. Successivamente, una serie di esperimenti di calorimetria di titolazione isotermica, o ITC, vengono eseguiti a diverse concentrazioni sia di ligando che di proteina per produrre una serie di isoterme ITC nella fase finale della procedura. L'analisi globale della serie di esperimenti viene eseguita utilizzando diversi modelli fisici e il modello che fornisce il miglior accordo complessivo viene identificato come corretto.

Oggi vi mostrerò un metodo che può aiutare a rispondere a domande biofisiche come il modo in cui le molecole proteiche legano i loro ligandi e può fornire misure accurate dei parametri di legame come l'entropia, l'entropia e le costanti di associazione prima dell'inizio di questo protocollo. Purificare la proteina di interesse la macromolecola utilizzata in questa dimostrazione è un immuno GLICOSIDE N sei prime, una transferasi sottile I o una C sei prime I.To iniziare, preparare quattro litri di tampone per dialisi e raffreddare a quattro gradi Celsius. Quindi dializzare un piccolo volume di una soluzione di macromolecola.

In questo caso, cinque millilitri di 400 micromolari AAC C sei prime, un occhio in 1,3 litri di tampone per dialisi a quattro gradi Celsius. Questo può essere fatto in una cella frigorifera o in un frigorifero, sostituendo con un tampone fresco ogni otto ore e dializzando un totale di tre volte. Conservare la soluzione finale per la dialisi.

Filtrare 750 millilitri della soluzione finale di dialisi attraverso un filtro di cellulosa da 0,45 micron e conservare a quattro gradi Celsius. Questo tampone, ora denominato tampone di scorrimento, verrà utilizzato per i risciacqui e come diluente. Per i campioni, sciacquare accuratamente un filtro per siringa da 0,2 micron con tampone in funzione.

Applicare il campione di proteine e filtrare. Raccogliere delicatamente il campione in una provetta conica prima di conservare la soluzione proteica, determinare la concentrazione proteica con un test proteico standard. In questo caso, la concentrazione proteica viene misurata mediante ABBOCANZA a 280 nanometri e viene calcolata la concentrazione enzimatica.

Utilizzando un coefficiente di estinzione generato dal server proteomico EXI, conservare la proteina in modo da massimizzare la stabilità a lungo termine. AAC C sei prime un occhio deve essere conservato a quattro gradi Celsius in quanto non mantiene l'attività dopo il congelamento e lo scongelamento successivo disciolto il ligando e il tampone in esecuzione. Per questa dimostrazione, quattro milligrammi di acetil coenzima A sono stati disciolti in 200 microlitri di tampone di corsa per ottenere una soluzione madre da 25 millimolari.

Questo ligando può essere conservato a meno 78 gradi Celsius fino al momento dell'uso per preparare i campioni ITC, in primo luogo, calcolare la concentrazione dell'enzima per ottenere un valore C di 64 come descritto nel protocollo scritto per AAC sei primi uno I.Ciò corrisponde a una concentrazione di 192 micromolare. Preparare una soluzione da due millilitri della macromolecola a questa concentrazione, diluendo la soluzione madre con il tampone filtrato FIA settle co-enzima a disgelo, il coenzima acetalico a soluzione in un bagno di acqua ghiacciata. Una volta che il coenzima acetalico una soluzione è scongelato miscela, calcolare delicatamente la concentrazione della soluzione del ligando moltiplicando la concentrazione della macromolecola per il numero di siti di legame moltiplicato per 10.

Preparare la soluzione del coenzima acetilico A aggiungendo 80 microlitri del coenzima ACE da 25 millimolari, una soluzione madre a 420 microlitri di tampone di corsa e miscelando. Trasferire la soluzione diluita di acetil coenzima ACE in una provetta di riempimento per pipette e riportare la restante soluzione madre da 25 millimolari a meno 78 gradi Celsius per la conservazione. Degassa l'occhio a C sei prime e un sottile coenzima, A soluzioni sotto vuoto per cinque minuti a 19 gradi Celsius, che è un grado Celsius al di sotto della temperatura di funzionamento sperimentale desiderata.

Per impostare la siringa per iniezione, inserire la siringa attraverso un supporto per siringa fino a quando il morsetto per siringa montato in base alla pressa non si trova alla stessa altezza del supporto. Inserire il secondo morsetto per siringa sopra la siringa per iniezione fino a quando non viene premuto saldamente contro la parte inferiore del supporto della siringa. Stringere delicatamente il morsetto con l'attacco esagonale a sfera da 0,05 pollici in dotazione.

Quindi, posizionare il supporto della siringa nel supporto della pipetta. Far scorrere delicatamente l'iniettore della pipetta nella siringa per iniezione e assicurarsi che la punta dello stantuffo sia inserita direttamente nel foro della siringa. Una volta inserito completamente, avvitare il collare di bloccaggio del supporto della siringa nell'iniettore della pipetta.

Prima di caricare la soluzione di un campione di proteine dell'occhio A a C six prime, utilizzare il sistema di lavaggio cellulare fornito con lo strumento per lavare la cellula del campione con almeno 50 millilitri di tampone in esecuzione. Rimuovere il tampone residuo dalla cella del campione mediante aspirazione con una siringa di vetro da 2,5 millilitri ad ago lungo. Rimuovere le soluzioni dall'aspiratore di degasaggio utilizzando un secondo ago lungo pulito e asciutto.

Siringa da 2,5 millilitri. Aspirare con cautela un minimo di 1,8 millilitri del campione di proteine dell'occhio A a C six prime one nella siringa. Prestare attenzione per evitare bolle d'aria.

Una volta caricata la siringa con il campione proteico, inserire l'ago nella cella del campione e toccare delicatamente il fondo della cellula. Sollevare l'ago di circa un millimetro e iniettare delicatamente il campione nella cella fino a quando il liquido in eccesso non è visibile sopra la parte superiore della cella del campione. Per ripulire la cella da eventuali bolle d'aria intrappolate, sollevare l'ago di circa un centimetro assicurandosi che la soluzione rimanga nel troppopieno e prelevare e iniettare rapidamente circa 0,25 millilitri di soluzione.

Ora fai scorrere delicatamente l'ago verso l'alto lungo il lato del troppopieno. Nel pozzetto del campione l'ago colpirà una sporgenza. Prelevare tutto il liquido sopra questa sporgenza poiché la sporgenza indica l'altezza desiderata per la soluzione di scorrimento.

Per caricare la siringa per iniezione, collegare la siringa gonfia del tubo di plastica sulla porta di riempimento e abbassare la punta dello stantuffo verso la parte superiore della porta di riempimento. Posizionare ora il tubo di riempimento della pipetta della soluzione di ligando DGAs sul fondo del supporto della pipetta. Verificare che la punta della siringa non tocchi il fondo del tubo di riempimento e aspirare lentamente la soluzione nella siringa fino a quando una piccola quantità non entra nel tubo della siringa di caricamento.

Quindi, chiudere la porta di riempimento abbassando la punta dello stantuffo. Questo viene fatto facendo clic sul pulsante di chiusura della porta di riempimento. Quindi per rimuovere eventuali bolle d'aria che potrebbero essere rimaste intrappolate durante il caricamento.

Spurga e ricarica facendo clic sul pulsante di spurgo della ricarica. Spurga e ricarica per un totale di tre volte. Una volta completato il processo di ricarica dello spurgo, rimuovere il tubo di riempimento dal portapipetta e pulire delicatamente la punta della siringa con carta velina da laboratorio.

Ora abbassare la siringa del gruppo pipetta nel campione. Beh, fai attenzione e procedi lentamente poiché l'ago può facilmente piegarsi. Assicurarsi che la siringa sia completamente inserita premendo sulla base del collare di bloccaggio.

Una volta fissata la siringa, impostare la temperatura di funzionamento desiderata e selezionare una potenza di riferimento leggermente superiore al flusso di calore massimo previsto per l'iniezione. In questo esempio, 20 gradi Celsius e 20 microcalorie al secondo vengono utilizzati rispettivamente come temperatura di funzionamento e potenza di riferimento. Quindi programmare i volumi di iniezione e i ritardi desiderati.

Qui vengono utilizzate 28 iniezioni, la prima con un volume di due microlitri e un 62° ritardo e le successive iniezioni con un volume di 10 microlitri con 332° ritardo. L'esperimento qui dimostrato fornisce le basi per generare un set di dati a una singola concentrazione per generare le curve aggiuntive necessarie. Ripetere questo processo con concentrazioni decrescenti di macromolecole e ligandi.

Assicurarsi che tutti i campioni di macromolecole e ligando provengano dalla stessa soluzione madre per ridurre al minimo l'errore nelle concentrazioni. Qui è mostrata la traccia calorimetrica di titolazione isotermica grezza prodotta dalla titolazione di 3,86 millimolari di ligando acetil coenzima A in 192 micromolari della micromolecola. A A C sei primi uno.

I valori integrati nell'occhio sono stati utilizzati per determinare i parametri di legame con un adattamento sequenziale a due siti. Questo grafico mostra le isoterme generate dall'ITC di varie concentrazioni di ACE, Coenzima A e AAC C sei Prime One Eye. I dati sperimentali rappresentati dai cerchi aperti sono stati adattati sia a un modello indipendente a due insiemi di siti, sia a un modello sequenziale a due siti.

Un migliore accordo si vede con il modello sequenziale a due siti. Le concentrazioni proteiche utilizzate sono definite nel testo allegato. Quando si esegue questa procedura, è importante essere molto precisi con la diluizione poiché la variazione delle concentrazioni può avere un impatto drastico sui risultati.