Name: Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri un metodo semplice per isolare macrofagi da colture primarie di fegato di ratto senza attrezzature complesse. Questa tecnica consente di ottenere oltre dieci milioni di cellule purificate ripetutamente.

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Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di ricerca e una borsa-in-Aid dalla Food Project Nanotecnologia del Ministero dell&#39;agricoltura, delle foreste e della pesca del Giappone.

1. Perfusione del Fegato <ol><li> Anestetizzare un adulto maschio di ratto Sprague-Dawley (a 10 a 15 settimane di età, peso corporeo 150-200 g) con un'iniezione intraperitoneale di una soluzione di sodio pentobarbital (50 mg di sodio pentobarbital / kg di peso corporeo). </li><li> Posto l'animale in una padella in acciaio e spray etanolo al 70% sul suo addome e torace. </li><li> Fai un piccolo taglio e di staccare la pelle. Aperto l'addome dal taglio con un paio di forbici. </li><li> Confermare la posizione di vena porta, passa un filo chirurgico sotto la vena porta e liberamente si aggregano. </li><li> Clump la parte distale della vena cava inferiore e la vena mesenterica per prevenire il reflusso del sangue nel fegato. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma con le forbici, ed esporre il cuore. </li><li> Inserire un catetere di plastica (2 mm di diametro) nella vena porta e serrare saldamente il filo intorno al catetere. </li><li> Collegare il catetere ad un sistema di perfusione che viene caricato con soluzione di lavaggio (Ca 2 +-Mg 2 + HBSS gratuito contenente 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM e 4,2 mM NaHCO 3; pH 7,2) preriscaldata a 37 ° C. </li><li> Iniziare perfusione in situ a una velocità di 10 ml / min. Allo stesso tempo, fare un taglio nella parete dell'atrio destro. Continua perfusione per 10 minuti. </li><li> Accendere la soluzione di perfusione alla soluzione collagenasi [HBSS contenente HEPES 10mm e 4,2 mm NaHCO 3 integrati con collagenasi di tipo I (0,05%) e inibitori della tripsina (50 mg / ml), pH 7,5], e profumato per 10 - 20 minuti a una velocità di 10 ml / min fino a quando il fegato si gonfia leggermente e mostra il segno di disintegrazione della struttura del fegato sotto membrana sierosa. </li></ol> 2. Preparazione di epatociti parenchimale ricchi frazione di cellule <ol><li> Rimuovere e trasferire con cautela il fegato in un bicchiere sterile contenente 25 ml di soluzione di collagenasi. Tritare in piccoli pezzi con le forbici. </li><li> Aggiungere 75 ml di MEM freddo nella sospensione cellulare risultante. Dopo pipettaggio dolce, filtrato attraverso un colino cellulare (100 micron) per rimuovere i tessuti connettivi e frammenti di tessuto non digerito. </li><li> Trasferire il filtrato in provette da 50 ml e centrifugare a 50 xg per 1 minuto a 4 ° C (freno off). </li><li> Eliminare attentamente il supernatante. Risospendere il pellet con MEM freddo. </li><li> Ripetere 2,4) tre volte. </li></ol> 3. Misti Cultura primaria delle cellule del fegato <ol><li> Sospendere le cellule ottenute in 2.5) nel mezzo di crescita composto da DMEM contenente 10% FCS inattivato con il calore, integrato con 100 mM β-mercaptoetanolo, 10 mg / ml di insulina, 100 mg / ml di streptomicina e 100 U / ml di penicillina, e di semi in 09:55 tessuto fiaschi cultura (superficie: 75 cm 2) ad una densità di 6,7 x 10 4 cellule / cm 2 (5 x 10 6 cellule / fiasco / 12 -15 ml di terreno). </li><li> Incubare la cultura flasksat 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria. </li><li> Sostituire il mezzo di coltura ogni 2 o 3 intervalli di giorni. </li></ol> 4. Isolamento selettivo dei macrofagi <ol><li> Dopo 12 giorni di coltura, i macrofagi proliferano sul foglio delle cellule. Queste cellule sono sospese dalle reciproche agitazione dei flaconi cultura a 80-120 colpi al minuto per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Trasferire il terreno di coltura in 100 mm non tessuto cultura piatti di qualità plastica. Piscina del mezzo da due T75 fiaschi in un piatto di plastica. Fiaschi cultura riempire con il mezzo di crescita e li riporta ai incubatrice. </li><li> Incubare piatti di plastica per 30 minuti a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria. Macrofagi prontamente attribuiscono alla non-tessuti piatti di plastica di qualità della cultura in questo processo di incubazione, mentre altre cellule contaminanti non lo fanno. </li><li> Aspirare il mezzo e risciacquare delicatamente il piatto di plastica con PBS. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione TrypLE espresso nel piatto, e incubare per 10 minuti a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria. </li><li> Aggiungere 9 ml del mezzo di crescita. Delicatamente togliere la macrofagi attaccato da un raschietto cellula. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 min a 25 ° C (freno). </li><li> Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml del mezzo di crescita. Dissociano in singole cellule pipettando vigoroso. Enumerare il numero di cellulare da un emocitometro conteggio. </li><li> Passaggi di isolamento può essere ripetuto con la stessa cultura fiaschi a intervalli di 2-3 giorni per più di due settimane. </li><li> Macrofagi isolati possono essere coltivate in terreno di coltura cui al punto 3.1. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Un esempio di una coltura mista primaria di cellule adulte fegato di ratto è illustrato nella figura 2. Epatociti parenchimale perdere la morfologia delle cellule epiteliali in pochi giorni di cultura, degeneri o si trasformano in fibroblasto-come le cellule.Poi, intorno al giorno 6 a 12, a contrasto di fase-brillante, tondo macrofago-come le cellule proliferano vigourouly sul foglio cellulare fibroblastica. Agitando dei flaconi cultura, i macrofagi sono prontamente sospese nel terreno di coltura, e il successivo trasferimento e l'incubazione in piatti di plastica risultato in adesione selettiva dei macrofagi (Figura 3). Il macrofago-come le cellule possono essere raccolte fin dal giorno 8, e il numero ha raggiunto livelli massimi nei giorni 12 a 14. Più di 10 6 cellule possono essere raccolte da un pallone T75 cultura ripetutamente da 2 a intervalli di 3 al giorno per più di due settimane, consentendo un rendimento totale di cellule per bombola del 10 7 al T75 fiasco cultura (Figura 3). La purezza dei macrofagi isolati sono stati del 95 al 99%, come valutato da flowcytometry o immunocitochimica con ratto macrofagi anticorpi specifici, come ED-1 (Figura 4), ​​ED-3, OX-41 (Figura 4) e Iba1 9. Le cellule isolate mostrano caratteristiche tipiche dei macrofagi, come la fagocitosi attiva di perline polystylene (Figura 5), la risposta proliferativa a ricombinante GM-CSF, la secrezione di infiammatorio / citochine antinfiammatorie sulla stimolazione con LPS, e la formazione di cellule giganti multinucleate 9. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un sistema per l'isolamento e la purificazione dei macrofagi come cellule miste colture primarie di cellule di fegato di ratto. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Colture primarie di cellule di fegato di ratto e la proliferazione dei macrofagi come cellule. Freccia indica una cella multinucleare gigante. Barra di scala = 100 micron. Ristampato dalla Gazzetta di metodi immunologici, Vol.360, 47-55 (2010) 9 con il permesso di Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Isolamento selettivo di macrofagi come le cellule dalle scosse e il metodo di fissaggio. Le cellule sono state sospese nel terreno di coltura agitando i palloni, successivamente trasferito in non-tessuto piatti di plastica cultura grado, e incubate a 37 ° C. Già 10 minuti dopo la placcatura, macrofagi come le cellule attaccate alla superficie piatto, mentre altre cellule contaminanti fibroblastica è rimasta in sospeso. Dopo il risciacquo con PBS, una popolazione di macrofagi altamente purificato è stato ottenuto. Queste cellule guadagnato morfologia tipica dei macrofagi dopo 40 min di cultura e cellule mitotiche sono stati osservati frequentemente (frecce). Successive modifiche del numero delle cellule recuperato palloni in periodi di diversa cultura sono mostrati. I valori sono una media ± SD 3-5 fiaschi. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte ed i dati sono indicate da simboli diversi. Barra di scala = 100 micron. Ristampato dalla Gazzetta di metodi immunologici, Vol.360, 47-55 (2010) 9 con il permesso di Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Colorazione immunocitochimica dei macrofagi come cellule con anticorpi monoclonali contro macrofagi di ratto. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Fagocitosi di marcato con FITC microsfere da macrofagi come cellule.

<ol><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+as+a+lymphoid+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li>
<li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li>
<li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver%3A+An+organ+with+predominant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li>
<li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li>
<li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li>
<li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li>
<li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li>
<li>Gorrell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+the+hepatocyte+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li>
</ol>

Tutti gli animali erano tenuti e gestiti nella struttura animale presso l&#39;Istituto Nazionale della Salute degli animali, secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal comitato dell&#39;istituzione per gli esperimenti sugli animali.

Qui riportiamo un metodo semplice ed efficace per ottenere macrofagi dalle culture miste primarie di cellule adulte fegato di ratto. Il nostro metodo si basa sul primo romanzo l&#39;attività proliferativa dei macrofagi nella cultura mista di cellule del fegato di ratto, e poi il successivo isolamento e la purificazione di queste cellule in base alle loro caratteristiche biologiche come macrofagi 9. Potrebbe essere possibile i macrofagi proliferato nella cultura misto primario delle cellule epatiche adulte potrebbero avere origine da cellule di Kupffer o correlati che contaminata nella frazione parenchimale epatociti. I macrofagi potrebbe avere risposto a specifici cambiamenti ambientali causati dalla trasformazione delle cellule parenchimali epatociti 10 e altre fibroblastica in colture miste primarie. In conclusione, il nostro metodo fornisce l&#39;isolamento di cellule macrofaghe in numero sufficiente e la purezza della cultura primario del fegato di ratto cellswithout utilizzando sofisticate apparecchiature e competenze tecniche. Inoltre, la procedura di isolamento può essere ripetuta con il pallone stessa cultura per più di due settimane. Questo metodo può essere applicabile ad altre specie di mammiferi.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Soluzione di sodio pentobarbital </td><td> Kyoritsu Seiyaku </td><td> Somnopentyl iniezione </td><td></td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> Glicole etilenico tetracetico acido (EGTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd. </td><td> 032-10534 </td><td> Dissociazione delle cellule di grado (Lotto controllo necessario) </td></tr><tr><td> Inibitori della tripsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9128 </td><td></td></tr><tr><td> Medio minimo indispensabile aquila (MEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-4655 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificato Mezzo di Eagle (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-6459 </td><td> Alta glucosio-tipo </td></tr><tr><td> Di siero fetale bovino (FCS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td> Inattivato con il calore a 56 ° C per 30 min. (Lotto controllo necessario) </td></tr><tr><td> TrypLE espresso </td><td> Invitrogen </td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di soluzione salina tamponata Dulbecco (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td> Ca 2 +-Mg 2 + libero </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-7522 </td><td> Magazzino: 100 mm di acqua distillata </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-5500 </td><td> Disponibile: 10 mg / ml in 0,1 N HCl </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Cellula filtro </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Dimensioni di maglia: 100 micron </td></tr><tr><td> Tessuto cultura fiasco </td><td> Sumitomo Bakelite Co., Ltd. </td><td> MS-21250 </td><td> Superficie: 75 cm 2 </td></tr><tr><td> Non-tessuti piatti della cultura plastica </td><td> BD Biosciences </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Cell scraper </td><td> Corning Inc. </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Reciproca shaker </td><td> TAITEC </td><td> NR-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Cellule di Kupffer del fegato sono specifici per macrofagi residenti e svolgono un ruolo importante nelle funzioni fisiologiche e patologiche del fegato 1-3. Anche se i metodi di isolamento dei macrofagi del fegato sono state ben descritte 4-6, la maggior parte di questi metodi richiedono apparecchiature sofisticate, come un elutriator centrifuga e competenze tecniche. Ecco, mettiamo a disposizione un nuovo metodo per ottenere i macrofagi del fegato in numero sufficiente e purezza da miste colture primarie di cellule adulte fegato di ratto, come schematicamente illustrato nella figura 1. Dopo la dissociazione delle cellule del fegato da due fasi metodo di perfusione 7,8, una frazione per lo più composto da epatociti parenchimale è preparato e seminato in fiasche T75 tessuto cultura con terreno di coltura costituito da DMEM e il 10% epatociti FCS.Parenchymal perdere la morfologia delle cellule epiteliali entro pochi giorni di cultura, degeneri o si trasformano in cellule fibroblasto-simili (Figura 2). Con il procedere della cultura, intorno al 6 ° giorno, contrasto di fase-brillante, tondo macrofagi, come le cellule a proliferare sul foglio delle cellule fibroblastica (Figura 2). La crescita del macrofago-come le cellule continuare e arrivare ai livelli massimi intorno al giorno 12, che copre strato di cellule sulla superficie del pallone. Agitando dei flaconi cultura, i macrofagi sono prontamente sospese nel terreno di coltura. Il successivo trasferimento e breve incubazione in plastica risultato piatti in adesione selettiva dei macrofagi (Figura 3), dove rimangono sospese come le altre cellule contaminanti. Dopo diversi lavaggi con PBS, i macrofagi allegato vengono raccolte. Più di 10 6 cellule possono essere raccolte più volte dallo stesso T75 fiasco colture di tessuti a intervalli di 2-3 giorni per più di due settimane (Figura 3). La purezza dei macrofagi isolati sono stati del 95 al 99%, valutata mediante citometria di flusso o immunocitochimica con ratto macrofagi anticorpi specifici (Figura 4). Le cellule isolate mostrano fagocitosi attiva di perline polystylene (Figura 5), ​​la risposta proliferativa a ricombinante GM-CSF, la secrezione di infiammatorio / citochine antinfiammatorie sulla stimolazione con LPS, e formazione di cellule giganti multinucleate 9. In conclusione, mettiamo a disposizione un metodo semplice ed efficace per ottenere i macrofagi del fegato in numero sufficiente e purezza senza attrezzature complesse e skills.This metodo potrebbe essere applicabile ad altre specie di mammiferi.

Un nuovo metodo per ottenere i macrofagi da colture primarie di cellule di fegato di ratto è descritto. Questo metodo utilizza la proliferazione dei macrofagi nella cultura, seguita da agitazione di palloni cultura e la purificazione di attaccamento selettivo ai piatti di plastica. Questa tecnica fornisce in modo efficiente i macrofagi del fegato, senza attrezzature complesse e competenze.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Le cellule di Kupffer sono macrofagi residenti specifici del fegato e svolgono un ruolo importante nelle funzioni fisiologiche e patologiche di tale organo1-3. Sebbene...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere diverse colture di macrofagi da colture primarie miste di cellule epatiche di ratto, senza la necessità di attrezzature complesse o competenze specialistiche. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissociando le cellule epatiche di ratto adulte mediante perfusione con collaghenasi, seguita dall'isolamento della frazione cellulare di epatociti parenchimali. Successivamente, le cellule vengono incubate in fiaschi per colture cellulari di superficie 75 cm² (T 75) con mezzo di crescita per stabilire colture primarie miste di cellule epatiche.Dopo 10-12 giorni di coltura, i flaconi di coltura vengono agitati per facilitare il trasferimento dei macrofagi in piastre di plastica, da cui vengono quindi raccolti mediante adesione selettiva dopo un breve periodo di incubazione. Infine, più di 106 cellule possono essere raccolte ripetutamente dagli stessi flaconi di coltura tissutale T75 a intervalli di due-tre giorni per un periodo superiore a due settimane. I metodi di isolamento dei macrofagi epatici sono stati ampiamente descritti.Tuttavia, la maggior parte dei metodi precedenti richiede attrezzature sofisticate come un centrifugo illustratore e competenze tecniche avanzate. Presentiamo qui un metodo semplice e innovativo per ottenere macrofagi epatici in numero e purezza sufficienti da colture primarie miste di cellule epatiche adulte avvolte, che non richiede attrezzature speciali né competenze di laboratorio avanzate. La dissezione dell'animale, la perfusione del fegato e la preparazione delle cellule saranno dimostrate dai dottori Norco, Yamanaka e Miko Yoshioka presso l'Istituto Nazionale di Sanità Animale.Successivamente, il dottor Taketo Takeno presso l'Istituto Nazionale di Scienze Agrobiologiche mostrerà l'isolamento e la purificazione dei macrofagi epatici dai rischi culturali. Cominciamo dunque. Per preparare la perfusione del fegato del ratto, iniziare preriscaldando una bottiglia di soluzione lavante e una bottiglia di soluzione di collaghenasi.Successivamente, dopo aver confermato la sedazione mediante pizzicamento cutaneo, posizionare un ratto maschio adulto anestetizzato in un vassoio di acciaio inossidabile e spruzzare etanolo al 70% sull'addome e sul torace. Poi, praticare un piccolo taglio al centro dell'addome con forbici da dissezione e sollevare la pelle. Quindi, aprire l'addome con le forbici e verificare la posizione della vena porta.Successivamente, passare il filo chirurgico sotto la vena porta e stringerlo leggermente. Quindi clampare la parte distale della vena cava inferiore e della vena mesenterica con una pinza emostatica per prevenire il reflusso di sangue nel fegato. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma con forbici e, dopo aver praticato una piccola incisione nella vena porta con forbici oftalmiche, esporre il cuore, inserire un catetere di plastica di due millimetri nella vena e stringere saldamente il filo intorno al catetere.Caricare un sistema di perfusione con la soluzione di lavaggio preriscaldata e quindi collegarlo al catetere. Iniziare la perfusione in C due a una velocità di 10 millilitri al minuto. Allo stesso tempo, effettuare un'incisione nella parete dell'atrio destro con forbici da dissezione.Continuare la perfusione per 10 minuti, quindi sostituire la soluzione di perfusione con la soluzione di collaghenasi e perfondere per 10-20 minuti. Alla velocità di 10 millilitri al minuto, riempire un becher sterile con 25 millilitri di soluzione di collaghenasi. Successivamente, rimuovere il fegato perfuso e posizionarlo con attenzione nel becher.Tagliare il fegato in piccoli pezzi con le forbici. Aggiungere 75 millilitri di MEM freddo nella sospensione cellulare ottenuta. Dopo un'accurata pipettatura, filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri.Per rimuovere il tessuto connettivo nei frammenti di tessuto non digeriti, raccogliere il filtrato in provette coniche da 50 millilitri. Trasferire il filtrato in provette coniche da 50 millilitri e lavare le cellule quattro volte centrifugando prima le cellule a 50 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Con la frenata disattivata, scartare con attenzione il soprannatante, quindi risospendere il pellet in MEM freddo e centrifugare nuovamente le cellule dopo l'ultimo lavaggio.Risospendere le cellule epatiche nel mezzo di crescita. Seminare ora le cellule in cinque o dieci fiaschi da coltura tessutale di superficie 75 cm² ad una densità di 6,7 × 10⁴ cellule per centimetro quadrato. Posizionare i fiaschi di coltura in un incubatore e sostituire il mezzo di crescita ogni due o tre giorni.Dopo un giorno di coltura, gli epatociti parenchimali si espandono sulla superficie della fiasca e mostrano una tipica morfologia poligonale simile a pietre calcaree, con uno o due nuclei rotondi. Entro pochi giorni di coltura, gli epatociti parenchimali perdono la loro morfologia da cellule epiteliali e si trasformano in cellule fibroblastiche più appiattite. Intorno al sesto giorno, al contrasto di fase, compaiono cellule rotonde e brillanti simili a macrofagi che iniziano a proliferare sul foglietto di cellule fibroblastiche. La crescita delle cellule simili a macrofagi raggiunge livelli massimi intorno al dodicesimo giorno.Il numero di cellule di tipo macrofagico diminuisce intorno al giorno 19, quando il foglietto cellulare fibroblastico inizia a degenerare. Pertanto, intorno ai sette-dieci giorni di coltura, sospendiamo i macrofagi che si sono proliferati sul foglietto cellulare nel mezzo di coltura, agitando reciprocamente i flaconi di coltura per 30 minuti dopo aver risospeso i macrofagi. Distribuiamo il mezzo di due fiasche T75 in ciascuna delle piastre di plastica non adatte alla coltura tessutale da 100 millimetri.Riempire nuovamente le fiasche di coltura con mezzo di crescita e riposizionarle nell'incubatore. Incubare le piastre di plastica per 30 minuti dopo il periodo di incubazione, quindi lavare le piastre tre volte aspirando il mezzo e risciacquando delicatamente la piastra di plastica con PBS, come mostrato qui, già a partire da 10 minuti dopo la semina, quando le cellule simili a macrofagi si sono attaccate alla superficie della piastra mentre altre cellule fibroblastiche contaminanti rimangono in sospensione. Dopo il risciacquo con PBS, si ottiene una popolazione di macrofagi altamente purificata.Come mostrato in questa figura, le cellule assumono una tipica morfologia di macrofago dopo 40 minuti di coltura e frequentemente si osservano cellule in mitosi, come indicato dalle frecce. Per raccogliere questa nuova popolazione altamente purificata di macrofagi, aggiungere un millilitro di soluzione trip LE Express alle cellule lavate e riposizionare le piastre nell'incubatrice per ulteriori 10 minuti. Al termine di questo periodo di incubazione, aggiungere nove millilitri di mezzo di crescita, quindi staccare delicatamente i macrofagi aderenti con lo strumento raschiante e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri, centrifugare e scartare il soprannatante.Aggiungere un millilitro di mezzo di crescita, dissociare gli aggregati cellulari risospesi in cellule singole mediante pipettaggio vigoroso, enumerare il numero di cellule utilizzando un emocitometro come mostrato in questo grafico; più di 10 delle sei cellule possono essere raccolte ripetutamente da un’ampolla di coltura T75 a intervalli di due-tre giorni per oltre due settimane, consentendo un rendimento cellulare totale di 10 alla settima per ogni ampolla di coltura T75. Come mostrato in queste immagini, le cellule isolate sono immuno marcate con anticorpi monoclonali contro antigeni di macrofagi di ratto, come CD68 o ED1 e CD172A o OX41. Queste cellule possiedono proprietà funzionali dei macrofagi, come la fagocitosi attiva di microperle marcate con FITC.In questo video, abbiamo presentato un metodo semplice ed efficiente per ottenere macrofagi da colture primarie miste di cellule epatiche rosse adulte. La nostra procedura non richiede attrezzature o competenze complesse, ma fornisce un numero sufficiente di macrofagi puri che possono essere raccolti ripetutamente dalla stessa coltura di fegato. Questo metodo può essere applicato ad altre specie di mammiferi.Grazie per aver guardato il video e buona fortuna nei vostri futuri esperimenti. Saluti.

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Immunologia e Infezioni

Derivate da monociti macrofagi sono cellule importanti del sistema immune innato. Qui, descriviamo un facile da...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Il protocollo utilizza la crioconservazione dei monociti accoppiata alla loro differenziazione di massa in macrofagi. Quindi i macrofagi raccolti possono essere seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l'analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

L&#39;isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

Qui vi mostriamo un approccio enzimatico per isolare epatociti primari da topi adulti, e descriviamo la quantificazione di una risposta infiammatoria con ELISA e PCR in tempo reale.

L&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

Questo protocollo consente un ricercatore di isolare e caratterizzare residente in tessuto hallmark macrofagi in vari tessuti infiammati estratte dai modelli indotta da dieta di disordini metabolici.

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Vi presentiamo un protocollo per ottenere le firme di proteomica dei macrofagi umani e da applicare per determinare l'impatto di un ambiente di ossigeno basso sulla polarizzazione del macrofago.

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Questo protocollo è un metodo efficiente, conveniente e robusto per isolare la microglia primaria dal tessuto cerebrale umano vivo, adulto. Microglia umana primaria isolata può servire come strumento per studiare i processi cellulari in omeostasi e malattia.

Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Qui, presentiamo un protocollo per studiare l'interazione di macrofagi primari derivati da monociti umani con uno sferoide tumorale in una matrice di collagene I tridimensionale (3D), con la possibilità di confrontare l'impatto delle proprietà solubili e fisiche del microambiente sull'invasione cellulare.

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Scopri un metodo semplice per isolare macrofagi da colture primarie di fegato di ratto senza attrezzature complesse. Questa tecnica consente di ottenere oltre dieci milioni di cellule purificate ripetutamente.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

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