Name: Isolamento privo di etichetta e di arricchimento delle cellule attraverso Contactless dielettroforesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri l'isolamento privo di etichetta delle cellule tramite dielettroforesi contactless (cDEP). Questo metodo microfluidico consente di arricchire e separare cellule vive basandosi sulle loro proprietà dielettriche intrinseche in modo sterile e non dannoso.

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Questo lavoro sostenuto è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation sotto Grant No. EFRI 0938047, e dal Virginia Tech Institute per la Tecnologia Critica e Scienze Applicate (ICTAS). Gli autori desiderano esprimere apprezzamento al Dr. Eva Schmelz e il Dr. Paul Roberts per la loro gentile dono di cellule MOSE-L. Gli autori riconoscono Angela Anderson per la sua assistenza con la coltura cellulare, Caitlan Swaffar per il suo aiuto con la modifica di questo documento e la preparazione di esperimenti, e tutti i membri del laboratorio Bioelectromechanical Sistemi.

1. Realizzazione di un prototipo di dispositivo CDEP Microfluidic: Panoramica <ol><li> Seguire le procedure precedentemente riportate 22 utilizzando photoresist e Deep Reactive Ion Etching (DRIE) per incidere il disegno canale desiderato (Figura 1) in un wafer di silicio (Figura 2). Depositare un sottile strato di teflon per migliorare il rilascio del microdispositivo dal wafer. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica di un dispositivo di smistamento continuo a bassa frequenza. Le piste canale del campione sinistra a destra e 500 micron di larghezza con costrizioni a dente di sega a 100 micron. Le due coppie di elettrodi canali fluidici compongono gli elettrodi di source e sink, rispettivamente, e sono separati dal canale campione da una spessa barriera 20 pm PDMS. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> Figura 2. Il Fabrprocesso icazione di un dispositivo CDEP. (a) per 60 sec, luce UV reagisce selettivamente con photoresist esposto tramite un modello di maschera della geometria del dispositivo CDEP. (b) photoresist viene rimosso utilizzando sviluppatore. (c) profonda Reactive Ion Etching (DRIE) è utilizzato per etch 50 micron caratteristiche profonde, e 5 min di attacco umido da idrossido di tetrametilammonio (TMAH) 25% a 70 ° C viene utilizzato per ridurre la rugosità delle pareti laterali. (d) viene aggiunto un rivestimento in teflon per migliorare il rilascio del dispositivo da il wafer. (e) PDMS cola sul riutilizzabile wafer timbro dopo degasaggio e polimerizzato per 45 min a 100 ° C. (f) PDMS viene rimosso dal wafer. PDMS e un vetrino pulito sono esposti al plasma di aria per 2 min e legati insieme. <ol start="2"><li> Avvolgere il wafer con un foglio di alluminio per evitare spill-over. Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) in rapporto 10:1 di elastomero per curare agente, de-gas per circa 20 min, E versare sul wafer. Calore per 45 min a 100 ° C per evitare di danneggiare il rivestimento in teflon del timbro. Lasciare che il dispositivo si raffreddi. </li><li> Dopo raffreddamento, rimuovere un foglio di alluminio, tagliare PDMS utilizzando una lama chirurgica, e perforare fori di accesso al canale di ingresso / uscita utilizzando un perforatore smussato adeguata alle dimensioni del tubo. Qui, viene utilizzato un perforatore smussato e 1,5 mm. </li><li> Pulire un vetrino per microscopio con un risciacquo di acqua e sapone, etanolo, acqua deionizzata, e asciugatura con aria rispettivamente. Pulire il dispositivo PDMS con del nastro Scotch Magia. Esaminare al microscopio per essere sicuri che i canali siano puliti. Esporre il vetrino e il dispositivo PDMS di plasma ad aria per 2 min. Premere con forza lato canale del dispositivo per vetrino, evitando la formazione di bolle d&#39;aria tra il dispositivo e la slitta (Figura 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> Figura 3. </strong&gt; (a) La maschera utilizzata per fotolitografia durante il timbro fabbricazione di wafer di silicio, e (b) il dispositivo PDMS vetro finito con il campione e canali elettrodi fluido riempito con verde e rosso colorante alimentare, rispettivamente. Vedere la Figura 1 per le dimensioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . 2. Preparare una sospensione di cellule in DEP Buffer <ol><li> Preparare una bassa conducibilità (100 mS / cm) tampone, che verrà indicato come &quot;tampone DEP&quot; (8,5% di saccarosio [w / v], 0,3% di glucosio [w / v], 0,725% RPMI [w / v]) 16. </li><li> Sospendere le cellule in tampone DEP a 3 x 10 6 cellule / ml. Qui, vengono utilizzati cancerose del mouse fase tardo-ovarico epiteliale di superficie (MOSE-L) cellule. </li></ol> Nota: analisi vitalità cellulare mediante il metodo esclusione del colorante blu tripano mostrato una lieve diminuzione della redditività(95,1-91,6%), della fase iniziale MOSE (MOSE-E) le cellule sospese in tampone DEP a temperatura ambiente dopo 5 ore. Si prevede che una simile lieve diminuzione della redditività avviene per le cellule MOSE-L, indicando che le cellule non devono essere conservati in DEP tampone lungo termine. <ol start="3"><li> Tingere cellule utilizzando un colorante fluorescente membrana permeabile, come il enzimaticamente attivato calceina AM. </li><li> Misurare la conducibilità della sospensione cellulare tinto. La conducibilità dovrebbe essere di circa 100 mS / cm. Se la misura della conducibilità è troppo alto, ruotare il campione verso il basso, risospendere in tampone DEP a 3 x 10 6 cellule / ml e ripetere la misura di conducibilità. </li></ol> 3. Caricamento della CDEP Microfluidic Chip <ol><li> Posizionare il chip microfluidica sotto vuoto per 30 min. </li><li> Nel frattempo, tagliare un pezzo di tubo flessibile per coprire la distanza dalla pompa siringa alla fase microscopio in cui verrà collocato il chip microfluidica. Qui, una lunghezza di 6 pollici tuboè richiesto. Adatta tubo alla punta dell&#39;ago sulla siringa. </li><li> Stimare la lunghezza necessaria per tubo di uscita dividendo il volume del campione raccolto bersaglio per l&#39;area della sezione trasversale del tubo. Tagliare la richiedono lunghezza del tubo. </li><li> Disegnare sospensione cellulare nella siringa. Controllare che nessuna bolla si trovano nella tubazione o siringa. </li><li> Dopo la rimozione di chip dal vuoto, inserire il tubo di uscita e primo canale del campione in fretta per evitare bolle d&#39;aria intrappolate nei canali. Battere delicatamente la siringa quando adescamento per evitare la rottura della sottile (20 micron) barriera isolante, anche se è stato osservato che la barriera in grado di sopportare una costante elevato throughput vicino 5 ml / h senza rompersi. </li><li> Per primi i canali elettrodi, collocare rapidamente le punte delle pipette vuote in una presa di corrente di ciascun canale elettrodo fluido. Pipettare 200 microlitri di PBS contenente una piccola quantità di rodamina B e toccare delicatamente per introdurre il fluido nell&#39;estremità opposta del canale elettrodo. Mantenere una leggera pressionefino PBS con rodamina B progredisce visibilmente la punta della punta della pipetta vuoto. Ripetere per ogni canale elettrodo. Rodamina B è utilizzato solo per visualizzare fluorescente canali elettrodi fluidici. </li><li> Dopo l&#39;adescamento, riempire ogni serbatoio punta della pipetta con PBS con rodamina B. Evitare la formazione di bolle nei serbatoi punta pipetta e rimuovere eventuali bolle visibili pipettando delicatamente su e giù. Staccare il tubo di uscita ed eliminare in modo appropriato, quindi inserire un nuovo serbatoio tubo di uscita per raccogliere il volume di destinazione. </li></ol> 4. Caratterizzare Frequenza di crossover di cellule utilizzando CDEP Chip <ol><li> Posizionare il chip sulla scena di un microscopio invertito dotato di fotocamera digitale (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> Figura 4. </strong&gt; (a) la configurazione generale sperimentale per gli esperimenti CDEP. Il chip CDEP si trova sulla piattaforma del microscopio invertito. Una telecamera invia le immagini al computer per la registrazione. La pompa a siringa mantiene un flusso di ingresso costante. Il generatore di funzione genera un segnale che viene intensificato dall&#39;amplificatore ad alta tensione e collegato al chip CDEP da elettrodi a filo. L&#39;oscilloscopio controlla il segnale inviato al chip. (B) Dettaglio vista del chip CDEP e collegamenti fluidici ed elettronici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol start="2"><li> Montare siringa pompa siringa e inserire elettrodi a filo in fluidici serbatoi canali dell&#39;elettrodo. </li><li> Pompare fluido attraverso a 1 ml / hr per assicurare un buon contatto tra la pompa a siringa e la siringa. Controllare visivamente la lunghezza di canale per assicurare libero flusso delle cellule e l&#39;assenza di bolle o perdite. RossoPortata uce a 0.005 ml / h. Nota: Throughput alto come 1 ml / hr 31,35 è stato raggiunto in dispositivi di altre geometrie. </li><li> Per motivi di sicurezza, testare l&#39;elettronica da accendere il generatore di funzioni, amplificatore ad alta tensione, e oscilloscopio, e la regolazione di tensione e frequenza desiderata. Ecco questi parametri sono 200 V e 20 kHz. Sulla verifica di prestazioni accettabili, spegnere. Collegare gli elettrodi ad un amplificatore ad alta tensione. Nota: Rispettare le procedure di sicurezza elettrica durante il funzionamento dell&#39;elettronica alle alte tensioni utilizzate per questi esperimenti. </li><li> Al raggiungimento flusso costante, applicare la tensione desiderata alla frequenza desiderata. In questo esperimento, la tensione è 200 V RMS a frequenze comprese tra 5-60 kHz. </li><li> File video registrazione della risposta cellulare con tecniche di elaborazione di immagini (step 5) quantificare distribuzione di celle nel canale e per caratterizzare la frequenza di crossover. Per fare questo,mantenere una tensione costante e variare la frequenza sistematicamente. All&#39;inizio e alla fine dell&#39;esperimento, così come in modo casuale tra prove sperimentali, registrare la distribuzione delle cellule di controllo, la distribuzione delle cellule senza applicare alcun campo elettrico. Stimare la quantità di tempo necessario per le cellule di fluire dall&#39;ingresso al luogo sorvegliato (qui, 5 min). Dopo aver impostato una nuova frequenza, attendere questo periodo di tempo, quindi iniziare la registrazione (qui, a 2 min video della distribuzione di celle). </li></ol> 5. Image Processing per la caratterizzazione Frequenza di crossover <ol><li> Utilizzo di uno script di calcolo, analizzare ciascun fotogramma per fotogramma per determinare la y-posizione relativa (dove la direzione z è la profondità verticale del canale, la direzione y è la larghezza del canale, e direzione x è la lunghezza di canale) di ogni cella fluorescenti o particelle in un determinato coordinata x valle della regione di alta forza DEP nel canale. Creare un grafico dei relativi displaycontributo. </li><li> Confrontare la linea centrale della distribuzione ad ogni tensione e frequenza con la linea centrale della distribuzione controllo. Per una data tensione e frequenze variabili, determinare la frequenza di taglio, in cui la linea centrale corrisponde alla posizione y del controllo. </li></ol> 6. Variando la Esperimento per effettuare una cernita cellulare o arricchimento <ol><li> Sospendere miscela desiderata in tampone DEP in concentrazione totale di 3 x 10 6 particelle / ml. Ecco, questa miscela è cellule MOSE-L con 4 perline micron fluorescenti nel buffer DEP. Eseguire i passaggi descritti in precedenza per preparare un dispositivo CDEP. </li><li> Per ordinare o arricchire cellule da una miscela, determinare le frequenze di taglio delle cellule bersaglio e le particelle di sfondo come precedentemente descritto. Azionare l&#39;esperimento ad una frequenza tra le due frequenze di taglio delle cellule bersaglio e le particelle di fondo in modo che le due popolazioni di particelle sperimentano forze DEP in fronte directions. Per ordinare le celle MOSE-L e 4 micron perline, azionare il Microdevice sopra 11.90 ± 0.63 kHz. la prima frequenza di crossover di cellule MOSE-L recentemente riportato da Salmanzadeh et al 33. </li><li> Per raccogliere il contenuto di un campione ordinato, rimuovere il tubo di uscita sulla raccolta volume bersaglio, mettendo un dito guanto sopra l&#39;apertura di uscita e delicatamente tirando sul tubo. Versare il volume bersaglio raccolto in un serbatoio per ulteriori analisi Nota:. Altri metodi di recupero di esempio potrebbero includere associare un serbatoio permanente al chip e la rimozione del campione dalla semplice pipettaggio. </li></ol>

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</ol>

Dr. Rafael Davalos ha un brevetto per contatto dielettroforesi.

DEP è una potente tecnica per determinare le proprietà dielettriche delle particelle e dirigere il movimento delle particelle verso l&#39;ordinamento delle applicazioni, di isolamento o di arricchimento. A causa degli effetti deleteri del contatto elettrodo diretto con un campione, altri hanno adottato approcci simili al metodo precedentemente presentato per evitare il contatto. Ad esempio, Bashir et al. Sviluppato dispositivi DEP senza contatto, utilizzando un dispositivo PDMS microfluidica separato dalla stampato elettrodi circuito da un vetrino di vetro sottile, e questa tecnica è anche reso disponibile in formato video. 23,36 Qui, abbiamo dimostrato la fabbricazione di un chip CDEP elettrodi e fluidici utilizzando un unico substrato PDMS, e il protocollo sperimentale per la separazione di cellule tumorali ovariche da una miscela di cellule e perline fluorescenti. La tecnica presentata è stata utilizzata con successo per una varietà di applicazioni più complesse e fisiologicamente rilevanti, inclusa la cernita livE e cellule morte, 28 tumore avviare cellule da cellule di carcinoma della prostata, 30 cellule tumorali da diluite globuli rossi, 31,32 e differenziare tra stadi del cancro 37 e cancro ovarico. 29 CDEP stato anche utilizzato per la miscelazione di particelle. 38 Fra applicazioni suggeriscono che utilizzando la tecnica semplice presentato, scopi diversi può essere realizzato semplicemente modificando il disegno della geometria del canale. . DEP è utile su microscala per la manipolazione di particelle 13 per particelle sferiche, la forza dielettroforetica traslazionale dipende dalle proprietà elettriche e dimensioni della particella e il suo mezzo di sospensione, così come il gradiente del campo elettrico quadrato: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> dove ε m è la permittività del mezzo di sospensione, r è il raggiodella particella, e Rc [k (ω)] è la parte reale del fattore di Clausius-Mossotti (CM). Il fattore CM è una misura della relativa polarizzabilità della particella rispetto al mezzo di sospensione e determina la direzione della forza dielettroforetica. È descritto come <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> dove <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> e <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> sono i complessi permittività della particella e mezzo, rispettivamente. La permettività complessa, <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , Dipende dalla conducibilità (σ) e frequenza (ω). Il fattore CM di particelle sferiche è teoricamente vincolata tra -0.5 e 1. Se il fattore CM è negativa, le particelle si NDEP perché il mezzo è più polarizzabile di particella, così le particelle si muovono distanti regionielevati gradienti di campo elettrico. Se il fattore CM è positivo, le particelle sono più polarizzabile di medio e sperimentano PDEP in cui si muovono verso regioni di alta gradienti di campo elettrico. Per particelle biologiche che sono non omogenea nella struttura, come le cellule, il fattore di Clausius-Mossotti può essere determinato da un valore effettivo della permittività particella: <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> dove <img alt="Equazione 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> e <img alt="Equazione 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> sono la permettività complessa dell&#39;effettiva permettività complessa dell&#39;interno della cellula, come il citoplasma, e la membrana plasmatica, rispettivamente. r è il raggio della cella, e d è lo spessore della membrana plasmatica 26 Quando DEP verifica con particelle sospese in unfluido, il moto della particella relativa al fluido genera una forza di trascinamento sulla particella. Questa forza di resistenza deve essere considerato nel determinare la forza complessiva che agisce sulla particella. Per le situazioni di interesse qui, forze viscose dominano e le particelle sono assunti sferico, piccolo, e si muove con velocità relativamente bassa, quindi trascinare la legge di Stokes &#39;fornisce una buona approssimazione della forza di trascinamento: <img alt="Equazione 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> dove η è la viscosità del fluido, p u è la velocità della particella, e u f è la velocità del fluido, che può anche essere in movimento. Data la forza dielettroforetica, fluido e le proprietà delle particelle noto, e una velocità di flusso noto, l&#39;equilibrio tra la forza di resistenza e la forza dielettroforetica può essere risolto per stimare la velocità delle particelle. Il gradiente di velocità che l&#39;esperienza celle deve essere inferiore alla soglia alla quale cell lisi può accadere. Caratterizzazione delle proprietà elettriche delle particelle è necessario prevedere e controllare come risponderà sotto DEP loro. In questo lavoro, in particolare utilizzato i CDEP bassa frequenza con celle MOSE-L per dimostrare il protocollo per la determinazione prima frequenza di crossover delle cellule, e quindi mostrato smistamento continuo di perle di polistirene e cellule MOSE-L in base alle loro risposte DEP opposte. Alterare la geometria del dispositivo CDEP cambierà i gradienti spaziali del campo elettrico, consentendo ai dispositivi di essere progettati per alta frequenza oa bassa frequenza, e per alta selettività ed efficienza di selezione, per un tipo cellulare specificato. Inoltre, i dispositivi high throughput possono essere sviluppate fabbricando canali più ampi, 30 canali in parallelo, 30 o di fabbricazione multistrato 35, in cui i canali degli elettrodi sono impilati verticalmente sopra e sotto una relativamente profondacanale del campione. Sottili membrane formano la barriera tra strati. Un saggio preliminare con i dispositivi fabbricati in polimetilmetacrilato (PMMA) e policarbonato (PC) film sottili hanno dimostrato risposta DEP di cellule MOSE-L. Gli attuali sforzi sono in corso per definire dispositivi high-throughput multi-strato e di migliorare il sistema periferico verso un eventuale piattaforma plug-and-play. Per espandere dalla tecnica sperimentale di base presentati, le applicazioni e le specifiche del dispositivo possono essere personalizzati per soddisfare esigenze particolari, come l&#39;ordinamento contro la caratterizzazione, o l&#39;aggiunta di serbatoi campione e un sistema semi-automatico al dispositivo.

Arricchimento campione biologico e la cernita delle particelle è spesso necessario per successive analisi. 1 Ad esempio, l&#39;isolamento di cellule rare da fluidi corporei ha importanti applicazioni nella rilevazione del cancro e la medicina individualizzata. 2,3 Le tecniche di arricchimento più comunemente utilizzate sono fluorescenti cellule attivate (FACS ) 4 e magnetici delle cellule attivate ordinamento (MACS), 5 che si basano su marcatori di superficie espressi per differenziare le cellule. Altre strategie includono idrodinamico 6 o inerziale 7,8 smistamento, pinzette ottiche, acoustophoresis 9, 10 e dielettroforesi. 11,12 dielettroforesi è il movimento di una particella polarizzata in presenza di un campo elettrico non uniforme. DEP 13 è stato usato per una vasta gamma di applicazioni, comprese le cellule 2,14 smistamento basate sulla vitalità, 15 caratterizzare le proprietà bioelettriche delle cellule, 16 e listerata anche con cambiamenti indotti nelle proprietà biofisiche di cellule. 17,18 tradizionale DEP utilizza elettrodi planari modellata all&#39;interno di un canale microfluidica per applicare una tensione ed indurre una non uniforme campo elettrico. 13 Mentre questa è una tecnica potente, sfide possono derivare, ad esempio elettrodo di delaminazione ed elettrolisi. Dielettroforesi base isolante (IDEP) 19 ha affrontato le sfide di incrostazione, elettrodo delaminazione, e il degrado spaziale del campo dell&#39;elettrodo attraverso patterning strutture isolanti che inducono disuniformità in un campo elettrico DC. IDEP è stato usato per separare selettivamente cellule di batteri vivi e morti, 19 isolare spore batteriche, 20 e manipolare il DNA, 21 tra altre applicazioni. Riscaldamento Joule può essere una sfida perché può verificarsi come risultato delle tensioni continue elevate spesso richiesti. Per migliorare queste sfide, sono state sviluppate senza contatto microdispositivi DEP. 22-24 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La tecnica qui presentata utilizza contactless dielettroforesi (CDEP), così chiamata per la mancanza di un contatto diretto tra gli elettrodi metallici e il canale del campione 22. Unico a questa strategia è la sostituzione di elettrodi metallici con canali elettrodi pieno di liquido con una soluzione altamente conduttivo. Questi elettrodi fluido sono accoppiati capacitivamente attraverso una sottile barriera isolante al canale campione tramite una tensione alternata. Eliminando il contatto del campione con gli elettrodi riduce le questioni connesse con metodi basati-DEP come l&#39;elettrolisi e la formazione di bolle, la contaminazione del campione, e l&#39;elettrodo delaminazione. Come risultato, CDEP è particolarmente utile per i campioni biologici perché supporta la vitalità delle cellule nel campione. Importante, CDEP in grado di mantenere la sterilità del campione. Un chip può essere preparato in una cappa di coltura cellulare e l&#39;esperimento può essere condotto senza richiedere contatto campione di elettrodi metallici o richiede che il campione sia aperta al environment. Un semplice serbatoio può essere fissato alla presa chip per agevolare il recupero del campione sterile. Inoltre, la fabbricazione di elettrodi fluido dallo stesso materiale polimerico biocompatibile (PDMS) come il canale del campione riduce l&#39;alto costo sostenuto con patterning personalizzata di elettrodi metallici, il tempo richiesto per la fabbricazione, e limita la necessità di attrezzature specializzate camera sterile al patterning iniziale del timbro riutilizzabile wafer di silicio. Movimento di particelle dovute DEP dipende dalle caratteristiche della particella e il mezzo, così come i gradienti spaziali del campo elettrico. Una particella-e dipendente dalla frequenza fattore, chiamato fattore Clausius-Mossotti (CM), assume un valore compreso -0.5 a 1, e determina la direzione della forza DEP. La frequenza con cui il fattore CM è esattamente zero viene chiamata frequenza di crossover. Questo è il punto in cui nessuna forza dielettroforetica è esercitata su una particella e il segno variazioni del fattore CM. A single frequenza di crossover per microsfere solidi inerti si verifica quando il fattore CM cambia da negativo a positivo 25 Per le cellule di mammifero in tampone conducibilità bassa dell&#39;ordine di 0,01 S / m, una prima frequenza di crossover che indica una transizione da NDEP a PDEP esiste vicino a 10. - 100 kHz, ed è influenzato dalle dimensioni, forma, citoscheletro, e proprietà di membrana della cellula. 26,27 A seconda frequenza di crossover a un passaggio dal PDEP a regime NDEP è dell&#39;ordine di 10 MHz, ed è influenzata dalla rapporto nucleo-citoplasma, citoplasma conducibilità, e reticolo endoplasmatico. forza DEP 27 può essere applicato senza la presenza di flusso di fluido, ma qui si utilizza un fluido che scorre per raggiungere smistamento continuo di particelle sospese. L&#39;influenza combinata della forza dielettroforetica e il Stokes &#39;forza di trascinamento dettare la traslazione di una particella. Abbiamo sviluppato sistemi atti ad azionare in due gamme di frequenza. Frequenc Superioredispositivi y (100-600 kHz) hanno operato utilizzando PDEP e smistamento lotto realizzato delle cellule, come le cellule tumorali della prostata avvio (tic), ovarico epiteliale di superficie (MOSE), le cellule murine, MDA-MB-231 cellule del cancro al seno, o vivere THP -1 cellule selettivamente intrappolando cellule di interesse sui posti situati nel canale del campione isolante. 28-31 di frequenza inferiore (5-100 kHz) dispositivi funzionano continuamente, e quando si opera ad una frequenza alla quale una popolazione sperimenta PDEP mentre i precedenti esperienze di popolazione NDEP, può reindirizzare traiettorie delle particelle per ottenere l&#39;ordinamento. 32-34 Questi dispositivi a bassa frequenza sono stati utilizzati per ordinare le cellule tumorali da globuli rossi, determinare le variazioni delle proprietà dielettriche di una linea cellulare MOSE progressiva, e per chiarire gli effetti della non- trattamenti sfingolipidi tossici su invertendo le caratteristiche aggressive delle cellule MOSE aggressivi. Inoltre, microdispositivi CDEP possono essere progettati per funzionare ad una maggiore velocità, attualmente fino a 1 ml / hr. 31,35 Come descritto, la flessibilità e basso costo del processo di fabbricazione permette geometrie dei dispositivi su misura, che permettono la procedura sperimentale presentato sia rilevante per una vasta gamma di applicazioni. L&#39;obiettivo a lungo termine di CDEP è quello di realizzare label-free cell sorting e di arricchimento sul piano clinico, con il recupero del campione per la successiva cultura o la trasformazione. La tecnica qui presentata è un metodo semplice e poco costoso, dalla fabbricazione di sperimentazione, che aumenta l&#39;accessibilità di DEP. Dimostriamo la preparazione di un chip CDEP e il protocollo sperimentale per ottenere caratterizzazione e arricchimento delle cellule tumorali ovariche di microsfere fluorescenti.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td> <td>Dow Corning, Midland, MI, USA</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini </td><td>The Microscope Depot</td><td>76079</td><td>2x3 pollici di bordi rettificati</td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing</td><td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-06417-31</td><td>Sottile parete 20 gauge, 0,032 "ID x 0,056" OD, 100 ft / roll</td></tr><tr><td>Luer-slip siringhe di plastica National</td><td>Scientific azienda</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Punta dell'ago</td><td>Howard Electronic instruments</td><td>JG20-1.0</td><td>20 Calibro 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td></tr><tr><td>D(+)-Saccarosio</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S3-500</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucosio, reagente ACS, anidro</td><td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td><td>AC410955000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>112-025-101</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM, Molecular Probes</td><td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td><td>C3100MP</td><td>lunghezza d'onda di eccitazione 488/lunghezza d'onda di emissione 516</td></tr><tr><td>Rhodamine B, O</td><td>Science Lab</td><td>SLR1465-100G</td><td>lunghezza d'onda di eccitazione 540/lunghezza d'onda di emissione 625</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (10X)</td><td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td><td>RC-147</td><td></td></tr><tr><td>Leica, microscopio a luce invertita </td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>Leica DMI 6000B</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC420, fotocamera a colori</td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>Leica DFC420</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di funzioni </td><td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td><td>GFG-3015</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore di potenza a banda larga </td><td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td><td>AL-50HF-A</td><td></td></tr><tr><td>HFHV Output Trasformatore</td><td></td><td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore ad alta tensione</td><td>Oscilloscopio</td> modulare USB <td>Trek modello 2205</td><td></td></tr><tr><td>, 100 MHz</td><td>AgilentTechnologies</td><td>U2701A</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma espanso</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001/002 (115/230V)</td><td>air plasma</td></tr><tr><td>Scotch Magic tape</td><td>3M</td><td></td><td>qualsiasi larghezza disponibile è sufficiente</td></tr><tr><td>Perforatore da 1,5 mm </td><td>Harris Uni-Core</td><td>Z708836-25EA.25</td><td></td></tr><tr><td>% Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Microsfere di solfato</td><td>Invitrogen</td><td>F8858</td><td>4.0 &mu; m, fluorescente rosso (lunghezza d'onda di eccitazione 580/lunghezza d'onda di emissione 605)</td></tr> <tr><td>Fotoresist AZ 9260 </td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sviluppatore AZ 400 K</td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di tetrametilammonio (TMAH) 25% </td><td></td><td></td><td>fornito dalla camera bianca Virginia Tech</td></tr><tr><td>Rivestimento</td><td></td><td></td> in teflon <td>applicato utilizzando la macchina DRIE</td></tr><tr><td>Silicone wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td>100 mm di diametro, 500 &mu; m di spessore, lucidato su un lato (SSP) </td></tr><tr><td>Mordenzatura ionica reattiva profonda (DRIE)</td><td>Alcatrel</td><td>AMS SDE 100</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento privo di etichetta e di arricchimento delle cellule attraverso contactless dielettroforesi

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielettroforesi (DEP) è il fenomeno per cui polarizzati particelle in un campo elettrico non uniforme subiscono traslazione, e può essere usato per dirigere il movimento di microparticelle in un marcatore indipendente maniera superficie. Tradizionalmente, i dispositivi DEP includono elettrodi metallici planari fantasia nel canale del campione. Questo approccio può essere costoso e richiede ambienti sterili specializzato. Recentemente, è stato sviluppato un approccio senza contatto chiamato dielettroforesi contactless (CDEP). Questo metodo utilizza il principio classico della DEP evitando il contatto diretto tra elettrodi e campione patterning elettrodi fluidici e un canale di esempio da un&#39;unica polidimetilsilossano (PDMS) substrato, e ha un&#39;applicazione come strategia microfluidica rapido progettata per ordinare e arricchire microparticelle. Unico a questo metodo è che il campo elettrico viene generato tramite canali elettrodi fluidici contenenti un fluido altamente conduttivo, che sono separati dalcanale del campione da una barriera isolante sottile. Perché elettrodi metallici non contattare direttamente il campione, l&#39;elettrolisi, l&#39;elettrodo delaminazione, e la contaminazione del campione sono evitati. Inoltre, ciò consente un processo di fabbricazione poco costoso e semplice. CDEP è quindi particolarmente adatto per la manipolazione di particelle biologiche sensibili. La forza dielettroforetica agisce sulle particelle dipende non solo su gradienti spaziali del campo elettrico generato da disegno personalizzabile della geometria del dispositivo, ma le proprietà biofisiche intrinseche della cella. Come tale, CDEP è una tecnica priva di etichetta che evita a seconda biomarcatori molecolari-superficie espressa che possono essere variamente espresse all&#39;interno di una popolazione, pur consentendo la caratterizzazione, l&#39;arricchimento, e smistamento di bioparticelle. Qui, dimostriamo le basi di fabbricazione e sperimentazione utilizzando CDEP. Spieghiamo la semplice preparazione di un chip CDEP con litografia sofficetecniche di y. Discutiamo la procedura sperimentale per la caratterizzazione frequenza di incrocio di una particella o cella, la frequenza alla quale la forza dielettroforetica è zero. Infine, dimostriamo l&#39;uso di questa tecnica per l&#39;ordinamento di una miscela di cellule di cancro ovarico e fluorescenti microsfere (sfere).

DEP deve osservare qualitativamente nel canale del campione per confermare il dispositivo è in funzione quando il campo elettrico è presente. Un metodo per verificare la presenza di DEP è quello di regolare la frequenza di valori lontana dalla frequenza di crossover dove forte PDEP e NDEP sono previsti (circa&gt; 40 kHz osservare PDEP e &lt;10 kHz osservare NDEP per la maggior parte delle cellule tumorali di mammifero in un buffer con conducibilità di 100 mS / cm). Va notato che le microsfere inerti presentano PDEP sotto della loro frequenza di crossover e NDEP sopra loro frequenza di crossover. Per la funzione geometria dente di sega qui presentato, PDEP dovrebbe essere visto per le cellule alla frequenza di prova più elevata, indicata dal verificarsi di perla concatenamento e focalizzazione delle cellule o particelle alla caratteristica bordo a dente di sega del canale, mentre alla frequenza di prova inferiore, NDEP dovrebbe essere evidente come le cellule sono limitate alla regione più vicina al bordo diritto del canale. A queste basse frequenze, le cellule possono LYSe causa di elettroporazione, in modo che il campione può sembrare che contenga meno cellule, e quelli che sono visibili potrebbero apparire allargata o sfocate se si utilizza un colorante fluorescente enzimaticamente attiva. Verifica delle frequenze alle quali PDEP e NDEP verificano permette la determinazione della frequenza di taglio come descritto nel protocollo. Per le cellule tumorali di mammifero, come MOSE-L usato qui, abbiamo osservato NDEP a 5 kHz (figura 5a) e forte PDEP a 60 kHz (Figura 5b). Cellule MOSE-L aveva un diametro di 17,7 ± 3,3 micron (n = 268 cellule) e le perle hanno un diametro nominale 4 micron. Un&#39;analisi completa delle proprietà dielettriche delle cellule MOSE-L rispetto alle cellule Mosè in precedenti fasi di progressione può essere trovato nel recente lavoro di Salmanzadeh et al 33. Se PDEP e NDEP non si attiene a questi estremi, vari problemi potrebbero essere accadendo. La conducibilità campione può essere troppo alta a causa contaminanti o lisi cellulare. INSUFFICIENTEcampo elettrico nt può essere generato a causa di bolle intrappolate nei canali elettrodi fluido, che impediscono conduzione di corrente alla porzione dei canali confinanti con il canale del campione. Moto vario può essere causato da una bolla intrappolata nella siringa o tubo di ingresso, bolle risultante dal non tenere il dispositivo sotto vuoto per un tempo sufficiente o non riempire rapidamente il dispositivo su rimozione dal vuoto, perdite dovute a delaminazione di PDMS scarsa aderenza con la vetrino, lacrime nella membrana di barriera a causa di forza eccessiva esercitata durante il riempimento dei canali, o portate agli estremi del campo di funzionamento della pompa. Oltre a determinare la frequenza di taglio di celle, questa tecnica può essere utilizzata per ordinare una miscela, illustrata qui da una miscela di cellule MOSE-L e perline. Questo esempio sfrutta la dielettroforesi negativa (NDEP) esibito da 4 micron sfere a frequenze dove le cellule MOSE-L sperimentano dielettroforesi positiva (PDEP). Siamo operated il dispositivo a 200 V RMS e 10 kHz (Fig. 6a) e hanno osservato che sia le cellule e perline sono state mescolate come hanno vissuto NDEP. A 50 kHz abbiamo osservato movimento delle cellule MOSE-L alla sommità del canale, mentre perle sono state limitate alla porzione inferiore del canale, consentendo la separazione della miscela in due componenti (Figura 6b). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> Figura 5. La posizione delle cellule MOSE-L viene manipolata variando la frequenza del campo elettrico applicato. Le foto sono prese alla funzione dente di sega finale del canale del campione e gli elettrodi fluidici sono situate agli angoli sul lato destro. Sono pieni di PBS contenente rodamina B, che reagisce di visualizzare i canali. (A) le cellule MOSE-L esperienza NDEP a 200 V RMS<html> e 5 kHz. (b) le cellule MOSE-L sperimentano concatenamento di perle e PDEP a 200 V RMS e 60 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> Figura 6. Una miscela di cellule MOSE-L (verde) e 4 micron perline (rosso) fluire attraverso la funzione dente di sega finale nel canale campione di un dispositivo CDEP bassa frequenza. (A) a 200 V e 10 kHz cellule e perline vengono miscelati. Le frecce indicano apparire vagamente cellule che probabilmente sono morti a causa delle condizioni di scarsa frequenza. (B) A 200 V e 50 kHz cellule sperimentano PDEP e si muovono verso il bordo caratteristica del canale, mentre perle di esperienza NDEP e rimangono confinati alla regione più vicina il regolo.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura.

Contactless dielettroforesi (CDEP) realizza l&#39;ordinamento e l&#39;arricchimento delle particelle attraverso le loro intrinseche proprietà dielettriche. Canali elettrodi fluidici sostituire gli elettrodi metallici tradizionali per DEP, adattandosi CDEP per non danneggiare la caratterizzazione sterile e smistamento delle particelle biologiche. Dimostriamo come preparare un Microdevice CDEP e condurre la caratterizzazione delle cellule e sperimentazioni di ordinamento.

Isolamento privo di etichetta e di arricchimento delle cellule attraverso Contactless dielettroforesi

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un moto traslatorio di cellule sospese in un flusso generato da pressione mediante elettroforesi di un colorante, senza mettere a contatto con il campione gli elettrodi. Questo risultato si ottiene innanzitutto sospendendo le cellule di interesse in un tampone a bassa conducibilità. Il secondo passaggio consiste nel caricare il dispositivo microfluidico con la sospensione cellulare e introdurre un fluido altamente conduttivo nei canali degli elettrodi.Successivamente, il dispositivo preparato viene collegato all'elettronica ad alta tensione e la risposta in frequenza del movimento delle cellule viene registrata mediante un video fornito da una telecamera collegata a un microscopio invertito. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le immagini video per prevedere quantitativamente le proprietà elettriche delle cellule. In definitiva, l'elettroforesi dielettrica senza contatto viene utilizzata per dimostrare che cellule con diverse proprietà elettriche possono essere separate in modo privo di etichette e non dannoso, impiegando dispositivi microfluidici economici e semplici da realizzare.Questo metodo è quindi utile per applicazioni come la separazione di cellule vive da quelle morte, l'isolamento di cellule tumorali iniziatrici, la separazione di cellule cancerose in base allo stadio e lo studio degli effetti dei farmaci su diverse cellule attraverso le loro proprietà dielettriche. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il sorting cellulare attivato da fluorescenza, sono che le cellule possono essere separate e caratterizzate in base alle loro proprietà biofisiche intrinseche senza la necessità di etichettarle mediante biomarcatori e che la sterilità del campione può essere mantenuta eliminando il contatto diretto tra gli elettrodi e il campione. Abbiamo avuto questa idea inizialmente quando volevamo sviluppare una tecnica in grado di evitare diversi problemi associati ai tradizionali dispositivi di dielettroforesi, come la contaminazione del campione, l'elettrolisi e la fabbricazione costosa.Per l'isolamento di cellule di mammifero. Seguire le procedure precedentemente descritte utilizzando photoresist ed etching ionico reattivo profondo per incidere il disegno desiderato dei canali in una piastrina di silicio, depositando uno strato sottile di Teflon per migliorare il rilascio del microdispositivo dalla piastrina. Avvolgere la piastrina con carta d'alluminio per prevenire fuoriuscite.Mescolare il polimetilalano o il PDMS in un rapporto di 10 a 1 tra elastomero e agente indurente DGA per circa 20 minuti e versare sulla piastrina. Successivamente, riscaldare la piastrina per 45 minuti a 100 gradi Celsius per evitare danni al rivestimento in Teflon del timbro dopo il raffreddamento. Rimuovere la pellicola di alluminio.Tagliare il PDMS utilizzando una lama chirurgica e praticare fori di accesso all'ingresso e all'uscita del canale. Utilizzare un punzone smussato adatto alla dimensione del tubo; in questo caso, si utilizza un punzone smussato da 1,5 millimetri. Successivamente, pulire una lamella di vetro per microscopio come indicato nel protocollo descritto nel testo.Pulire il dispositivo in PDMS utilizzando nastro adesivo Scotch Magic. Esaminare al microscopio per verificare che i canali siano puliti. Successivamente, esporre il vetrino e il dispositivo in PDMS a plasma d'aria per due minuti, quindi premere saldamente il lato del dispositivo con i canali contro il vetrino di vetro, evitando la formazione di bolle d'aria tra il dispositivo e il vetrino.Preparare un buffer a bassa conducibilità come descritto nel protocollo testuale, che verrà indicato come buffer DEP. Sospendere le cellule nel buffer DEP a una concentrazione di 3 milioni di cellule per millilitro; in questo caso si utilizzano cellule tumorali di topo in stadio avanzato, cellule epiteliali della superficie ovarica o cellule L di muschio, dopo aver colorato le cellule con un colorante fluorescente permeabile alla membrana. Misurare la conducibilità della sospensione cellulare colorata.La conducibilità dovrebbe essere di circa 100 microsiemens per centimetro. Se la misurazione della conducibilità è troppo elevata, centrifugare il campione. Ri-sospendere nel buffer profondo e ripetere la misurazione della conducibilità.L'aspetto più difficile di questo protocollo consiste nell'evitare bolle nei canali degli elettrodi e nel canale del campione: le bolle nei canali degli elettrodi possono impedire la formazione di connessioni elettrolitiche, mentre quelle nel canale del campione possono ostacolare un flusso costante. Assicurarsi di eseguire i passaggi illustrati per evitare la formazione di bolle e garantire un flusso stabile prima di caricare il chip microfluidico C dip. Posizionarlo sotto vuoto per 30 minuti.Nel frattempo, tagliare un pezzo di tubo flessibile in modo che copra la distanza tra la pompa per siringa e la piastra del microscopio dove sarà posizionato il chip microfluidico. È necessaria una lunghezza di sei pollici. Inserire il tubo sull'estremità dell'ago della siringa.Quindi stimare la lunghezza necessaria per il tubo di uscita dividendo il volume target del campione raccolto per l'area della sezione trasversale del tubo. Tagliare il tubo alla lunghezza richiesta. Successivamente, aspirare la sospensione cellulare in una siringa.Verificare che non ci siano bolle d'aria all'interno del tubo o della siringa. Dopo aver rimosso il chip dal vuoto, inserire il tubo di uscita e preparare rapidamente il canale del campione. Per evitare bolle d'aria intrappolate nei canali, battere leggermente sulla siringa durante la preparazione.Per evitare di rompere la sottile barriera isolante e per condizionare rapidamente i canali degli elettrodi, posizionare delle punte di pipetta vuote in un'uscita di ciascun canale fluidico dell'elettrodo e pipettare 200 microlitri di PBS contenente una piccola quantità di bromo B. Toccare delicatamente per introdurre il liquido nell'estremità opposta del canale dell'elettrodo. Mantenere una pressione delicata finché il PBS con bromo B avanza visibilmente verso la punta della punta di pipetta vuota; ripetere per ciascun elettrodo. Il canale R domine B viene utilizzato solo per fluorescenza.Visualizzare i canali degli elettrodi fluidici dopo la preparazione. Riempire ogni serbatoio della punta della pipetta con PBS, con R domine B. Evitare la formazione di bolle nei serbatoi delle punte della pipetta e rimuovere eventuali bolle visibili pipettando delicatamente su e gi&ugrave;. Staccare il tubo di uscita e smaltirlo correttamente.Quindi inserire un nuovo serbatoio per il tubo di uscita. Raccogliere il volume desiderato. Posizionare il chip sul palchetto di un microscopio invertito dotato di fotocamera digitale.Montare la siringa sulla pompa per siringhe e inserire gli elettrodi metallici nei serbatoi del canale elettrodico fluidico; far passare il fluido a un millilitro all'ora per garantire un buon contatto tra la pompa per siringhe e la siringa. Ispezionare visivamente la lunghezza del canale per assicurare un flusso ininterrotto delle cellule e l'assenza di bolle o perdite. Ridurre quindi la portata a cinque microlitri all'ora.Per motivi di sicurezza. Verificare l'elettronica accendendo il generatore di funzioni, l'amplificatore ad alta tensione e l'oscilloscopio, quindi regolare la tensione e la frequenza desiderate. In questo caso, questi parametri sono 200 volt e 20 kilohertz.Dopo aver verificato un rendimento accettabile, spegnere l'alimentazione. Quindi collegare gli elettrodi all'amplificatore ad alta tensione. Dopo aver ottenuto un flusso stabile, applicare la tensione desiderata alla frequenza desiderata. In questo esperimento, la tensione è di 200 volt RMS a frequenze comprese tra cinque e 60 chilohertz.Registrare i file video della risposta cellulare mediante tecniche di elaborazione delle immagini per quantificare la distribuzione delle cellule nel canale e per caratterizzare la frequenza di crossover. A tale scopo, mantenere una tensione costante e variare sistematicamente la frequenza all'inizio e alla fine dell'esperimento, nonché in modo casuale tra le diverse prove sperimentali. Registrare la distribuzione delle cellule di controllo, ovvero la distribuzione delle cellule in assenza di campo elettrico.Dopo aver impostato un nuovo intervallo di frequenza, attendere il tempo necessario affinché le cellule fluiscano dall'ingresso fino alla posizione monitorata e quindi iniziare la registrazione; procedere quindi con l'elaborazione delle immagini per la caratterizzazione della frequenza di crossover come descritto nel protocollo testuale. Sospendere la miscela desiderata nel buffer DEP a una concentrazione totale di 3 milioni di particelle per millilitro. In questo caso, la miscela è composta da cellule L di muschio e da microsfere fluorescenti di quattro micrometri nel buffer DEP; eseguire i passaggi precedentemente descritti. Per preparare un dispositivo CEP, far funzionare l'esperimento a una frequenza compresa tra le due frequenze di crossover determinate per le cellule bersaglio e le particelle di fondo, in modo che le due popolazioni di particelle subiscano forze DEP in direzioni opposte.Per raccogliere il contenuto di un campione misto, rimuovere il tubo di uscita al raggiungimento del volume target posizionando un dito di un guanto sull'apertura di uscita e tirando delicatamente sul tubo. Versare il volume raccolto in un serbatoio per ulteriori analisi. Per cellule tumorali di mammifero, come le cellule L maggiormente utilizzate in questo caso, è stata osservata una DEP negativa a cinque chilohertz e una marcata DEP positiva.Alle 60 chilohertz, le cellule MOS L hanno un diametro di 17,7 ± 3,3 micrometri, mentre le microsfere hanno un diametro nominale di quattro micrometri. Oltre a determinare la frequenza di crossover delle cellule, questa tecnica può essere utilizzata per separare una miscela, illustrata qui da una miscela di cellule MO'S L e microsfere. Questo esempio sfrutta la dielettroforesi negativa esibita dalle microsfere di quattro micrometri a frequenze alle quali le cellule MO'S L subiscono dielettroforesi positiva.Quando il dispositivo è stato utilizzato a 200 volt RMS e 10 kilohertz, entrambe le cellule mostrate in verde e i microsferini mostrati in rosso sono stati mescolati poiché hanno subito una DEP negativa a 50 kilohertz. È stato osservato il movimento delle cellule MOS L verso la parte superiore del canale, mentre i microsferini sono rimasti confinati nella porzione inferiore del canale, consentendo la separazione della miscela in due componenti. Seguendo questa procedura, altre tecniche possono essere eseguite a valle, come la coltura cellulare e l'analisi mediante imaging a immunofluorescenza o saggi biochimici, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come le proprietà dielettriche si correlino alle caratteristiche fisiche delle cellule.Pertanto, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha effettivamente aperto la strada ai biologi per studiare come le variazioni indotte dai metaboliti nello scheletro citoplasmatico della cellula possano essere correlate alle loro proprietà dielettriche utilizzando un modello di cancro ovarico murino. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come arricchire e ordinare le cellule mediante elettroforesi senza contatto.

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