I microchip di silicio per la manipolazione di interazione cellula-cellula

Ciao, sono Elliot Hu.Sono un borsista post-dottorato nel laboratorio di Tia qui al Massachusetts Institute of Technology. Oggi prepareremo colture cellulari su micro chip meccanici di silicio. I dispositivi hanno l'aspetto di piccoli pettini che si bloccano insieme e ci permettono di manipolare con precisione le interazioni tra due diverse popolazioni di cellule.

Oggi studieremo l'interazione tra gli epatociti del fegato e le cellule stromali di supporto. In particolare, tre cellule di fibroblasti T vengono coltivate sulla superficie superiore dei pettini, in modo che spostando le dita del pettine, sia possibile spostare le cellule e modificare la loro disposizione spaziale. Ogni dispositivo è diviso in due parti che si incastrano in due possibili configurazioni.

Il primo mette in contatto le due popolazioni cellulari tra loro. Il secondo separa leggermente le due popolazioni in modo che le cellule non possano toccarsi. Qui, le interazioni di contatto sono impedite, ma le interazioni attraverso i fattori secreti sono preservate.

Iniziamo parlando di come maneggiare le parti con una pinzetta. Mi piace usare sia pinzette in teflon più grandi che pinzette in metallo a punta tonda più piccole. Con le pinzette più grandi, puoi raccogliere le parti sui bordi in questo modo con le parti più grandi con le braccia, devi stare attento a non rompere le braccia perché sono molto fragili.

Quindi vuoi raccoglierli sul retro della parte in questo modo. Con le pinzette di metallo, puoi raggiungere il foro e raccogliere direttamente i trucioli. Le parti più grandi si inseriscono in una parete di una piastra a 12 pozzetti, mentre le parti più piccole si inseriscono in una piastra a 24 pozzetti o possono essere abbinate alla parte più grande.

In una piastra a 12 pozzetti, di solito uso la pinzetta metallica. Quando maneggio le parti nelle piastre per far scattare due parti insieme, di solito metto prima la parte più grande nel pozzetto e la spingo completamente da un lato. Poi prendo la riparazione gratuita e la metto dall'altra parte del pozzo, e li ho spinti insieme prendendo due pinzette, una in ogni foro.

Quindi ora posso semplicemente bloccare le parti insieme, sia nella configurazione della fessura che nella configurazione dei contatti. Se voglio smontare le parti, mi piace tirare le parti fino alla configurazione dello spazio vuoto e poi tirare verso l'alto verticalmente per rimuovere la parte. Ora i dispositivi sono realizzati in silicone, quindi devono essere rivestiti per consentire una corretta adesione delle celle.

Probabilmente riceverai i dispositivi già rivestiti con polistirene e trattati al plasma, quindi daremo per scontato che questo sia il nostro punto di partenza. Prima di tutto, useremo il collagene per rivestire la superficie a cui si attaccheranno gli epatociti. Metteremo i pettini degli epatociti in un collagene da 50 microgrammi per mille, una soluzione, e incuberemo a 37 C per 45 minuti.

I pettini dei fibroblasti, d'altra parte, non abbiamo bisogno di rivestire. Dopo l'incubazione, aspiriamo la soluzione di collagene, laviamo e annaffiamo. Ora bloccheremo le ES a contatto con parti complementari in modo da formare una superficie piana per la semina cellulare.

Per prima cosa, riempiremo alcuni pozzi con il 70% di etanolo. Ne metto un paio in ogni pozzetto e poi li chiudo insieme. Dopo averlo bloccato insieme, vogliamo guardare le parti al microscopio per assicurarci che siano complanari.

Di tanto in tanto le parti possono bloccarsi insieme in modo disallineato. E sul microscopio vedrete che sono su due diversi piani focali. In questo caso, è sufficiente separare le parti e rimetterle insieme Dopo aver verificato che l'allineamento sia corretto, abbiamo lasciato riposare le parti nell'etanolo per un po' per sterilizzarle.

Spesso sono di fretta, quindi mi immergo per 10 minuti. Dopo la sterilizzazione, dobbiamo risciacquare. L'etanolo aspira accuratamente e si lava in acqua, quindi aspira e lava di nuovo in acqua, infine aspira l'acqua e la sostituisci con il terreno di coltura.

Ora andiamo a seminare le celle sui dispositivi. In genere, sospendiamo le cellule a una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro e pipettiamo una sospensione di un millilitro su ciascuna coppia di pettini utilizzando una piastra a 12 pozzetti. Quindi abbiamo seminato i fibroblasti a 500.000 cellule per millilitro in due dei pozzetti.

Allo stesso modo, abbiamo preso una sospensione di 500.000 epatociti per pozzetto e li abbiamo seminati negli altri due pozzetti. Ora, prima di incubare, scuoteremo accuratamente le cellule per assicurarci che siano distribuite uniformemente. E mi piace agitare tre volte verticalmente, tre volte orizzontalmente, e poi ripetere l'operazione tre volte.

Dopo averlo agitato, lo metteremo nell'incubatore e lasceremo riposare le cellule per 15 minuti, dopodiché le scuoteremo di nuovo. Dopo aver agitato ogni 15 minuti per un'ora, aspireremo la sospensione cellulare e giocheremo su una nuova sospensione di cellule. E ripeteremo questo fino a quando non avremo uno strato confluente di cellule.

Tipicamente con i fibroblasti, ci vogliono uno o due posti a sedere. E con gli epatociti può richiedere da due a quattro posti a sedere. Per ottenere un monostrato confluente, le cellule sono posizionate a una densità abbastanza elevata, l'agitazione, assicura che le cellule siano distribuite uniformemente.

Dopo la prima seduta, si forma uno strato rado di cellule. Si noti che le cellule si attaccano solo alle dita che sono state rivestite con polistirene e collagene. Dopo aver seminato cellule fresche e incubato per un'altra ora, sempre agitando ogni 15 minuti, lo strato cellulare diventa più denso.

Dopo la terza semina, abbiamo una buona densità cellulare, e ora possiamo fermarci dopo che le cellule sono state seminate sui favi. Vogliamo manipolare le cellule nella configurazione sperimentale desiderata. I dispositivi vengono ora separati dalle loro parti complementari e incubati per 24 ore.

Dopo 24 ore, le cellule si sono diffuse fino a formare un monostrato confluente sulla superficie dei favi. Ora vogliamo formare una co-cultura. Il pettine degli epatociti e il pettine dei fibroblasti vengono ora trasferiti nello stesso pozzetto e bloccati insieme nella configurazione iniziale desiderata.

Se lo si desidera. Dopo un certo periodo di tempo, è possibile modificare la configurazione. Ad esempio, possiamo passare alla configurazione a fessura dopo 18 ore, le parti vengono posizionate nella stessa, ben spinte insieme fino a raggiungere la configurazione a fessura e quindi spinte a contatto nella configurazione a fessura.

E ora rimuoveremo un pettine. Quello che faremo ora è passare attraverso il processo di rimozione del vecchio rivestimento di polistirolo, pulizia dei trucioli e quindi applicazione di un nuovo rivestimento di polistirene e preparazione per la coltura cellulare. Ancora una volta, rimuovendo il vecchio rivestimento di polistirolo e applicando un nuovo rivestimento, ci assicuriamo che nessuna parte della storia dell'esperimento precedente interferisca con un nuovo esperimento.

Quindi, dopo aver terminato il tuo esperimento, la prima cosa che vuoi fare è sbiancare le cellule e poi risciacquare i pettini e l'acqua. Quindi, prima di mettere le patatine nella punta, assicurati che siano completamente asciutte. Quindi qui abbiamo alcuni pettini che ho appena lasciato asciugare all'aria per un po' e controllare che sia completamente asciutto.

E così ora prenderemo un po' di toing e lo metteremo in questo altoparlante di vetro. Userò una pipetta di vetro qui in modo da non scioglierla. Halloween scioglie la plastica, quindi non possiamo usare una tipica pipetta di polistirolo.

Ok, è abbastanza. E ora prenderemo un paio di queste parti, le metteremo nella punta, e accenderò lo shaker per agitare e lo copriremo con un foglio di alluminio per evitare che il toluene evapori. Quindi, dopo due ore, il toluene dovrebbe aver sciolto la maggior parte del polistirolo sui pettini, e possiamo semplicemente estrarli e asciugare i favi all'aria.

Dopo il risciacquo di Halloween, le parti dovrebbero essere relativamente prive di polistirolo e dovrebbero essere relativamente pulite. Tuttavia, abbiamo bisogno che le parti siano estremamente pulite in modo che il nuovo strato di polistirene formi una buona adesione se non sono estremamente pulite. La polità tende a staccarsi nel mezzo dell'esperimento, quando le cellule iniziano a tirarla.

Quindi quello che faremo ora è una pulizia con acido piranha. Ho messo le parti in un altoparlante di vetro e lo riscalderemo. Quindi metteremo su un piatto caldo.

E qui abbiamo l'acido solforico e il perossido di idrogeno. Verserò prima l'acido solforico e, qui, mi assicurerò che tutti i trucioli siano immersi sotto il fluido. A volte hanno la tendenza a galleggiare.

E anche ora che stiamo lavorando con sostanze chimiche piuttosto corrosive, assicurati di indossare l'equipaggiamento protettivo giusto. Qui. Indosso guanti in nitrile. Ora verseremo il perossido di idrogeno nell'acido e stiamo attenti perché è una reazione esotermica.

Quindi puoi vedere che sta fumando un po' mentre reagisce, ma vogliamo aggiungere un po' di energia al sistema per renderlo ancora più reattivo. Quindi ora lo riscalderemo fino a 120 gradi Celsius circa all'una e 20 ora, quindi puoi stare certo che tutti i resti della tua coltura cellulare verranno completamente ripuliti dai tuoi chip. Quindi, a questo punto, si vuole semplicemente lasciare che la reazione faccia il suo corso completo fino a quando tutto il perossido di idrogeno non viene consumato.

E a quel punto, la miscela smetterà di gorgogliare. Quindi la reazione impiega circa mezz'ora per fare il suo corso. E dopo aver smesso di vedere le bolle, puoi semplicemente spegnere la piastra riscaldante e lasciarla raffreddare.

E li trasferiremo in un'acqua curva BAK. E ancora una volta, assicurati di usare una pinzetta in teflon qui, non in metallo, e puoi semplicemente prenderle, trasferirle. Quindi ora lo sciacquiamo sotto un flusso costante di DDH due O. Di solito lo prendo direttamente dal Meine e lo lasciamo in funzione per almeno 10 minuti qui.

E così facendo, laveremo via tutte le tracce di acido dopo averli tritati sotto un getto d'acqua per 10 minuti. L'acido dovrebbe essere rimosso dai trucioli e li conserveremo sott'acqua fino al momento in cui saremo pronti a rivestire il polistirene 45, 000 polistirene a peso molecolare che abbiamo ottenuto da Sigma. E ne peseremo una piccola quantità qui.

Abbiamo 400 milligrammi e li scioglieremo in toluene a 100 milligrammi per millilitro. Quindi il toluene deve essere maneggiato nel cappuccio. E l'altra cosa è che, dal momento che useremo un toluene per sciogliere il polistirolo, vogliamo assicurarci di non utilizzare indumenti da laboratorio realizzati in polistirolo.

Quindi qui stiamo usando polipropilene, conica e una pipetta di vetro. Quindi, dato che ho 400 milligrammi di polistirolo, metterò quattro millilitri di toing, e ora lo faremo vorticare per mezz'ora fino a quando la polistirina non si dissolverà. Quindi ora faremo vorticare il tubo alla velocità più bassa per circa 20 minuti o mezz'ora.

Quindi attaccherò il tubo ai vortici. Non devo tenerlo lì per tutto il tempo. Dopo 20-30 minuti, il polistirolo dovrebbe essere sciolto e siamo pronti per rivestirlo.

Ora andremo a rivestire il polistirolo nella nostra struttura. Il nostro spin coder si trova in una camera bianca. E quindi qui dobbiamo indossare un berretto, occhiali, un camice, stivaletti e guanti, ma potrebbe non essere lo stesso nella tua struttura.

Prima di usare questo mandrino, voglio proteggerlo dal polistirolo. Quindi lo copriremo con un foglio di alluminio e vogliamo renderlo il più piatto possibile rispetto alla superficie in modo che il chip possa sedersi a filo contro la superficie. Faremo un piccolo foro proprio al centro in modo da poter mantenere il vuoto sul chip.

Lo spin coder è impostato su 2, 400 giri/min e 30 secondi. Ora possiamo prendere uno dei nostri chip, posizionarlo in modo che il centro del chip copra il foro e all'inizio toglierò l'aspirapolvere quando indosso il polistirolo, accendo l'aspirapolvere e poi inizierò la rotazione. Quindi, per le parti più piccole, possiamo mettere giù solo meno di 10 gocce.

E per le parti più grandi, ci vogliono poco più di 10 gocce di polistirolo. E lo faremo girare per 30 secondi a 2.400 giri/min. Ora prenderemo i trucioli rivestiti di polistirene e li metteremo in forno a 120 gradi C.Questo è sopra il punto di transizione vetrosa del polistirolo.

Quindi rifarà scorrere la superficie per levigarla un po', e densificerà e indurirà anche la plastica. Quindi di solito lo lascio in forno per tutta la notte. Probabilmente ci vorranno almeno alcune ore per completare il processo.

Quindi, dopo una cottura notturna, le patatine sono pronte per il trattamento al plasma. Ora esporremo il polistirene a un plasma di ossigeno, e questo cambierà l'energia superficiale in modo che le proteine e le cellule vi aderiscano meglio. Quindi caricheremo i chip nella camera al plasma e li pomperemo fino al vuoto.

Una buona impostazione da utilizzare è 200 mil, giro di vuoto e 200 watt di potenza per un minuto sotto un flusso di ossigeno gassoso. Ora che il sistema è stato pompato verso il basso, introdurremo l'ossigeno. Ok, ora possiamo accendere l'alimentazione RF, colpire il plasma per un minuto.

Quindi, quando il plasma è in funzione, in realtà si illumina. È come una lampadina fluorescente. Dopo un minuto di esposizione al plasma, riporteremo la pressione verso l'alto nell'atmosfera e potremo estrarre le parti.

Ora le parti sono pronte per il rivestimento proteico e l'alimentazione cellulare. L'obiettivo nella progettazione di questo dispositivo era quello di essere in grado di manipolare la microarchitettura dei tessuti in modo dinamico. Quindi la micro organizzazione dei tessuti nel corpo, in particolare dove le cellule sono posizionate l'una rispetto all'altra, è molto importante nel determinare la funzione di ogni particolare cellula in coltura di laboratorio.

Fino a poco tempo fa, non siamo stati in grado di fare un buon lavoro nel replicarlo, ma negli ultimi cinque o 10 anni, le persone hanno iniziato a essere in grado di micromodellare le cellule su un substrato di coltura tissutale, mettendo così le cellule esattamente dove vogliamo averle in una piastra di coltura tissutale. E così facendo, sono stati in grado di scoprire alcuni aspetti importanti della biologia di base delle interazioni cellula-cellula su micro scala. Ora, quello che non siamo stati in grado di fare fino a questo punto è farlo in modo dinamico.

Cioè cambiare l'organizzazione di una coltura cellulare nel bel mezzo dell'esperimento. E questo è importante perché nel corpo, quindi, il tessuto non è in realtà un ambiente statico. Abbiamo cellule che si muovono e si riorganizzano, in particolare nella guarigione o nello sviluppo delle ferite.

Ma anche in un organo normale in omeostasi, c'è un sacco di roba che si muove. L'aspetto tecnico più difficile da imparare è proprio come mangiare fisicamente le parti. E inizialmente, quando inizi a lavorare con il sistema, potresti essere intimidito da quanto siano fragili le parti o da quanto siano piccole le emozioni che devi creare.

Ma penso che se ti eserciti con esso per un po', non dovresti avere troppi problemi. Alcuni dei luoghi in cui vediamo che questo dispositivo ha un ruolo, ad esempio, nello sviluppo embrionale, le cellule entreranno in contatto con una serie di ambienti cellulari diversi mentre le cellule germogliano attraverso vari strati embrionali. Ed è noto che le interazioni con ciascuno degli strati, quando entrano in contatto in sequenza, ci spingono tutti più avanti lungo uno specifico percorso di differenziazione.

E quindi pensiamo che questo tipo di dispositivo potrebbe essere buono per cercare di replicare quel tipo di evento in laboratorio. Uno degli aspetti della micro organizzazione che volevamo particolarmente esaminare era una differenza tra le cellule che comunicano attraverso interazioni di contatto in cui le membrane cellulari possono toccarsi l'una contro l'altra, rispetto ai fattori solubili che vengono secreti nei mezzi circostanti che si diffondono in una cellula che è un po' più lontana. E molte volte, quando le cellule sono in co-coltura e hanno un effetto l'una sull'altra, non è chiaro se si tratti o meno di interazioni di contatto o di fattori secreti che svolgono il ruolo.