Name: Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Impara a studiare le piccole GTPasi nelle cellule epiteliali polarizzate mediante microiniezione di plasmidi. Questa tecnica consente di analizzare gli effetti primari sul traffico di membrana con effetti secondari minimi.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (GM070736) a H. Fölsch. SF Ang è stato sostenuto da una borsa di studio * Un premio STAR Graduate, e RS Kang è stata sostenuta dalla basi cellulari e molecolari della malattia programma di formazione (GM8061)

1. Isolamento del DNA plasmidi <ol><li> Utilizzare un Sigma-Aldrich privo di endotossine maxiprep kit per la preparazione del DNA libero endotossina secondo il protocollo del produttore. Questo kit funziona per noi, perché rimuove in modo efficace qualsiasi endotossine da preparazioni di DNA. Endotossine che vengono iniettati con il DNA nei nuclei delle cellule porterà alla morte cellulare. </li><li> Aggiungere 100 ul fenolo / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) al DNA isolato, vortice e gira per 1 minuto a 13.000 giri al minuto in una microcentrifuga Eppendorf. Trasferire la fase superiore acqua in un nuovo tubo e aggiungere 100 ul cloroformio / isoamylalcohol (24:1), vortice e spin come sopra. Trasferire la fase superiore acqua contenente il DNA in una nuova provetta. Questo passaggio è necessario per rimuovere qualsiasi proteina dal DNA, che impedisce l'intasamento dell'ago microiniezione. </li><li> Precipitare il DNA con l'aggiunta di acetato di sodio (pH 6.0) ad una concentrazione finale di 300 mm e 2 X etanolo 100% vol. Incubare a -20 ° C durante la notte. Spin DNA per 20 minuti a 13.000 rpm in una microcentrifuga Eppendorf, lavare una volta con etanolo al 70%, e risospendere in 300 ml d'acqua privo di endotossine (Sigma-Aldrich). </li><li> Determinare la concentrazione di DNA. Una concentrazione di DNA tipico varia da 1 a 5 mcg / mL. </li></ol> 2. Coltura di cellule MDCK <ol><li> Dividere le celle MDCK. Contare le celle e semi di 4 x 10 5 cellule chiare sul 12-mm filtri Transwell (0,4 micron dimensione dei pori, Corning Costar, 3460). Per un esperimento di controllo che contiene un mock-iniezione e di due diverse proteine ​​Rab mutante è necessario seme tre filtri. </li><li> Cellule in coltura MDCK medio MEM con 2 mM L-glutammina, 0,1 mg / ml di penicillina / streptomicina e il 7% (v / v) siero fetale bovino (= supporto della crescita MEM) a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Modifica dei media nella camera di basolaterale ogni giorno. Questo aiuta il processo di polarizzazione, perché imita la situazione delle cellule epiteliali negli animali. </li><li> 2 giorni dopo la semina il check-in un microscopio se le cellule sono in crescita in un monostrato chiuso. Se non è possibile rilevare eventuali buchi nella monostrato, eseguire l'esperimento il giorno 3. Se ci sono ancora buchi, eseguire l'esperimento il giorno 4. </li></ol> 3. Microiniezione Procedura e post-iniezione incubazioni <ol><li> Il giorno dell'esperimento preparare 5 ml terreni di coltura MEM più 50 HEPES mM in una piastra 60 x 15 mm per ogni filtro e posto in un incubatore a 39 ° C. Inoltre, impostare un bene di un 12-pozzetti con 1 ml di terreno di coltura MEM più 50 HEPES mM e 0,1 mg / ml cicloesimide per filtro, e posto in un incubatore 31 ° C. </li><li> Accendere il microscopio microiniezione e impostare il suo stadio riscaldato a 39 ° C. Usiamo un microscopio invertito (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) con una fase di riscaldamento, gli obiettivi 10X e 32X e un FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Infine, aprire il serbatoio di azoto che fornisce il tavolo aria con azoto. </li><li> Diluire il DNA con acqua filtrata (l'uso del filtro 0,2 micron) ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml in un volume totale di 10 - 100 l. Successivamente, rotazione del DNA in microcentrifuga Eppendorf a 13.000 rpm per 30 min. Rimuovere parte superiore e mettere in un nuovo tubo. Questa fase assicura che quando si carica il vostro DNA diluito in microiniezione l'ago si può caricare con precisione il DNA "pulita". Il vostro DNA è ora pronto per microiniezione. </li><li> Preparate le vostre cellule estrapolando il primo filtro della sua capsula di Petri. Con una lama chirurgica (Blade Feather chirurgico, acciaio inox, n. 11), tagliare il filtro dal porta filtro e il luogo in 5 ml, 39 ° C caldo terreni di coltura MEM HEPES più 50 mm (60 x 15 mm Piastra). Appesantire il filtro nella piastra di coltura con la lama chirurgica utilizzata per tagliare fuori. Posizionarlo sul filtro tale che il foro della lama chirurgica circonda il centro del filtro. Inserisci la tua piastra di coltura sul palco riscaldato del microscopio. </li><li> 2-3 ml di carico vostro DNA diluito (in questo caso la codifica plasmidi VSVGts045-GFP controllo iniezione = finta) in un ago da microiniezione (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), ruotare il coperchio di protezione dell'ago e lasciarlo cadere a terra . Ora l'ago è pronto per essere avvitato nel relativo supporto. Per farlo, premere il tasto menu del vostro InjectMan e assicurarsi che la valvola è chiusa. Avvitare l'ago nel relativo supporto, fai attenzione a non avvitare l'ago troppo stretto come che possono portare alla rottura. Ora, premere il tasto Menu di nuovo, il applicata P c impedisce ai media di essere risucchiati l'ago durante la procedura microinjeciton. Infine, toccare il joystick per cancellare homing memorizzati. </li><li> Per abbassare l'ago sulla cellule, utilizzare l'obiettivo 10X e portare l'ago nel fascio di luce al di sopra del liquido. Ora concentrarsi sulle cellule, portare l'attenzione di nuovo girando la ruota di fuoco a 180 °, e trovare l'ago. In seguito, lentamente spostare l'ago a fuoco, quindi portare fuori fuoco ancora una volta (lavorando per portare le cellule a fuoco ancora una volta), far scendere l'ago in percus di nuovo. Ripetere fino a quando l'ago tocca la superficie del supporto, a quel punto tutto quello che vedrete è un alone. Quando si raggiunge un punto in cui le cellule sono a fuoco, ma l'ago è ancora sfocata (cioè fuori dal piano focale) modifica l'obiettivo 32X e fine impostazioni grossolana. </li><li> Impostare il z-limite toccando la membrana apicale con la punta dell'ago e sottraendo circa 10 micron, come i nuclei che sono circa 10 micron al di sotto della membrana apicale. </li><li> Dopo aver impostato la z-limite, la giusta pressione di iniezione. Inizio a 95 PSI. Se la pressione è troppo alta, le cellule farà saltare in aria. Se la pressione è troppo bassa, si vedrà un puntino bianco che rimane, ma non succede nient'altro. Con una iniezione di successo, si vedrà un cambiamento di fase, senza un cambiamento di dimensione delle celle. Per l'iniezione, portare l'ago di un paio di micron fuori del piano focale il più velocemente possibile. Puntare con l'ago al di sopra del nucleo (ovvero la metà di una singola cella) e premere il pulsante di iniezione del joystick, ma non tenere premuto il pulsante. </li><li> Iniettare 100-500 cellule all'interno del foro della vostra lama chirurgica che giace sulle vostre cellule. Quando hai finito, inserire il vostro cellule con il piatto la cultura e la lama chirurgica in un incubatore 39 ° C, e incubare per 2 ore Durante questo periodo, VSVGts045-GFP è espressa e secreta nel ER. Tuttavia, a 39 ° C, VSVGts045-GFP non può piegare correttamente e quindi non può lasciare il Pronto Soccorso. Nel frattempo, la piccola GTPasi di interesse si accumula nel citosol in co-iniezione esperimenti. </li><li> Dopo 2 h, posto le cellule in 1 ml di terreno di coltura MEM più 50 HEPES mM e 0,1 mg / ml cicloeximide in un 12-pozzetti ed incubare per 2 ore a 31 ° C. Durante questo periodo di caccia, VSVGts045-GFP si piega correttamente, lasciare il pronto soccorso e viene consegnato alla superficie cellulare. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,10 per filtri due (iniettare plasmidi codifica VSVGts045-GFP e, per esempio V5-tagged Rab13T22N) e tre (iniettare plasmidi codifica VSVGts045-GFP e, per esempio V5-tagged Rab13Q67L). Ogni iniezione di circa 20 - 60 min. Tuttavia, è assolutamente cruciale per il trattamento di ogni filtro stesso modo in tutta incubazioni spostare la temperatura e la colorazione della superficie fino a fissare le cellule. Dopo la fissazione, è possibile eseguire il resto della tua protocollo di colorazione per tutti i filtri al tempo stesso. </li></ol> 4. La colorazione della superficie per l'analisi di immunofluorescenza Nota, in modo da evitare lo sbiancamento del segnale della GFP VSVGts045-GFP, proteggere i campioni dalla luce coprendo con un foglio di alluminio durante tutte le procedure successive. <ol><li> Se si desidera procedere alla colorazione della superficie, luogo vostre cellule in una capsula di cultura su una lastra di metallo su ghiaccio e lavarsi le cellule 1X PBS freddo con ghiaccio 2 + (PBS [0,2 g / litro di KCl, 0,2 g / litro KH 2 PO 4, 8 g / litro di NaCl e 2,17 g / litro Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] oltre 0,1 g / litro CaCl 2 e 0,1 g / litro MgCl 2 x 6 H 2 O). Successivamente, versare 30 ml di un anticorpo che riconosce la ectodomain della vostra proteina, in questo caso il mouse TK1 anticorpo monoclonale (IgG 1, ottenuto dalla fine Thomas Kreis), su parafilm pulito posizionato sulla piastra di metallo sul ghiaccio. Posizionare il filtro con le vostre cellule a testa in giù sul menu e aggiungere alcune gocce di anticorpi sul retro del filtro. Incubare per 1 h sul ghiaccio. </li><li> Cellule posto in un 12-pozzetti, lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio 2 + (o RT caldo PBS 2 + senza colorazione superficie prima), e fissare con il 3% paraformaldeide per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule una volta con PBS 2 + e lasciare in PBS 2 + per 5 min. </li><li> Incubare cellule nel bloccare / buffer permeabilizzazione (BPB) (2% [peso / volume] BSA, 0,4% [peso / volume] saponina in PBS 2 +) con il 10% [vol / vol] siero di capra. Incubare 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Diluire gli anticorpi primari per rilevare l'espresso Rab GTPasi, in questo esempio anti-V5 (topo monoclonale IgG 2a, Invitrogen), 1:200 in BPB. Spin anticorpi diluita in una microcentrifuga Eppendorf per 10 minuti a 13.000 giri al minuto. Versare 30 ml di soluzione di anticorpi su parafilm pulita posto in una camera umida. Posizionare le celle filtro a testa in giù sul calo degli anticorpi e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Cellule posto posteriore (fino a destra) in un 12-pozzetti e lavare 5 volte oltre 30 minuti con BPB a temperatura ambiente. </li><li> Diluire appropriati anticorpi secondari, in questo caso di capra anti-topo IgG 1 Alexa 594-etichetta (per VSVG rilevamento in superficie, Invitrogen) e Cy5-etichettati anticorpi secondari di riconoscere il vostro GTPasi Rab, in questo esempio di capra anti-topo IgG 2a Cy5 marcato (ImmunoResearch Jackson), 1:200 in BPB e spin come sopra. Si introducono 30 microlitri soluzione di anticorpi su parafilm pulita in una camera umida e cellule luogo il filtro a testa in giù sul calo degli anticorpi. Incubare 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere il punto 4.6. </li><li> Dip cellule su filtro 3X in acqua deionizzata e luogo rverso l'alto ight su microslides. Aggiungere 10-15 microlitri di montaggio (10% [peso / volume] DABCO, 50% [peso / volume] glicerolo in acqua distillata) sulla parte superiore delle celle. Luogo 18x18 millimetri di vetro di copertura micro sulla parte superiore e utilizzando tessuti facciali premere delicatamente il coperchio sul bicchiere micro cellule. Sigillare con smalto. </li><li> Analizzare i campioni con un microscopio confocale. Abbiamo usato un Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc. che era dotata di un obiettivo 63x immersione in acqua. </li><li> Per la preparazione di figure, regolare e combinare immagini utilizzando programmi come Adobe Photoshop e Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Per esempi su come la co-espressione di piccole GTPasi interferisce con VSVG ordinamento gentilmente si riferiscono ad articoli pubblicati sia per missorting apicale 3, 4 o inibizione di consegna superficie 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Nel finto-iniezione, cioè una iniezione di solo il plasmide codifica VSVGts045-GFP, la proteina viene consegnato alla superficie basolaterale delle cellule MDCK ben polarizzato come giudicato dalla colorazione della superficie (in rosso, figura 1 A). Si noti che non tutti i VSVGts045-GFP viene consegnato alla membrana basolaterale durante la caccia a 31 ° C, come evidenziato dal segnale intracellulare ampio per la proteina totale (in verde, figure 1 A e B). Nelle cellule che non sono ben polarizzato VSVGts045-GFP sarà consegnato anche alla membrana apicale (Figura 1 B). Se il vostro campioni di controllo simile alla cellula nella Figura 1 B, non ti puoi fidare dei dati e necessario ripetere l'esperimento con più polarizzato cellule. Barre di scala sono 5 micron.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
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<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le fasi più critiche per un esperimento di microiniezione di successo sono la qualità e la purezza del DNA e la polarità delle cellule. Senza cellule polarizzate, il controllo iniezione sarà già mistargeted VSVG e l&#39;esperimento non può essere utilizzato. Se il DNA è di scarsa qualità, il DNA può intasare l&#39;ago dell&#39;iniezione porta a scarsa o assente espressione della proteina desiderata a tutti. Inoltre, è consigliabile utilizzare i plasmidi di espressione che sono conosciuti per portare a livelli di alta es...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscopio con stadio riscaldato </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Ordine personalizzato </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet micromanipolatore </td><td> Eppendorf </td><td> Ordine personalizzato </td></tr><tr><td> Femtotips II (aghi Microiniezione) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader suggerimenti </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Chiara da 12 mm transwell filtro supporta </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotossina-free kit maxiprep plasmide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analizzando la funzione di gtpasi small microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Le cellule epiteliali polarizzare la loro membrana plasmatica in domini apicale e basolaterale biochimicamente e funzionalmente distinti in cui il dominio apicale si affaccia sul &#39;libero&#39; delle superfici e la membrana basolaterale è in contatto con il substrato e le cellule vicine. Entrambi i domini di membrana sono separati da giunzioni strette, che formano una barriera alla diffusione. Apicale-basolaterale polarizzazione può essere riassunta con successo in coltura quando le cellule epiteliali, come Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sono teste di serie ad alta densità su filtri in policarbonato e coltivate per diversi giorni 1 2. Creazione e mantenimento di polarità delle cellule è regolata da una serie di piccole GTPasi della superfamiglia Ras come Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 e Rab13 3 4 5 6 7. Come tutte le GTPasi queste proteine ​​ciclo tra un inattivo PIL legato Stato e un attivo GTP-bound stato. Specifiche mutazioni nelle regioni nucleotide binding interferire con questo ciclismo 8. Per esempio, Rab13T22N è permanentemente bloccato nella forma del PIL e quindi soprannominato &#39;dominante negativo&#39;, mentre Rab13Q67L non può più idrolizzare GTP e quindi è bloccata in uno stato &#39;dominante attivo&#39; 7. Per analizzare la loro funzione nelle cellule entrambi gli alleli dominanti negativi e dominante attiva della GTPasi sono tipicamente espressa ad alti livelli di interferire con la funzione delle proteine ​​endogene 9. Un modo elegante per raggiungere elevati livelli di overespressione in un breve lasso di tempo è quello di introdurre i plasmidi codifica le proteine ​​pertinenti direttamente nei nuclei delle cellule coltivate su filtro polarizzato supporta l&#39;utilizzo di tecnica microiniezione. Questo è spesso combinata con la co-iniezione di plasmidi reporter che codificano recettori di membrana plasmatica che sono specificamente ordinati al dominio apicale o basolaterale. Un carico di frequente utilizzato per analizzare carico ordinamento al dominio basolaterale è un allele sensibile alla temperatura del virus della stomatite vescicolare glicoproteina (VSVGts045) 10. Questa proteina non può piegare correttamente a 39 ° C e sarà quindi mantenuto nel reticolo endoplasmatico (ER), mentre la proteina regolatrice di interesse è assemblata nel citosol. Uno spostamento a 31 ° C, quindi consentire VSVGts045 piegare correttamente, lasciare il Pronto Soccorso e viaggiare alla membrana plasmatica 11. Questa caccia viene di solito effettuata in presenza di cicloesimide per evitare ulteriori sintesi proteica che porta a ottenere risultati più nitidi. Qui si descrivono in dettaglio la procedura di microinjecting plasmidi in cellule polarizzate e successive incubazioni compresi turni di temperatura che permettono una analisi completa delle proteine ​​regolatrici coinvolte nella selezione basolaterale.

Questo articolo precisa le procedure necessarie per l&#39;iperespressione e l&#39;analisi delle piccole GTPasi in cellule epiteliali polarizzate usando la tecnica microiniezione.

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Le cellule epiteliali polarizzano la loro membrana plasmatica in domini apicale e basolaterale, biochimicamente e funzionalmente distinti, in cui il dominio apicale è rivolto verso...

Questa procedura analizza gli effetti delle piccole GTPasi ACE sul traffico membranare polarizzato. Innanzitutto, iniettare contemporaneamente plasmidi di DNA che codificano per la piccola GTPasi ACE e per le proteine reporter nei nuclei cellulari di cellule polarizzate. Successivamente, esprimere il DNA a temperature che arrestino le proteine reporter nel reticolo endoplasmatico o nell'apparato di Golgi trans (TGN), mentre la piccola GTPasi si accumula nel citosol, quindi procedere con il chase della proteina reporter verso la superficie cellulare in presenza di cicloeside per prevenire ulteriore sintesi proteica.Infine, etichettare la proteina reporter sulla superficie cellulare per l'analisi di immunofluorescenza. I risultati ottenuti con questo saggio permettono la visualizzazione del cambiamento nella localizzazione superficiale mediante microscopia confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la trasfezione è che, durante i brevi periodi di sovraespressione ottenuti con microiniezione, gli effetti secondari sono minimi, consentendoci di studiare gli effetti primari delle proteine di interesse.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della polarità cellulare, ad esempio in che modo le piccole gtpasi regolano il traffico di membrane polarizzato. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i singoli passaggi necessari per un microiniezione riuscita sono difficili da spiegare senza l'ausilio di supporti visivi. Isolare il DNA plasmidico privo di endotossine utilizzando il kit Sigma Aldrich per preparazioni massive prive di endotossine, seguendo il protocollo del produttore. Per questo esperimento, utilizzare tre filtri transwell trasparenti da 12 millimetri con pori di 0,4 micrometri per la coltura.Le cellule vengono seminate quattro volte dieci alla quinta cellule MDCK su ciascun filtro. Dopo due giorni, esaminare la coltura al microscopio per verificare che le cellule stiano crescendo in un monolayer chiuso. Per la microiniezione.Il giorno della microiniezione, preparare piastre da 360 per 15 millimetri contenenti cinque litri di terreno di crescita MM più 15 millimoli di heis e posizionarle in un incubatore a 39 gradi Celsius. Inoltre, preparare tre piastre a 12 pozzetti contenenti un millilitro di terreno di crescita MEM più 50 millimoli di heis e 0,1 milligrammi per millilitro di cicloesimide e posizionarle in un incubatore a 31 gradi Celsius. Accendere il microscopio per microiniezione, configurato con questo microscopio invertito dotato di piatto riscaldato, obiettivi 10x e 32x e un einor femto jet.Impostare il palco riscaldato a 39 gradi Celsius. Aprire anche la fornitura di azoto gassoso al tavolo antivibrazioni. Diluire ora il DNA con acqua filtrata fino a una concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro.Successivamente, centrifugare il DNA in una microcentrifuga einor a 13.000 giri al minuto per 30 minuti. Rimuovere la porzione superiore e trasferirla in un nuovo tubo. Successivamente, preparare le cellule MDCK estraendo il primo filtro dalla sua piastra di coltura con una lama chirurgica, tagliando il filtro dal suo supporto e posizionandolo nella piastra preparata da 60 per 15 millimetri contenente cinque millilitri di terreno di crescita MEM riscaldato a 39 gradi Celsius, integrato con hepes 50 millimolare.Per tenere premuto il filtro nella piastra di coltura, posizionare la lama chirurgica al centro del filtro e quindi trasferire la piastra di coltura sullo stadio riscaldato del microscopio. Caricare da due a tre microlitri del DNA diluito in un ago da microiniezione. Ruotare il coperchio protettivo dell'ago e lasciarlo cadere a terra.Per posizionare l'ago nel supporto, premere il tasto menu dell'inject e assicurarsi che la valvola sia chiusa. Avvitare l'ago nel suo supporto. Attenzione a non avvitare l'ago troppo stretto.Poiché ciò potrebbe causare rotture, premere nuovamente il tasto del menu. In questo modo, la pressione di compensazione applicata impedirà al mezzo di essere aspirato all'interno dell'ago durante la procedura di microiniezione. Infine, premere il joystick per cancellare il posizionamento memorizzato e abbassare l'ago sulle cellule.Utilizzare l'obiettivo 10x e portare l'ago nel fascio di luce sopra il liquido. Ora mettere a fuoco le cellule. Nuovamente mettere a fuoco verso l'alto ruotando la manopola di messa a fuoco di 180 gradi verso l'alto e individuare l'ago.Spostare lentamente l'ago a fuoco. Quindi portarlo nuovamente fuori fuoco. Procedere verso il messa a fuoco delle cellule ancora una volta.Riportare l'ago a fuoco. Ripetere fino a quando l'ago tocca la superficie del mezzo, momento in cui si osserva un alone. Continuare fino a raggiungere il punto in cui le cellule sono a fuoco, ma l'ago è ancora sfocato fuori dal piano focale.Ora passare all'obiettivo 32x e trovare le impostazioni grossolane. Impostare il limite Z toccando la membrana apicale con la punta dell'ago e sottraendo circa 10 micrometri, poiché i nuclei si trovano approssimativamente a 10 micrometri sotto la membrana apicale.Ora portare l'ago di alcuni micron fuori dal piano focale il più rapidamente possibile. Mirare con l'ago sopra il nucleo e premere e rilasciare il pulsante di iniezione del joystick. Iniziare a 95 PSI per trovare la pressione di iniezione corretta.Se la pressione è troppo elevata, le cellule esplodono. Se la pressione è troppo bassa, persiste un punto bianco, ma non accade altro. Eseguire un'iniezione riuscita che comporti un cambiamento di fase senza variazione della dimensione cellulare.Iniettare da 100 a 500 cellule all'interno del foro della lama chirurgica che si trova sulle cellule. Successivamente, posizionare le cellule con la piastra di coltura e la lama chirurgica in un incubatore a 39 gradi Celsius e incubare per due ore. Infine, trasferire le cellule nella piastra a 12 pozzetti preparata con un millilitro di MEM più 50 millimolari di 0,1 milligrammi per millilitro di ciclo eide e incubare per due ore a 31 gradi Celsius.Per evitare lo sbiancamento del segnale GFP espresso, proteggere i campioni dalla luce coprendoli con della carta d'alluminio durante tutte le successive procedure di marcatura superficiale. Posizionare le cellule in una piastra di coltura su una piastra metallica posta sul ghiaccio e lavare. Una volta con PBS freddo più più, posizionare un pezzo pulito di paraform sulla piastra metallica sul ghiaccio e aggiungere gocce da 30 microlitri di un anticorpo che riconosce il dominio ecto della proteina di interesse.Ora posizionare il filtro contenente le cellule al contrario sulla goccia e aggiungere alcune gocce di anticorpo sul retro del filtro. Incubare per un'ora sul ghiaccio. Lavare le cellule tre volte con PBS freddo di ghiaccio più più e fissare con paraformaldeide al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente.Procedere con il lavaggio delle cellule una volta con PBS più più ed equilibrare in PBS più più per cinque minuti. Incubare ora le cellule nel buffer bloccante permeabilizzante. Incubare per un'ora a temperatura ambiente, diluire gli anticorpi primari uno a 200 nel BPB per rilevare la RAB GTPasi espressa, centrifugare per 10 minuti a 13.000 g, pipettare 30 microlitri della soluzione anticorpale su un vetrino pulito posizionato in una camera umida.Posizionare le cellule sul filtro a testa in giù sulle gocce di anticorpo e incubare per un'ora. A temperatura ambiente, rimettere le cellule a testa in su in una piastra da 12 pozzetti e lavare cinque volte nell'arco di 30 minuti con BPB a temperatura ambiente dopo l'incubazione con gli opportuni anticorpi secondari, includendo un passaggio di lavaggio.Immergere le cellule sul filtro tre volte in acqua deionizzata e posizionarle sul lato dritto su vetrini microscopici con 10 microlitri di mezzo di montaggio. Posizionare in alto un vetrino coprioggetto di 18 per 18 millimetri e, utilizzando fazzoletti di carta, premere delicatamente il coprioggetto sulle cellule. Infine, sigillare con smalto per unghie nell'iniezione fittizia contenente solo il plasmide che codifica per V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La proteina viene consegnata alla superficie basolaterale di cellule MDCK ben polarizzate, come indicato dalla colorazione superficiale rossa nelle cellule che non sono ben polarizzate.Una parte della proteina di fusione GFP verrà consegnata alla membrana apicale. Se i campioni di controllo appaiono in questo modo, i dati non sono affidabili e l'esperimento dovrebbe essere ripetuto con cellule meglio polarizzate. Si noti che non tutta la proteina di fusione espressa viene consegnata alla membrana basolaterale durante l'incubazione a 31 gradi Celsius, come dimostrato dal marcato segnale verde intracellulare per la proteina totale. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede circa 10-12 ore dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico di membrane per esplorare le proteine regolatrici nelle cellule epiteliali polarizzate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esprimere proteine in cellule epiteliali polarizzate utilizzando la tecnica di microiniezione.

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Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Qui, descriviamo dettagliati vivere metodi di imaging per lo studio delle cellule chemiotassi. Vi presentiamo fluorescenza metodi microscopici di monitorare le dinamiche spazio-temporali di segnalazione eventi nella migrazione delle cellule. Misurazione di eventi di segnalazione ci permette di capire meglio come un GPCR di segnalazione rete raggiunge gradiente di rilevamento di fattori chemiotattici e controlli migratori direzionale delle cellule eucariotiche.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Un metodo per spazio-temporale controllo delle attività di piccola GTPasi dalla luce viene descritta. Questo metodo si basa sulla rapamicina indotta FKBP-FRB eterodimerizzazione e foto-gabbie sistemi. Ottimizzazione di irradiazione di luce permette l'attivazione spazio-temporalmente controllato delle piccole GTPasi a livello subcellulare.

Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in...

Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Questa presentazione dimostra un metodo in cui l'elettroporazione di cellule aderenti e coltivate viene utilizzata per lo studio della comunicazione intercellulare e giunzionale, mentre le cellule crescono su un vetrino rivestito con ossido di indio-stagno conduttivo e trasparente.

Un test funzionale per Gap giunzionale esame; Elettroporazione di cellule aderenti su indio-Tin Oxide

Questo protocollo confronta le affinità relative dei partner di legame per le GTPasi della famiglia Rho, incluso Rac1. In vivo, le proteine leganti Rac1 competono per una singola interfaccia di legame, la cui conformazione è dettata da un nucleotide legato. Il nucleotide è importante e difficile da controllare sperimentalmente, a causa dell'alto tasso di idrolisi.

Confrontando l&#39;affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

Descriviamo un metodo per esperimenti di salvataggio della deplezione che preserva l'integrità cellulare e l'omeostasi delle proteine. L'adenofemazione consente analisi funzionali delle proteine all'interno di processi biologici che si basano su dinamiche basate sull'actina finemente sintonizzate, come la divisione cellulare mitotica e la miogenesi, a livello di singola cellula.

Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue

Il legame di guanosina trifosfato (GTP) è uno degli eventi più iniziali nell'attivazione del GCR-Receptor (GPCR). Questo protocollo descrive come caratterizzare farmacologicamente interazioni specifiche GPCR-ligand monitorando il legame dell'analogo GTP radio-etichettato, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) Risposta a un ligando di interesse.

Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

Descriviamo come tecniche di micro - e photomanipulation come FRAP e fotoattivazione permettono la determinazione dei parametri di motilità e la dinamica spazio-temporale delle proteine all'interno di migrazione delle cellule. Letture sperimentali includono subcellulare dinamiche e fatturato dei regolatori della motilità o del citoscheletro di actina sottostante.

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

Qui descriviamo un protocollo per studiare la prenilazione e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-caricamento di Rho GTPasi. Questo protocollo è costituito da due metodi dettagliati, vale a dire del kit membrana frazionamento e un GTPase-collegata dell'immunosorbente. Il protocollo può essere utilizzato per misurare la prenilazione e GTP caricamento di diverse altre piccole GTPasi.

Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

Qui, presentiamo un protocollo di elettroporazione riproducibile in vitro per la manipolazione genetica dei precursori delle cellule del granulo cerebellare primario (GCP) che è economico, efficiente e praticabile. Inoltre, questo protocollo dimostra anche un metodo semplice per lo studio molecolare delle vie di segnalazione primarie del riccio cilio-dipendenti nelle cellule GCP primarie.

Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo

Impara a studiare le piccole GTPasi nelle cellule epiteliali polarizzate mediante microiniezione di plasmidi. Questa tecnica consente di analizzare gli effetti primari sul traffico di membrana con effetti secondari minimi.

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

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