Name: Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Impara a valutare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale e il gonfiore indotto da Ca²⁺ in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y. Questo metodo semplice permette di studiare la disfunzione mitocondriale e il metabolismo energetico cellulare.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da parte di grant della eccezionale scienziato dello Shandong (JQ201421) e grant da NSFC (81371226).

1. isolamento dei mitocondri
Nota: Tutte le soluzioni e apparecchiature dovrebbe essere preraffreddate a 0 - 4 ° C e tenute su ghiaccio.
<ol><li>Seme circa 3 x 106 SH-SY5Y cellule per piastra di coltura delle cellule di 10 cm. Cellule di cultura in alto-glucosio Dulbecco s modified medium di Eagle con 10% siero bovino fetale, penicillina (100 U/mL)-streptomicina (100 µ g/mL). Mantenere a 37 ° C in un incubatore contenente 5% CO2 durante la notte. Nota: almeno 1-2 x 107 SH-SY5Y cellule sono necessari per ciascun test di isolamento.</li>
	<li>Rimuovere il supporto e lavare le cellule con circa 1 mL di PBS freddo di ghiaccio in una piastra di coltura cellulare di 10cm 3 volte.</li>
	<li>Aggiungere nuovo 1 mL di PBS freddo ghiaccio nella piastra di coltura cellulare di 10cm e raschiare le celle aderenti in una nuova provetta da 1,5 mL. Centrifuga a 800 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Durante la centrifugazione, preparare il tampone di isolamento mitocondriale di 5 mL (250 mM saccarosio, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina ethanesulfonic acido), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) completato con 50 µ l di brodo di inibitori di proteasi soluzione (una concentrazione di 100 x; 1 compressa EDTA-libero dissolto in 500 µ l di ddH2O).</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 1 mL di tampone di isolamento mitocondriale. Incubare la provetta da 1,5 mL in ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Lisare le cellule sospese con un omogeneizzatore di vetro (15-25 colpi) su e giù manualmente sul ghiaccio. Nota: Assicurarsi che non ci sono bolle quando le cellule sono omogeneizzate. Contare le cellule intatte e nuclei scoperti da microscopio visivamente e confermare che > rottura cellulare 90% si è verificato.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per rimuovere i detriti (nuclei e restanti cellule intatte).</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 14.000 x g per 15 min 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet contenente i mitocondri con 1 mL di tampone di isolamento mitocondriale.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione per 15 min a 4 ° C di 14.000 x g per precipitare i mitocondri.</li>
	<li>Il pellet di mitocondri risultante deve essere tenuto sul ghiaccio e risospesi in 50-100 media KCl μL (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1mm MgCl2, 20mm HEPES, 5mm glutammato, malate di 5 mM e 2 rotenone μM, pH 7.4) secondo il volume di pellet prima qualsiasi culo Ay.</li>
	<li>Utilizzare 5 μL di soluzione di mitocondriale per misurare la concentrazione di proteina mitocondriale di test standard di BCA, OD562 di misura utilizzando un lettore di piastra13.</li>
</ol>2. la determinazione della capacità di ritenzione di mitocondriale di Ca2 +
<ol><li>Preparare il supporto di KCl e aggiungere il Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde a una concentrazione finale di 0,5 μM prima dell'esperimento.</li>
	<li>Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in media di KCl che contengono 0,5 μM Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde in ogni piastra a 6 pozzetti bene.</li>
	<li>Incubare i mitocondri e il Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde nel piatto 6 pozzetti a temperatura ambiente al riparo dalla luce ambiente per 1 min. aggiungere 4 aliquote del μL di un soluzione di CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 da 20 mM 20 mM HEPES, 5mm glutammato, malate di 5 mM, pH 7.4) per ogni piastra a 6 pozzetti pozzetto usando l'automatico dispensa impostazione di introdurre 200 nmol proteina mitocondriale di Ca2 +/mg.</li>
	<li>Utilizzare uno spettrometro di fluorescenza per monitorare i cambiamenti di fluorescenza ogni 3 s per 2 min con una lunghezza d'onda di eccitazione di 506 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 531 nm. La piastra è dotata di agitazione a 600 rpm per 3 s tra letture controllato dal software (Figura 1).</li>
	<li>Aggiungere un'aliquota di ulteriori 4 μL di soluzione di 20 mM CaCl2 in ciascun pozzetto e monitorare i cambiamenti di fluorescenza ogni 3 s per 2 min. Ripetere questo passaggio finché la fluorescenza aumenta con il tempo. Nota: I mitocondri sono sfidati con l'aggiunto Ca2 + indicato dalla registrazione maggiore fluorescenza. Quando si apre il mPTP, la fluorescenza aumenta con il tempo.</li>
	<li>Interpretare la quantità totale di Ca2 + aggiunte fino a quando il mPTP apre come la capacità di ritenzione di Ca2 + .</li>
</ol>3. determinazione del Ca 2 +-indotto gonfiamento mitocondriale
<ol><li>Preparare il supporto di KCl prima dell'esperimento.<ol>
<li>Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in media di KCl in ogni piastra a 6 pozzetti bene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di 20 mM CaCl2 soluzione acquosa (500 nmol/mg di proteina mitocondriale) nella proteina mitocondriale di innescare gonfiamento mitocondriale.</li>
	<li>Registrare la diminuzione di assorbanza a 540 nm ogni 3 s su un lettore di micropiastre controllato dal software per 10 min (Figura 2). Le modifiche di fluorescenza sono causate da un afflusso di soluti attraverso la membrana mitocondriale interna. Nota: La diminuzione assorbanza a 540 nm corrisponde ai mitocondri gonfiati. Se il lettore non ha rispettato una diminuzione di assorbanza, un più lungo intervallo di lettura o di tempo di lettura può essere adottato.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
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<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
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<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. sole sotto la supervisione degli esperimenti. Wei Li eseguito gli esperimenti. Chen Zhang e X. Sun ha scritto il libro.

Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice ed efficace per il mitocondriale Ca2 + ritenzione capacità dosaggio e Ca2 +-attivato dosaggio gonfiamento mitocondriale.
Per l'isolamento mitocondriale, assicurarsi che tutti i materiali e i tubi sono sul ghiaccio, soprattutto quando le cellule di omogeneizzazione. 0,25% tripsina-EDTA può essere utilizzato anche per staccare le cellule dal piatto per 5 min a 37 ° C. Dopo 15-25 colpi, è necessario osservare la membrana delle ce...

I mitocondri sono i principali organi cellulari per produrre quasi il 95% del trifosfato di adenosina usato nelle cellule dei mammiferi di fosforilazione ossidativa. È stato riferito che la concentrazione micromolar sequestrata di Ca2 + dai mitocondri, la presenza di ADP e fosfato inorganico può essere utilizzato per fosforilare ADP a sintesi ATP1. Quando la concentrazione di Ca citosolico2 + supera una soglia, i mitocondri possono l'assorbimento di Ca2 + rapidamente e di efflusso e lentamente. Così, i mitocondri di funzionamento possono afflusso l'aumento citosolico Ca2 +. Irrilevante per la partecipazione nella fosforilazione ossidativa, il mitocondriale Ca2 + anche partecipare i segnali di calcio citosolico e attivare il meccanismo apoptotico mitocondriale inducendo l'apertura della mPTP nella parte interna mitocondriale membrana2. È stato ampiamente riconosciuto che l'elevazione anormale del intracellulare di Ca2 + può indurre mitocondriale gonfiamento voluminoso aprendo il mPTP3. Così, questo protocollo ha lo scopo di valutare la funzione mitocondriale di quantificare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale.
Capacità di ritenzione di CA2 + è la misura della capacità dei mitocondri di calcio citosolico di assorbimento. I mitocondri possono buffer il calcio libero citosolico e regolano i processi cellulari di calcio-dipendente dall'assorbimento di calcio sotto forma di precipitati inattivi. Capacità di ritenzione alterata Ca2 + si verifica nei fenomeni di stress associati a limitazione di energia e anche neurodegenerative malattie4,5. Mitocondri isolati o cellule della digitonina-permeabilized possono essere utilizzate per identificare la capacità di ritenzione di Ca2 + , e l'elevata capacità di accumulare Ca2 + di mitocondri isolati con il glutammato additonal e malate non avviene mediante il isolamento mitocondriale procedura6. Una quantità di Estratto titolata di digitonina deve essere utilizzata per permeabilize le membrane del plasma di diversi tipi di cellule. Il sale di hexapotassium di Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde, Ca2 +-indicatore luce-eccitabile visibile cellula-impermeant sensibile, è stato ampiamente usato7. CA2 +-associazione verde colorante fluorescente è un indicatore di bassa affinità e utilizzati per dimostrare che intracellulare Ca2 + le concentrazioni libere di continuare ad aumentare durante prolungato di stimolazioni (5 min)8. Questo metodo era meno sensibile che la tecnica di filtro radioattivo, ma è stato notevolmente semplificato. Ulteriori Ca2 + eleva fluorescenza verde di calcio e l'assorbimento di Ca2 + dai mitocondri ritorna la fluorescenza ai valori basali. Fino a quando i mitocondri non è riuscito a assorbimento extramitochondrial Ca2 + 9, sono state fatte aggiunte sequenziale di Ca2 + . Un lettore di micropiastre di fluorescenza può essere utilizzato per segnalare continuamente la fluorescenza verde di calcio.
Dopo Ca2 + accumulo, mitocondri depolarizzarono, scaricata Ca2 + nel terreno e ha cominciato a gonfiarsi. CA2 +-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. La microscopia elettronica e la diminuzione di luce assorbanza a 540 nm può essere usato per misurare il Ca2 +-innescato mitocondriale gonfiore10,11. Volume di mitocondri può essere determinata direttamente da angolo in avanti dispersione della luce12, dove diminuisce di assorbanza riflettono passiva gonfiore della matrice mitocondriale.
Qui, vi illustriamo la metodologia per esaminare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare SH-SY5Y</td><td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td><td>Numero ATCC: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Verde di calcio-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+-legante colorante fluorescente verde</td></tr><tr><td>inibitori completi della proteasi Roche</td><td>Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>omogeneizzatore di vetro</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>malato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Strumenti flash Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' ad alto contenuto di glucosio s Hyclone medio Eagle modificato</td><td></td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L di glucosio, L-glutammina, senza piruvato di sodio</td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Hyclone SV30087</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>Kit di test BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>piatto per coltura cellulare da 10 cm</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitocondriale di ca2 + ritenzione capacità assay e ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

La produzione di ATP da fosforilazione ossidativa è la funzione primaria dei mitocondri. I mitocondri negli eucarioti superiori partecipano anche Ca citosolico2 + buffer, e la produzione di ATP in mitocondriale può essere mediata da intramitochondrial Ca2 + concentrazione libera. Capacità di ritenzione di CA2 + può essere considerata come la capacità dei mitocondri di trattenere calcio nella matrice mitocondriale. Accumulato intracellulare Ca2 + conduce alla permeabilità della membrana mitocondriale interna, definito l'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), che conduce alla perdita di molecole con un molecolare peso meno di 1,5 kDa. CA2 +-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. Qui, descriviamo due saggi per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati. Dopo determinate quantità di Ca2 + vengono aggiunti, tutti i passaggi possono essere completati in un giorno e registrati da un lettore di micropiastre. Così, queste due analisi semplice ed efficace possono essere adottate per valutare il Ca2 +-relative funzioni mitocondriali.

Rappresentante risultati di Ca2 + capacità di ritenzione: Risultati sono stati espressi come valori di fluorescenza. Con gli ulteriori impulsi del Ca2 + (200 proteina mitocondriale nmols/mg), la fluorescenza aumentata del doppio di sopra della linea di base con l'apertura di mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inibitore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, o 1 μM atractyloside (ATR), un attivatore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, sono stati a...

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale nel gonfiamento mitocondriale indotto dal calcio. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio della disfunzione mitocondriale, come il metabolismo energetico anomalo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto semplice ed efficace.Per iniziare, seminare circa tre milioni di cellule SH-SY5Y per ogni piastra da coltura cellulare da 10 centimetri. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con circa un millilitro di PBS freddo su ghiaccio in una piastra da coltura cellulare da 10 centimetri per tre volte. Aggiungere un millilitro di PBS freddo su ghiaccio nella piastra da coltura cellulare da 10 centimetri e raschiare le cellule aderenti in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.Centrifugare a 800 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Durante la centrifugazione, preparare cinque millilitri di buffer per l'isolamento dei mitocondri, integrato con 50 microlitri di soluzione stock di inibitore delle proteasi. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet con un millilitro di buffer per l'isolamento dei mitocondri.Incubare il tubo da 1,

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Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

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Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri...

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Questo video descrive un test basato su un lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale in mitocondri isolati. Il test analizza il segnale di fluorescenza di un colorante fluorescente sensibile al calcio per studiare la cinetica dell'assorbimento mitocondriale del calcio e del sovraccarico di calcio.

Saggio di captazione del calcio mitocondriale: un metodo basato su lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio nei mitocondri isolati

Questo video descrive un test basato sull'imaging al microscopio confocale per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale nelle cellule in coltura. Il test utilizza il colorante fluorescente sensibile al calcio Rhod-2/AM per misurare il calcio mitocondriale in cellule coltivate permeabilizzate.

Saggio dell'afflusso di calcio per misurare l'assorbimento mitocondriale di calcio nelle cellule in coltura

Questo video mostra la procedura per valutare la capacità di ritenzione del calcio nei mitocondri monitorando in tempo reale i cambiamenti nella fluorescenza quando i mitocondri assorbono il calcio. Questo test è utile per studiare la funzione mitocondriale e i processi correlati al calcio, tra cui l'apoptosi e le malattie neurodegenerative.

Determinazione della capacità di ritenzione del calcio dei mitocondri isolati

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca2 + importazione analisi usando il Ca2 + sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca2 + colorante Rhod-2/AM.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.

Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Questo protocollo descrive un test comparativo, utilizzando attività complesse mitocondriali CI+CIII e CII+CIII in presenza o assenza di Na+, per studiare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati.

La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na+ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Impara a valutare la capacità di ritenzione del calcio mitocondriale e il gonfiore indotto da Ca²⁺ in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y. Questo metodo semplice permette di studiare la disfunzione mitocondriale e il metabolismo energetico cellulare.

Mitocondriale di Ca^{2 +} ritenzione capacità Assay e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

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