Isolamento privo di etichetta e di arricchimento delle cellule attraverso Contactless dielettroforesi

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre il movimento traslazionale delle cellule sospese in un flusso guidato dalla pressione utilizzando l'elettroforesi del colorante senza entrare in contatto con gli elettrodi del campione. Ciò si ottiene sospendendo prima le celle di interesse in un tampone a bassa conducibilità. Il secondo passo consiste nel caricare il dispositivo microfluidico con la sospensione cellulare e introdurre un fluido altamente conduttivo nei canali degli elettrodi.

Successivamente, il dispositivo preparato viene collegato all'elettronica ad alta tensione e la risposta in frequenza del movimento della cella viene registrata da un video alimentato da una telecamera collegata a un microscopio invertito. Il passaggio finale consiste nell'analizzare le immagini video per prevedere quantitativamente le proprietà elettriche delle celle. In definitiva, l'elettroforesi senza contatto viene utilizzata per dimostrare che le celle con diverse proprietà elettriche possono essere ordinate in modo non dannoso senza etichetta, utilizzando dispositivi microfluidici economici e semplici da fabbricare.

Quindi questo metodo è utile per applicazioni come la selezione di cellule vive da morte, l'isolamento del tumore, l'avvio delle cellule, la separazione delle cellule tumorali in base allo stadio e l'osservazione degli effetti dei farmaci su diverse cellule nelle loro proprietà dielettriche. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, è che le cellule possono essere ordinate e caratterizzate in base alle loro proprietà biofisiche intrinseche senza la necessità di marcature basate su biomarcatori e anche che la sterilità del campione può essere mantenuta eliminando il contatto tra gli elettrodi e il campione. Beh, abbiamo avuto questa idea per la prima volta quando volevamo sviluppare una tecnica che evitasse molti dei problemi come la contaminazione del campione, l'elettrolisi, la costosa fabbricazione e questo è associato ai tradizionali dispositivi elettroforetici.

Per isolare le cellule dei mammiferi. Seguire le procedure precedentemente riportate utilizzando il fotoresist e l'incisione ionica reattiva profonda per incidere il design del canale desiderato in un wafer di silicio, depositando un sottile strato di teflon per migliorare il rilascio del micro dispositivo dal wafer. Avvolgere il wafer con un foglio di alluminio per evitare fuoriuscite.

Mescolare il polimetilalano o PDMS in un rapporto di 10 a uno tra elastomero e agente indurente DGA per circa 20 minuti e versare sul wafer. Quindi scaldare il wafer per 45 minuti a 100 gradi Celsius per evitare di danneggiare il rivestimento in teflon del timbro dopo il raffreddamento. Rimuovere il foglio di alluminio.

Tagliare il PDMS utilizzando una lama chirurgica e praticare i fori di accesso all'uscita di ingresso del canale. Utilizzando un perforatore smussato adatto alle dimensioni del tubo qui, viene utilizzato un perforatore smussato da 1,5 millimetri. Quindi, pulire un vetrino da microscopio in vetro come indicato nel protocollo di testo.

Pulire il dispositivo PDMS utilizzando il nastro Scotch Magic. Esamina al microscopio per assicurarti che i canali siano puliti. Quindi esporre il vetrino e il dispositivo PDMS al plasma d'aria per due minuti, premere con decisione il lato del canale del dispositivo sul vetrino, evitando la formazione di bolle d'aria tra il dispositivo e il vetrino.

Preparare un tampone a bassa conducibilità come descritto nel protocollo di testo, che verrà indicato come tampone DEP. Sospendi le cellule nel tampone DEP a 3 milioni di cellule per millilitro qui vengono utilizzate cellule L cancerose, di topo in stadio avanzato, epiteliali della superficie ovarica o di muschio dopo aver tinto le cellule utilizzando una membrana fluorescente. Il colorante permeabile misura la conducibilità della sospensione della cella dy.

La conducibilità dovrebbe essere di circa 100 microsiemens per centimetro. Se la misura della conducibilità è troppo alta, ruotare il campione verso il basso. Sospendere in profondità e ripetere la misura della conducibilità.

L'aspetto più difficile di questo protocollo è evitare bolle nei canali degli elettrodi e le bolle del canale del campione nei canali degli elettrodi possono impedire le connessioni dell'elettroforo e le bolle nel canale del campione possono impedire un flusso costante. Assicurarsi di eseguire i passaggi dimostrati per evitare bolle e garantire un flusso costante Prima di caricare il chip microfluidico C dip. Mettetelo sotto vuoto per 30 minuti.

Nel frattempo, tagliare un pezzo di tubo flessibile per coprire la distanza dalla pompa a siringa allo stadio del microscopio dove si troverà il chip microfluidico. È necessaria una lunghezza di sei pollici di tubo. Montare il tubo sulla punta dell'ago della siringa.

Quindi stimare la lunghezza richiesta per il tubo di uscita dividendo il volume del campione raccolto per l'area della sezione trasversale del tubo. Tagliare la lunghezza richiesta del tubo. Quindi, aspirare la sospensione cellulare in una siringa.

Verificare che non vi siano bolle nel tubo o nella siringa. Dopo aver rimosso il chip dal vuoto, inserire il tubo di uscita e adescare rapidamente il canale del campione. Per evitare bolle d'aria intrappolate nei canali, picchiettare delicatamente la siringa durante l'adescamento.

Per evitare la rottura della sottile barriera isolante per adescare i canali dell'elettrodo, posizionare rapidamente i puntali della pipetta vuoti in un'uscita di ciascun canale dell'elettrodo fluidico, pipettare 200 microlitri di PBS contenenti una piccola quantità di bromo B.E picchiettare delicatamente per introdurre il fluido nell'estremità opposta del canale dell'elettrodo. Mantenere una pressione delicata fino a quando il PBS con bromo B non avanza visibilmente lungo la punta del puntale della pipetta vuoto, ripetere l'operazione per ogni elettrodo. Il canale R domine B viene utilizzato solo in modo fluorescente.

Visualizzare i canali degli elettrodi fluidici dopo l'adescamento. Riempire ogni serbatoio del puntale della pipetta con PBS, con R domine B.Evitare la formazione di bolle nei serbatoi del puntale della pipetta e rimuovere eventuali bolle visibili pipettando delicatamente su e giù. Staccare il tubo di uscita e gettarlo in modo appropriato.

Quindi inserire un nuovo serbatoio del tubo di uscita. Raccogliere il volume di destinazione. Posizionare il chip sul tavolino di un microscopio invertito dotato di fotocamera digitale.

Montare la siringa sulla pompa a siringa e inserire gli elettrodi a filo nei serbatoi del canale dell'elettrodo fluidico, pompare il fluido a una millilitro all'ora per garantire un buon contatto tra la pompa a siringa e la siringa. Ispezionare visivamente la lunghezza del canale per garantire un flusso senza ostacoli delle celle e l'assenza di bolle o perdite. Quindi ridurre la portata a cinque microlitri all'ora.

Per la sicurezza. Testare l'elettronica accendendo il generatore di funzioni, l'amplificatore ad alta tensione e l'oscilloscopio e regolando la tensione e la frequenza desiderate. Qui questi parametri sono 200 volt e 20 kilohertz.

Dopo aver verificato le prestazioni accettabili, spegnere l'alimentazione. Quindi collegare gli elettrodi all'amplificatore ad alta tensione. Dopo aver raggiunto un flusso costante, applicare la tensione desiderata alla frequenza desiderata In questo esperimento, la tensione è di 200 volt RMS a frequenze comprese tra cinque e 60 kilohertz.

Registrare i file video della risposta cellulare con tecniche di elaborazione delle immagini per quantificare la distribuzione cellulare nel canale e per caratterizzare la frequenza di crossover. Per fare ciò, mantenere una tensione costante e variare la frequenza sistematicamente all'inizio e alla fine dell'esperimento, nonché in modo casuale tra le esecuzioni sperimentali. Registrare la distribuzione delle celle di controllo, che è la distribuzione delle celle senza applicare alcun campo elettrico.

Dopo aver impostato una nuova frequenza, attendere, la quantità di tempo necessaria affinché le cellule fluiscano dall'ingresso alla posizione monitorata e quindi iniziare la registrazione, procedere all'esecuzione dell'elaborazione dell'immagine per caratterizzare la frequenza di crossover come descritto nel protocollo di testo, sospendere la miscela desiderata nel tampone DEP a una concentrazione totale di 3 milioni di particelle per millilitro. Qui questa miscela è di muschio L cellule con quattro microsfere fluorescenti in tampone DEP che eseguono i passaggi precedentemente descritti. Per preparare un dispositivo CEP, far funzionare l'esperimento a una frequenza compresa tra le due frequenze di crossover determinate delle cellule bersaglio e delle particelle di fondo in modo che le due popolazioni di particelle subiscano forze DEP in direzioni opposte.

Per raccogliere il contenuto di un campione assortito, rimuovere il tubo di uscita dopo aver raccolto il volume target posizionando un dito del guanto sull'apertura di uscita e tirando delicatamente il tubo. Versare il volume target raccolto in un serbatoio per ulteriori analisi. Per le cellule tumorali dei mammiferi, come la maggior parte delle cellule L utilizzate qui, è stato osservato un DEP negativo a cinque kilohertz e un DEP fortemente positivo.

A 60 kilohertz le celle MOS L hanno un diametro di 17,7 più o meno 3,3 micrometri e le perle hanno un diametro nominale di quattro micrometri. Oltre a determinare la frequenza di crossover delle cellule, questa tecnica può essere utilizzata per ordinare una miscela illustrata qui da una miscela di cellule L MO e perline. Questo esempio sfrutta la dielettroforesi negativa esibita da quattro microsfere a frequenze in cui le cellule L di MO sperimentano una dielettroforesi positiva.

Quando il dispositivo è stato utilizzato a 200 volt RMS e 10 kilohertz, entrambe le celle mostrate qui in verde e le perline mostrate qui in rosso sono state mescolate poiché hanno sperimentato un DEP negativo a 50 kilohertz. È stato osservato il movimento delle cellule MOS L verso la parte superiore del canale mentre le perle erano limitate alla parte inferiore del canale, consentendo la separazione della miscela in due componenti. Quindi, seguendo questa procedura, altre tecniche possono essere condotte a valle, come la coltura cellulare e l'imaging in immunofluorescenza o saggi biochimici per rispondere a ulteriori domande come il modo in cui le proprietà dielettriche sono correlate alle loro caratteristiche fisiche delle cellule.

Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha davvero aperto la strada ai biologi per studiare come i cambiamenti indotti dai metaboliti nel citoscheletro della cellula possano essere correlati alle loro proprietà dielettriche utilizzando un modello di cancro ovarico di topo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come arricchire e ordinare le cellule utilizzando l'elettroforesi senza contatto.