Mitocondriale di Ca^{2 +} ritenzione capacità Assay e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale nel rigonfiamento mitocondriale indotto dal calcio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio della disfunzione mitocondriale, come il metabolismo energetico anormale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto semplice ed efficace.

Per iniziare, semina circa tre milioni di cellule SH-SY5Y per piastra di coltura cellulare da 10 centimetri. Rimuovere il terreno e lavare le cellule con circa un millilitro di PBS ghiacciato in una piastra di coltura cellulare da 10 centimetri per tre volte. Aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato nel piatto di coltura cellulare da 10 centimetri e raschiare le cellule aderenti in una nuova provetta da 1,5 millilitri.

Centrifugare a 800 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Durante la centrifugazione, preparare cinque millilitri di tampone di isolamento mitocondriale, integrato con 50 microlitri di soluzione madre di inibitore della proteasi. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un millilitro di tampone di isolamento mitocondriale.

Incubare la provetta da 1,5 millilitri con ghiaccio per 30 minuti. Quindi, lisare le cellule sospese con un omogeneizzatore di vetro, su e giù manualmente su ghiaccio. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 1,5 millilitri.

Quindi, centrifugare a 1.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri prima di centrifugare nuovamente come prima. Dopo aver trasferito il surnatante in una nuova provetta, centrifugare a 14.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet contenente i mitocondri con un millilitro di tampone di isolamento mitocondriale. Quindi centrifugare la soluzione per 15 minuti a 14.000 volte G e quattro gradi Celsius per far precipitare i mitocondri. Il pellet di mitocondri risultante deve essere conservato su ghiaccio e risospeso in 50-100 microlitri di terreno di cloruro di potassio, a seconda del volume del pellet prima di qualsiasi analisi.

Infine, utilizzare cinque microlitri di soluzione mitocondriale per misurare la concentrazione di proteine mitocondriali mediante il test BCA standard, misurando OD562 utilizzando un lettore di piastre. Preparare il terreno di cloruro di potassio e aggiungere il colorante fluorescente verde legante il calcio a una concentrazione finale di 0,5 micromolari prima dell'esperimento. Per determinare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale, trasferire prima un millilitro di mitocondri isolati in terreni di cloruro di potassio contenenti 0,5 micromolari di colorante fluorescente verde legante il calcio in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Incubare i mitocondri e il colorante fluorescente verde legante il calcio nella piastra a sei pozzetti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce ambientale per un minuto. Dopo l'incubazione, aggiungere aliquote di quattro microlitri alla soluzione di cloruro di calcio da 20 millimolari a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti utilizzando l'impostazione di erogazione automatica per introdurre 200 nanomoli di calcio per milligrammo di proteina mitocondriale. Utilizzare lo spettrometro fluorescente per monitorare le variazioni di fluorescenza ogni tre secondi per due minuti con una lunghezza d'onda di eccitazione di 506 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 531 nanometri.

La piastra è dotata di agitazione a 600 giri/min per tre secondi tra una lettura e l'altra, controllata da software. Aggiungere altri quattro microlitri di soluzione di cloruro di calcio da 20 millimolari a ciascun pozzetto, quindi monitorare le variazioni di fluorescenza ogni tre secondi per due minuti. Per determinare il rigonfiamento mitocondriale indotto dal calcio, trasferire un millilitro di mitocondri isolati in terreni di cloruro di potassio in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Quindi, aggiungere 10 microlitri di soluzione acquosa di cloruro di calcio da 20 millimolari alla proteina mitocondriale per innescare il gonfiore mitocondriale. Utilizzando un lettore di micropiastre controllato da software, registrare la diminuzione dell'assorbanza ogni tre secondi per 10 minuti a 540 nanometri. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi della capacità di ritenzione mitocondriale del calcio di bongkrekic, un inibitore del poro di transizione della permeabilità mitocondriale indotta dal calcio, o MPTP, che apre l'atractyloside, un attivatore dell'apertura MPTP indotta dal calcio e un controllo in bianco.

La capacità nel trattamento bongkrekic è molto più alta rispetto al gruppo atractyloside, come previsto. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi del gonfiore mitocondriale indotto dal calcio di bongkrekic, atractyloside e il controllo senza trattamento. La diminuita assorbanza monitorata a 540 nanometri indica i rigonfiamenti mitocondriali.

I risultati suggeriscono che BKA può inibire l'apertura MPTP, mentre ATR può facilitare l'apertura MPTP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere tutte le soluzioni in ghiaccio.