Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Questa procedura analizza gli effetti di piccoli ACE GTP sul traffico di membrana polarizzata. In primo luogo, co-iniettare plasmidi di DNA che codificano per il piccolo ACE GTP e le proteine reporter nei nuclei cellulari delle cellule polarizzate. Quindi esprimere il DNA a temperature che arresteranno le proteine reporter nel reticolo endoplasmatico o nel TGN mentre il piccolo GTPA si accumula nel citosol e procedere a inseguire la proteina reporter sulla superficie cellulare in presenza di cicloheide per prevenire ulteriori sintesi proteiche.

Infine, etichettare la proteina reporter sulla superficie cellulare per l'analisi in immunofluorescenza. I risultati ottenuti da questo test consentono di visualizzare il cambiamento nella localizzazione superficiale attraverso la microscopia confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il trans transfect è che durante i brevi tempi di sovraespressione ottenuti con la micro iniezione, gli effetti secondari sono minimi, permettendoci di studiare gli effetti primari delle proteine di interesse.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della polarità cellulare, come ad esempio quanto piccolo gtpa regoli il traffico della membrana polarizzata. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i singoli passaggi necessari per una microiniezione di successo sono difficili da spiegare senza un aiuto visivo Isolare il DNA plasmatico libero da endotossine con il maxi kit di preparazione Sigma Aldrich privo di endotossine secondo il protocollo del produttore. Per questo esperimento, utilizzare tre filtri trasparenti da 12 millimetri con pori di 0,4 micrometri per la coltura.

Le celle posizionano quattro volte 10 delle quinte celle MDCK su ciascun filtro. Dopo due giorni, esaminare la coltura al microscopio per verificare che le cellule stiano crescendo in un monostrato chiuso. Per microiniezione.

Il giorno della microiniezione, preparare piastre da 360 x 15 millimetri di terreno di coltura MM da cinque litri più 15 mm di heis e metterle in un incubatore a 39 gradi Celsius. Inoltre, preparare tre piastre da 12 pozzetti con un millilitro di terreno di crescita MEM più 50 millimolari di heis e 0,1 milligrammi per millilitro di cicloesimide e metterle in un incubatore a 31 gradi Celsius. Accendi il microscopio per microiniezione, impostato come questo microscopio invertito con obiettivi riscaldati da 10 x e 32 x e un getto femto einor.

Imposta il palco riscaldato a 39 gradi Celsius. Aprire anche l'alimentazione del serbatoio dell'azoto alla falda aria. Ora diluire il DNA con acqua filtrata fino a una concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro.

Successivamente centrifugare il DNA in una microcentrifuga einor a 13.000 giri/min per 30 minuti. Rimuovere la parte superiore e inserirla in un nuovo tubo. Quindi, preparare le cellule MDCK estraendo il primo filtro dalla sua piastra di coltura con la lama chirurgica, ritagliare il filtro dal portafiltro e posizionarlo nella piastra preparata da 60 x 15 millimetri contenente cinque millilitri di terreno di crescita MEM riscaldato a 39 gradi Celsius più 50 millimolari di heis.

Per appesantire il filtro nella piastra di coltura, posizionare la lama chirurgica al centro del filtro e quindi trasferire la piastra di coltura sul tavolino riscaldato del microscopio. Caricare da due a tre microlitri di DNA diluito in un ago per microiniezione. Ruotare il coperchio protettivo dell'ago e lasciarlo cadere a terra.

Per posizionare l'ago nel supporto, premere il tasto menu dell'iniezione e assicurarsi che la valvola sia chiusa. Avvitare l'ago nel suo supporto. Fare attenzione a non avvitare l'ago troppo strettamente.

Poiché ciò potrebbe causare rotture, premere nuovamente il tasto menu. Pertanto, la pressione di compensazione applicata impedirà che il fluido venga aspirato nell'ago durante la procedura di microiniezione. Infine, tocca il joystick per cancellare l'homing memorizzato per abbassare l'ago sulle celle.

Utilizzare l'obiettivo 10 x e portare l'ago nel raggio di luce sopra il liquido. Ora concentrati sulle cellule. Mettere a fuoco di nuovo verso l'alto ruotando la rotella di messa a fuoco di 180 gradi verso l'alto e trovare l'ago.

Sposta lentamente l'ago a fuoco. Quindi sfocalo di nuovo. Lavorando per mettere di nuovo a fuoco le cellule.

Metti di nuovo a fuoco l'ago. Ripetere fino a quando l'ago tocca la superficie del supporto, a quel punto si osserva un alone. Continuare a raggiungere il punto in cui le cellule sono a fuoco, ma l'ago è ancora sfocato fuori dal piano focale.

Ora passa all'obiettivo 32 x e trova le impostazioni del percorso. Impostare il limite Z toccando la membrana apicale con la punta dell'ago e sottraendo circa 10 micrometri. Poiché i nuclei si trovano a circa 10 micrometri sotto la membrana apicale.

Ora porta l'ago di un paio di micron fuori dal piano focale il più velocemente possibile. Puntare con l'ago sopra il nucleo e premere e rilasciare il pulsante di iniezione del joystick. Inizia a 95 PSI per trovare la giusta pressione di iniezione.

Se la pressione è troppo alta, le celle esplodono. Se la pressione è troppo bassa, persiste un punto bianco, ma non succede nient'altro. Eseguire con successo un'iniezione che comporta un cambiamento di fase senza un cambiamento delle dimensioni delle cellule.

Iniettare da 100 a 500 cellule all'interno del foro della lama chirurgica che si trova sulle cellule. Quindi posizionare le cellule con la piastra di coltura e la lama chirurgica in un'incubatrice a 39 gradi Celsius e incubare per due ore. Infine, trasferire le cellule nella piastra preparata a 12 pozzetti da un millilitro, MEM più 50 millimolari 0,1 milligrammi per millilitro, cicloheide e incubare per due ore a 31 gradi Celsius.

Al fine di evitare lo sbiancamento del segnale GFP espresso, proteggere i campioni dalla luce coprendoli con un foglio di alluminio durante tutte le successive procedure di colorazione superficiale. Posizionare le cellule in un piatto di coltura su una piastra di metallo con ghiaccio e lavarle. Una volta con il ghiaccio PBS plus plus, posizionare un pezzo pulito di paraforma sulla piastra metallica su ghiaccio pipettare gocce da 30 microlitri di un anticorpo che riconosce il dominio ecto della proteina di interesse.

Ora posiziona il filtro contenente le cellule capovolte sulla goccia e aggiungi alcune gocce di anticorpo sul retro del filtro. Incubare per un'ora con ghiaccio. Lavare le celle tre volte con PBS plus plus ghiacciato e fissare con aldeide paraforme al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente.

Procedere al lavaggio delle celle una volta con PBS plus plus ed equilibrare in PBS plus plus per cinque minuti. Ora incubare le cellule in un tampone permeabile bloccante. Incubare un'ora a temperatura ambiente, diluire gli anticorpi primari da uno a 200 in BPB per rilevare la centrifuga RAB GTP ACE espressa per 10 minuti A 13.000 giri/min di pipetta, 30 microlitri di soluzione anticorpale su un param pulito posto in una camera umida.

Posizionare le cellule del filtro capovolte sulle gocce di anticorpi e incubare per un'ora. A temperatura ambiente, riposizionare le celle con il lato destro rivolto verso l'alto in un 12. Immergere la piastra e lavare cinque volte nell'arco di 30 minuti con BPB a temperatura ambiente dopo l'incubazione con anticorpi secondari appropriati, inclusa una fase di lavaggio.

Immergere le celle del filtro tre volte in acqua deionizzata e posizionarle con il lato destro rivolto verso l'alto su micro vetrini a 10 microlitri di supporto Posizionare sopra un micro vetro coperto da 18 x 18 millimetri e utilizzando fazzoletti facciali premere delicatamente il vetrino coprioggetti sulle celle. Infine sigillare con smalto per unghie nella finta iniezione del solo plasmide codificante V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La proteina viene consegnata alla superficie basolaterale di cellule MDCK ben polarizzate, a giudicare dalla colorazione superficiale rossa nelle cellule che non sono ben polarizzate.

Parte della proteina di fusione GFP verrà consegnata alla membrana apicale. Se i campioni di controllo hanno questo aspetto, i dati non possono essere considerati attendibili e l'esperimento deve essere ripetuto con celle meglio polarizzate. Si noti che non tutto ciò che è espresso alla fusione GFP viene consegnato alla membrana basolaterale durante l'inseguimento di 31 gradi Celsius, come evidenziato dall'ampio segnale verde intracellulare per la proteina totale. Una volta padroneggiata, questa tecnica dovrebbe richiedere circa 10-12 ore dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico di membrana per esplorare le proteine regolatorie nelle cellule epiteliali polarizzate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere le proteine nelle cellule epiteliali polarizzate utilizzando la tecnica della microiniezione.