Name: Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Impara a valutare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale e il gonfiore indotto da Ca²⁺ in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y. Questo metodo semplice permette di studiare la disfunzione mitocondriale e il metabolismo energetico cellulare.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da parte di grant della eccezionale scienziato dello Shandong (JQ201421) e grant da NSFC (81371226).

1. isolamento dei mitocondri
Nota: Tutte le soluzioni e apparecchiature dovrebbe essere preraffreddate a 0 - 4 ° C e tenute su ghiaccio.
<ol><li>Seme circa 3 x 106 SH-SY5Y cellule per piastra di coltura delle cellule di 10 cm. Cellule di cultura in alto-glucosio Dulbecco s modified medium di Eagle con 10% siero bovino fetale, penicillina (100 U/mL)-streptomicina (100 µ g/mL). Mantenere a 37 ° C in un incubatore contenente 5% CO2 durante la notte. Nota: almeno 1-2 x 107 SH-SY5Y cellule sono necessari per ciascun test di isolamento.</li>
	<li>Rimuovere il supporto e lavare le cellule con circa 1 mL di PBS freddo di ghiaccio in una piastra di coltura cellulare di 10cm 3 volte.</li>
	<li>Aggiungere nuovo 1 mL di PBS freddo ghiaccio nella piastra di coltura cellulare di 10cm e raschiare le celle aderenti in una nuova provetta da 1,5 mL. Centrifuga a 800 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Durante la centrifugazione, preparare il tampone di isolamento mitocondriale di 5 mL (250 mM saccarosio, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina ethanesulfonic acido), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) completato con 50 µ l di brodo di inibitori di proteasi soluzione (una concentrazione di 100 x; 1 compressa EDTA-libero dissolto in 500 µ l di ddH2O).</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 1 mL di tampone di isolamento mitocondriale. Incubare la provetta da 1,5 mL in ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Lisare le cellule sospese con un omogeneizzatore di vetro (15-25 colpi) su e giù manualmente sul ghiaccio. Nota: Assicurarsi che non ci sono bolle quando le cellule sono omogeneizzate. Contare le cellule intatte e nuclei scoperti da microscopio visivamente e confermare che > rottura cellulare 90% si è verificato.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per rimuovere i detriti (nuclei e restanti cellule intatte).</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 14.000 x g per 15 min 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet contenente i mitocondri con 1 mL di tampone di isolamento mitocondriale.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione per 15 min a 4 ° C di 14.000 x g per precipitare i mitocondri.</li>
	<li>Il pellet di mitocondri risultante deve essere tenuto sul ghiaccio e risospesi in 50-100 media KCl μL (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1mm MgCl2, 20mm HEPES, 5mm glutammato, malate di 5 mM e 2 rotenone μM, pH 7.4) secondo il volume di pellet prima qualsiasi culo Ay.</li>
	<li>Utilizzare 5 μL di soluzione di mitocondriale per misurare la concentrazione di proteina mitocondriale di test standard di BCA, OD562 di misura utilizzando un lettore di piastra13.</li>
</ol>2. la determinazione della capacità di ritenzione di mitocondriale di Ca2 +
<ol><li>Preparare il supporto di KCl e aggiungere il Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde a una concentrazione finale di 0,5 μM prima dell'esperimento.</li>
	<li>Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in media di KCl che contengono 0,5 μM Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde in ogni piastra a 6 pozzetti bene.</li>
	<li>Incubare i mitocondri e il Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde nel piatto 6 pozzetti a temperatura ambiente al riparo dalla luce ambiente per 1 min. aggiungere 4 aliquote del μL di un soluzione di CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 da 20 mM 20 mM HEPES, 5mm glutammato, malate di 5 mM, pH 7.4) per ogni piastra a 6 pozzetti pozzetto usando l'automatico dispensa impostazione di introdurre 200 nmol proteina mitocondriale di Ca2 +/mg.</li>
	<li>Utilizzare uno spettrometro di fluorescenza per monitorare i cambiamenti di fluorescenza ogni 3 s per 2 min con una lunghezza d'onda di eccitazione di 506 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 531 nm. La piastra è dotata di agitazione a 600 rpm per 3 s tra letture controllato dal software (Figura 1).</li>
	<li>Aggiungere un'aliquota di ulteriori 4 μL di soluzione di 20 mM CaCl2 in ciascun pozzetto e monitorare i cambiamenti di fluorescenza ogni 3 s per 2 min. Ripetere questo passaggio finché la fluorescenza aumenta con il tempo. Nota: I mitocondri sono sfidati con l'aggiunto Ca2 + indicato dalla registrazione maggiore fluorescenza. Quando si apre il mPTP, la fluorescenza aumenta con il tempo.</li>
	<li>Interpretare la quantità totale di Ca2 + aggiunte fino a quando il mPTP apre come la capacità di ritenzione di Ca2 + .</li>
</ol>3. determinazione del Ca 2 +-indotto gonfiamento mitocondriale
<ol><li>Preparare il supporto di KCl prima dell'esperimento.<ol>
<li>Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in media di KCl in ogni piastra a 6 pozzetti bene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di 20 mM CaCl2 soluzione acquosa (500 nmol/mg di proteina mitocondriale) nella proteina mitocondriale di innescare gonfiamento mitocondriale.</li>
	<li>Registrare la diminuzione di assorbanza a 540 nm ogni 3 s su un lettore di micropiastre controllato dal software per 10 min (Figura 2). Le modifiche di fluorescenza sono causate da un afflusso di soluti attraverso la membrana mitocondriale interna. Nota: La diminuzione assorbanza a 540 nm corrisponde ai mitocondri gonfiati. Se il lettore non ha rispettato una diminuzione di assorbanza, un più lungo intervallo di lettura o di tempo di lettura può essere adottato.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
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<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. sole sotto la supervisione degli esperimenti. Wei Li eseguito gli esperimenti. Chen Zhang e X. Sun ha scritto il libro.

Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice ed efficace per il mitocondriale Ca2 + ritenzione capacità dosaggio e Ca2 +-attivato dosaggio gonfiamento mitocondriale.
Per l'isolamento mitocondriale, assicurarsi che tutti i materiali e i tubi sono sul ghiaccio, soprattutto quando le cellule di omogeneizzazione. 0,25% tripsina-EDTA può essere utilizzato anche per staccare le cellule dal piatto per 5 min a 37 ° C. Dopo 15-25 colpi, è necessario osservare la membrana delle ce...

I mitocondri sono i principali organi cellulari per produrre quasi il 95% del trifosfato di adenosina usato nelle cellule dei mammiferi di fosforilazione ossidativa. È stato riferito che la concentrazione micromolar sequestrata di Ca2 + dai mitocondri, la presenza di ADP e fosfato inorganico può essere utilizzato per fosforilare ADP a sintesi ATP1. Quando la concentrazione di Ca citosolico2 + supera una soglia, i mitocondri possono l'assorbimento di Ca2 + rapidamente e di efflusso e lentamente. Così, i mitocondri di funzionamento possono afflusso l'aumento citosolico Ca2 +. Irrilevante per la partecipazione nella fosforilazione ossidativa, il mitocondriale Ca2 + anche partecipare i segnali di calcio citosolico e attivare il meccanismo apoptotico mitocondriale inducendo l'apertura della mPTP nella parte interna mitocondriale membrana2. È stato ampiamente riconosciuto che l'elevazione anormale del intracellulare di Ca2 + può indurre mitocondriale gonfiamento voluminoso aprendo il mPTP3. Così, questo protocollo ha lo scopo di valutare la funzione mitocondriale di quantificare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale.
Capacità di ritenzione di CA2 + è la misura della capacità dei mitocondri di calcio citosolico di assorbimento. I mitocondri possono buffer il calcio libero citosolico e regolano i processi cellulari di calcio-dipendente dall'assorbimento di calcio sotto forma di precipitati inattivi. Capacità di ritenzione alterata Ca2 + si verifica nei fenomeni di stress associati a limitazione di energia e anche neurodegenerative malattie4,5. Mitocondri isolati o cellule della digitonina-permeabilized possono essere utilizzate per identificare la capacità di ritenzione di Ca2 + , e l'elevata capacità di accumulare Ca2 + di mitocondri isolati con il glutammato additonal e malate non avviene mediante il isolamento mitocondriale procedura6. Una quantità di Estratto titolata di digitonina deve essere utilizzata per permeabilize le membrane del plasma di diversi tipi di cellule. Il sale di hexapotassium di Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde, Ca2 +-indicatore luce-eccitabile visibile cellula-impermeant sensibile, è stato ampiamente usato7. CA2 +-associazione verde colorante fluorescente è un indicatore di bassa affinità e utilizzati per dimostrare che intracellulare Ca2 + le concentrazioni libere di continuare ad aumentare durante prolungato di stimolazioni (5 min)8. Questo metodo era meno sensibile che la tecnica di filtro radioattivo, ma è stato notevolmente semplificato. Ulteriori Ca2 + eleva fluorescenza verde di calcio e l'assorbimento di Ca2 + dai mitocondri ritorna la fluorescenza ai valori basali. Fino a quando i mitocondri non è riuscito a assorbimento extramitochondrial Ca2 + 9, sono state fatte aggiunte sequenziale di Ca2 + . Un lettore di micropiastre di fluorescenza può essere utilizzato per segnalare continuamente la fluorescenza verde di calcio.
Dopo Ca2 + accumulo, mitocondri depolarizzarono, scaricata Ca2 + nel terreno e ha cominciato a gonfiarsi. CA2 +-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. La microscopia elettronica e la diminuzione di luce assorbanza a 540 nm può essere usato per misurare il Ca2 +-innescato mitocondriale gonfiore10,11. Volume di mitocondri può essere determinata direttamente da angolo in avanti dispersione della luce12, dove diminuisce di assorbanza riflettono passiva gonfiore della matrice mitocondriale.
Qui, vi illustriamo la metodologia per esaminare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare SH-SY5Y</td><td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td><td>Numero ATCC: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Verde di calcio-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+-legante colorante fluorescente verde</td></tr><tr><td>inibitori completi della proteasi Roche</td><td>Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>omogeneizzatore di vetro</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>malato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Strumenti flash Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' ad alto contenuto di glucosio s Hyclone medio Eagle modificato</td><td></td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L di glucosio, L-glutammina, senza piruvato di sodio</td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Hyclone SV30087</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>Kit di test BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>piatto per coltura cellulare da 10 cm</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitocondriale di ca2 + ritenzione capacità assay e ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

La produzione di ATP da fosforilazione ossidativa è la funzione primaria dei mitocondri. I mitocondri negli eucarioti superiori partecipano anche Ca citosolico2 + buffer, e la produzione di ATP in mitocondriale può essere mediata da intramitochondrial Ca2 + concentrazione libera. Capacità di ritenzione di CA2 + può essere considerata come la capacità dei mitocondri di trattenere calcio nella matrice mitocondriale. Accumulato intracellulare Ca2 + conduce alla permeabilità della membrana mitocondriale interna, definito l'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), che conduce alla perdita di molecole con un molecolare peso meno di 1,5 kDa. CA2 +-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. Qui, descriviamo due saggi per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati. Dopo determinate quantità di Ca2 + vengono aggiunti, tutti i passaggi possono essere completati in un giorno e registrati da un lettore di micropiastre. Così, queste due analisi semplice ed efficace possono essere adottate per valutare il Ca2 +-relative funzioni mitocondriali.

Rappresentante risultati di Ca2 + capacità di ritenzione: Risultati sono stati espressi come valori di fluorescenza. Con gli ulteriori impulsi del Ca2 + (200 proteina mitocondriale nmols/mg), la fluorescenza aumentata del doppio di sopra della linea di base con l'apertura di mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inibitore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, o 1 μM atractyloside (ATR), un attivatore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, sono stati a...

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale nel gonfiamento mitocondriale indotto dal calcio. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio della disfunzione mitocondriale, come il metabolismo energetico anomalo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto semplice ed efficace.Per iniziare, seminare circa tre milioni di cellule SH-SY5Y per ogni piastra da coltura cellulare da 10 centimetri. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con circa un millilitro di PBS freddo su ghiaccio in una piastra da coltura cellulare da 10 centimetri per tre volte. Aggiungere un millilitro di PBS freddo su ghiaccio nella piastra da coltura cellulare da 10 centimetri e raschiare le cellule aderenti in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.Centrifugare a 800 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Durante la centrifugazione, preparare cinque millilitri di buffer per l'isolamento dei mitocondri, integrato con 50 microlitri di soluzione stock di inibitore delle proteasi. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet con un millilitro di buffer per l'isolamento dei mitocondri.Incubare il tubo da 1,5 millilitri su ghiaccio per 30 minuti. Successivamente, lisare le cellule sospese con un omogeneizzatore di vetro, muovendolo manualmente su e giù su ghiaccio. Trasferire l'omogenato in un tubo da 1,5 millilitri.Quindi, centrifugare a 1.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti. Dopo la centrifugazione, trasferire il sopranatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri prima di centrifugare nuovamente come in precedenza. Dopo aver trasferito il sopranatante in un nuovo tubo, centrifugare a 14.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet contenente i mitocondri con un millilitro di tampone per l'isolamento dei mitocondri. Centrifugare quindi la soluzione per 15 minuti a 14.000 ×g e a quattro gradi Celsius per precipitare i mitocondri. Il pellet di mitocondri ottenuto deve essere mantenuto sul ghiaccio e risospeso in 50-100 microlitri di mezzo di cloruro di potassio, in base al volume del pellet, prima di qualsiasi saggio.Infine, utilizzare cinque microlitri di soluzione mitocondriale per misurare la concentrazione proteica mitocondriale mediante saggio BCA standard, misurando l'OD562 con un lettore di piastre. Preparare il mezzo di cloruro di potassio e aggiungere il colorante verde fluorescente legante del calcio a una concentrazione finale di 0,5 micromolare prima dell'esperimento. Per determinare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale, trasferire prima un millilitro di mitocondri isolati in mezzo di cloruro di potassio contenente 0,5 micromolare di colorante verde fluorescente legante del calcio in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Incubare i mitocondri e il colorante verde fluorescente legante il calcio nella piastra a sei pozzetti a temperatura ambiente, protetta dalla luce ambientale, per un minuto. Al termine dell'incubazione, aggiungere aliquote di quattro microlitri della soluzione di cloruro di calcio 20 millimolare in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti utilizzando l'impostazione di dispensazione automatica per introdurre 200 nanomoli di calcio per milligrammo di proteina mitocondriale. Utilizzare lo spettrometro fluorescente per monitorare le variazioni di fluorescenza ogni tre secondi per due minuti con una lunghezza d'onda di eccitazione di 506 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 531 nanometri.La piastra è dotata di agitazione a 600 giri al minuto per tre secondi tra una lettura e l'altra, controllata tramite software. Aggiungere un'ulteriore aliquota di quattro microlitri di soluzione di cloruro di calcio 20 millimolare in ogni pozzetto, quindi monitorare le variazioni di fluorescenza ogni tre secondi per due minuti. Per determinare il rigonfiamento mitocondriale indotto dal calcio, trasferire un millilitro di mitocondri isolati in mezzo di cloruro di potassio in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Quindi, aggiungere 10 microlitri di soluzione acquosa di cloruro di calcio 20 millimolare alla proteina mitocondriale per indurre il gonfiamento mitocondriale. Utilizzando un lettore di micropiastre controllato da software, registrare la diminuzione dell'assorbanza ogni tre secondi per 10 minuti a 540 nanometri. Di seguito sono mostrati i risultati rappresentativi della capacità di ritenzione del calcio mitocondriale di bongkrekic, un inibitore dell'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale indotta dal calcio, o MPTP, di atractyloside, un attivatore dell'apertura del MPTP indotta dal calcio, e di un controllo bianco.La capacità nel trattamento con acido bongkrekico è molto maggiore rispetto al gruppo con atractiloside, come previsto. Vengono mostrati qui risultati rappresentativi del rigonfiamento mitocondriale indotto dal calcio in presenza di acido bongkrekico, atractiloside e nel controllo senza trattamento. La diminuzione dell'assorbanza monitorata a 540 nanometri indica i rigonfiamenti mitocondriali.I risultati suggeriscono che la BKA può inibire l'apertura del MPTP, mentre l'ATR può facilitare l'apertura del MPTP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutte le soluzioni sul ghiaccio.

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Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

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Saggio di captazione del calcio mitocondriale: un metodo basato su lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio nei mitocondri isolati

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Saggio dell'afflusso di calcio per misurare l'assorbimento mitocondriale di calcio nelle cellule in coltura

Questo video mostra la procedura per valutare la capacità di ritenzione del calcio nei mitocondri monitorando in tempo reale i cambiamenti nella fluorescenza quando i mitocondri assorbono il calcio. Questo test è utile per studiare la funzione mitocondriale e i processi correlati al calcio, tra cui l'apoptosi e le malattie neurodegenerative.

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Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca2 + importazione analisi usando il Ca2 + sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca2 + colorante Rhod-2/AM.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.

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Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

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