Isolamento privo di etichetta e di arricchimento delle cellule attraverso Contactless dielettroforesi

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un moto traslatorio di cellule sospese in un flusso generato da pressione mediante elettroforesi di un colorante, senza mettere a contatto con il campione gli elettrodi. Questo risultato si ottiene innanzitutto sospendendo le cellule di interesse in un tampone a bassa conducibilità. Il secondo passaggio consiste nel caricare il dispositivo microfluidico con la sospensione cellulare e introdurre un fluido altamente conduttivo nei canali degli elettrodi.

Successivamente, il dispositivo preparato viene collegato all'elettronica ad alta tensione e la risposta in frequenza del movimento delle cellule viene registrata mediante un video fornito da una telecamera collegata a un microscopio invertito. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le immagini video per prevedere quantitativamente le proprietà elettriche delle cellule. In definitiva, l'elettroforesi dielettrica senza contatto viene utilizzata per dimostrare che cellule con diverse proprietà elettriche possono essere separate in modo privo di etichette e non dannoso, impiegando dispositivi microfluidici economici e semplici da realizzare.

Questo metodo è quindi utile per applicazioni come la separazione di cellule vive da quelle morte, l'isolamento di cellule tumorali iniziatrici, la separazione di cellule cancerose in base allo stadio e lo studio degli effetti dei farmaci su diverse cellule attraverso le loro proprietà dielettriche. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il sorting cellulare attivato da fluorescenza, sono che le cellule possono essere separate e caratterizzate in base alle loro proprietà biofisiche intrinseche senza la necessità di etichettarle mediante biomarcatori e che la sterilità del campione può essere mantenuta eliminando il contatto diretto tra gli elettrodi e il campione. Abbiamo avuto questa idea inizialmente quando volevamo sviluppare una tecnica in grado di evitare diversi problemi associati ai tradizionali dispositivi di dielettroforesi, come la contaminazione del campione, l'elettrolisi e la fabbricazione costosa.

Per l'isolamento di cellule di mammifero. Seguire le procedure precedentemente descritte utilizzando photoresist ed etching ionico reattivo profondo per incidere il disegno desiderato dei canali in una piastrina di silicio, depositando uno strato sottile di Teflon per migliorare il rilascio del microdispositivo dalla piastrina. Avvolgere la piastrina con carta d'alluminio per prevenire fuoriuscite.

Mescolare il polimetilalano o il PDMS in un rapporto di 10 a 1 tra elastomero e agente indurente DGA per circa 20 minuti e versare sulla piastrina. Successivamente, riscaldare la piastrina per 45 minuti a 100 gradi Celsius per evitare danni al rivestimento in Teflon del timbro dopo il raffreddamento. Rimuovere la pellicola di alluminio.

Tagliare il PDMS utilizzando una lama chirurgica e praticare fori di accesso all'ingresso e all'uscita del canale. Utilizzare un punzone smussato adatto alla dimensione del tubo; in questo caso, si utilizza un punzone smussato da 1,5 millimetri. Successivamente, pulire una lamella di vetro per microscopio come indicato nel protocollo descritto nel testo.

Pulire il dispositivo in PDMS utilizzando nastro adesivo Scotch Magic. Esaminare al microscopio per verificare che i canali siano puliti. Successivamente, esporre il vetrino e il dispositivo in PDMS a plasma d'aria per due minuti, quindi premere saldamente il lato del dispositivo con i canali contro il vetrino di vetro, evitando la formazione di bolle d'aria tra il dispositivo e il vetrino.

Preparare un buffer a bassa conducibilità come descritto nel protocollo testuale, che verrà indicato come buffer DEP. Sospendere le cellule nel buffer DEP a una concentrazione di 3 milioni di cellule per millilitro; in questo caso si utilizzano cellule tumorali di topo in stadio avanzato, cellule epiteliali della superficie ovarica o cellule L di muschio, dopo aver colorato le cellule con un colorante fluorescente permeabile alla membrana. Misurare la conducibilità della sospensione cellulare colorata.

La conducibilità dovrebbe essere di circa 100 microsiemens per centimetro. Se la misurazione della conducibilità è troppo elevata, centrifugare il campione. Ri-sospendere nel buffer profondo e ripetere la misurazione della conducibilità.

L'aspetto più difficile di questo protocollo consiste nell'evitare bolle nei canali degli elettrodi e nel canale del campione: le bolle nei canali degli elettrodi possono impedire la formazione di connessioni elettrolitiche, mentre quelle nel canale del campione possono ostacolare un flusso costante. Assicurarsi di eseguire i passaggi illustrati per evitare la formazione di bolle e garantire un flusso stabile prima di caricare il chip microfluidico C dip. Posizionarlo sotto vuoto per 30 minuti.

Nel frattempo, tagliare un pezzo di tubo flessibile in modo che copra la distanza tra la pompa per siringa e la piastra del microscopio dove sarà posizionato il chip microfluidico. È necessaria una lunghezza di sei pollici. Inserire il tubo sull'estremità dell'ago della siringa.

Quindi stimare la lunghezza necessaria per il tubo di uscita dividendo il volume target del campione raccolto per l'area della sezione trasversale del tubo. Tagliare il tubo alla lunghezza richiesta. Successivamente, aspirare la sospensione cellulare in una siringa.

Verificare che non ci siano bolle d'aria all'interno del tubo o della siringa. Dopo aver rimosso il chip dal vuoto, inserire il tubo di uscita e preparare rapidamente il canale del campione. Per evitare bolle d'aria intrappolate nei canali, battere leggermente sulla siringa durante la preparazione.

Per evitare di rompere la sottile barriera isolante e per condizionare rapidamente i canali degli elettrodi, posizionare delle punte di pipetta vuote in un'uscita di ciascun canale fluidico dell'elettrodo e pipettare 200 microlitri di PBS contenente una piccola quantità di bromo B. Toccare delicatamente per introdurre il liquido nell'estremità opposta del canale dell'elettrodo. Mantenere una pressione delicata finché il PBS con bromo B avanza visibilmente verso la punta della punta di pipetta vuota; ripetere per ciascun elettrodo. Il canale R domine B viene utilizzato solo per fluorescenza.

Visualizzare i canali degli elettrodi fluidici dopo la preparazione. Riempire ogni serbatoio della punta della pipetta con PBS, con R domine B. Evitare la formazione di bolle nei serbatoi delle punte della pipetta e rimuovere eventuali bolle visibili pipettando delicatamente su e giù. Staccare il tubo di uscita e smaltirlo correttamente.

Quindi inserire un nuovo serbatoio per il tubo di uscita. Raccogliere il volume desiderato. Posizionare il chip sul palchetto di un microscopio invertito dotato di fotocamera digitale.

Montare la siringa sulla pompa per siringhe e inserire gli elettrodi metallici nei serbatoi del canale elettrodico fluidico; far passare il fluido a un millilitro all'ora per garantire un buon contatto tra la pompa per siringhe e la siringa. Ispezionare visivamente la lunghezza del canale per assicurare un flusso ininterrotto delle cellule e l'assenza di bolle o perdite. Ridurre quindi la portata a cinque microlitri all'ora.

Per motivi di sicurezza. Verificare l'elettronica accendendo il generatore di funzioni, l'amplificatore ad alta tensione e l'oscilloscopio, quindi regolare la tensione e la frequenza desiderate. In questo caso, questi parametri sono 200 volt e 20 kilohertz.

Dopo aver verificato un rendimento accettabile, spegnere l'alimentazione. Quindi collegare gli elettrodi all'amplificatore ad alta tensione. Dopo aver ottenuto un flusso stabile, applicare la tensione desiderata alla frequenza desiderata. In questo esperimento, la tensione è di 200 volt RMS a frequenze comprese tra cinque e 60 chilohertz.

Registrare i file video della risposta cellulare mediante tecniche di elaborazione delle immagini per quantificare la distribuzione delle cellule nel canale e per caratterizzare la frequenza di crossover. A tale scopo, mantenere una tensione costante e variare sistematicamente la frequenza all'inizio e alla fine dell'esperimento, nonché in modo casuale tra le diverse prove sperimentali. Registrare la distribuzione delle cellule di controllo, ovvero la distribuzione delle cellule in assenza di campo elettrico.

Dopo aver impostato un nuovo intervallo di frequenza, attendere il tempo necessario affinché le cellule fluiscano dall'ingresso fino alla posizione monitorata e quindi iniziare la registrazione; procedere quindi con l'elaborazione delle immagini per la caratterizzazione della frequenza di crossover come descritto nel protocollo testuale. Sospendere la miscela desiderata nel buffer DEP a una concentrazione totale di 3 milioni di particelle per millilitro. In questo caso, la miscela è composta da cellule L di muschio e da microsfere fluorescenti di quattro micrometri nel buffer DEP; eseguire i passaggi precedentemente descritti. Per preparare un dispositivo CEP, far funzionare l'esperimento a una frequenza compresa tra le due frequenze di crossover determinate per le cellule bersaglio e le particelle di fondo, in modo che le due popolazioni di particelle subiscano forze DEP in direzioni opposte.

Per raccogliere il contenuto di un campione misto, rimuovere il tubo di uscita al raggiungimento del volume target posizionando un dito di un guanto sull'apertura di uscita e tirando delicatamente sul tubo. Versare il volume raccolto in un serbatoio per ulteriori analisi. Per cellule tumorali di mammifero, come le cellule L maggiormente utilizzate in questo caso, è stata osservata una DEP negativa a cinque chilohertz e una marcata DEP positiva.

Alle 60 chilohertz, le cellule MOS L hanno un diametro di 17,7 ± 3,3 micrometri, mentre le microsfere hanno un diametro nominale di quattro micrometri. Oltre a determinare la frequenza di crossover delle cellule, questa tecnica può essere utilizzata per separare una miscela, illustrata qui da una miscela di cellule MO'S L e microsfere. Questo esempio sfrutta la dielettroforesi negativa esibita dalle microsfere di quattro micrometri a frequenze alle quali le cellule MO'S L subiscono dielettroforesi positiva.

Quando il dispositivo è stato utilizzato a 200 volt RMS e 10 kilohertz, entrambe le cellule mostrate in verde e i microsferini mostrati in rosso sono stati mescolati poiché hanno subito una DEP negativa a 50 kilohertz. È stato osservato il movimento delle cellule MOS L verso la parte superiore del canale, mentre i microsferini sono rimasti confinati nella porzione inferiore del canale, consentendo la separazione della miscela in due componenti. Seguendo questa procedura, altre tecniche possono essere eseguite a valle, come la coltura cellulare e l'analisi mediante imaging a immunofluorescenza o saggi biochimici, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come le proprietà dielettriche si correlino alle caratteristiche fisiche delle cellule.

Pertanto, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha effettivamente aperto la strada ai biologi per studiare come le variazioni indotte dai metaboliti nello scheletro citoplasmatico della cellula possano essere correlate alle loro proprietà dielettriche utilizzando un modello di cancro ovarico murino. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come arricchire e ordinare le cellule mediante elettroforesi senza contatto.