Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere più colture di macrofagi da colture primarie miste di cellule epatiche di ratto senza la necessità di attrezzature o competenze complesse. Ciò si ottiene prima attraverso la dissociazione di cellule epatiche di ratto adulto mediante perfusione di collagenasi, seguita dall'isolamento della frazione di cellule epatocitarie parenchimali. Successivamente, le cellule vengono incubate in T 75, fiasche di coltura tissutale con terreno di crescita per stabilire colture primarie miste di cellule epatiche.

Quindi, dopo 10-12 giorni di coltura, i flaconi di coltura vengono agitati per facilitare il trasferimento dei macrofagi in piastre di plastica da cui vengono poi raccolti mediante adesione selettiva dopo un breve periodo di incubazione. Infine, più di 10 delle sei cellule possono essere prelevate ripetutamente dagli stessi flaconi di coltura tissutale T 75 a intervalli di due o tre giorni per più di due settimane. I metodi di isolamento dei macrofagi epatici sono stati ben descritti.

Tuttavia, la maggior parte dei metodi precedenti richiede attrezzature sofisticate come un illustratore centrifugo e raffinate competenze tecniche. Qui presentiamo un metodo semplice e innovativo per ottenere macrofagi epatici in numero e purezza sufficienti da colture primarie miste di cellule epatiche adulte avvolte che non richiedono attrezzature speciali o competenze di laboratorio avanzate. La dissezione animale, la perfusione del fegato e la preparazione dei citi saranno dimostrate dai dottori Norco, Yamanaka e Miko Yoshioka presso il National Institute of Animal Health.

Successivamente l'isolamento e la purificazione dei macrofagi epatici dai rischi colturali saranno dimostrati dal Dr.Taketo Takeno presso l'Istituto Nazionale di Scienze Biologiche Agrologiche. Quindi iniziamo. Per prepararsi alla profusione del fegato di ratto, iniziare preriscaldando un flacone di soluzione di lavaggio e un flacone di soluzione di collagenasi.

Quindi, dopo aver confermato la sedazione con pizzicamento cutaneo, posizionare un ratto maschio adulto anestetizzato in una padella di acciaio inossidabile e spruzzare etanolo al 70% sull'addome e sul torace. Quindi, fai un piccolo taglio al centro dell'addome con le forbici da dissezione e stacca la pelle. Quindi aprire l'addome con le forbici e confermare la posizione della vena porta.

Quindi, passare il filo chirurgico sotto la vena porta e stringere senza stringere il filo. Quindi bloccare la parte distale del vanoc cava inferiore e la vena mesenterica con una pinza per zanzare per prevenire il reflusso di sangue nel fegato. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma con le forbici ed esporre il cuore dopo aver praticato una piccola incisione nella vena porta con le forbici oftalmiche, inserire un catetere di plastica da due millimetri nella vena e stringere saldamente il filo attorno al catetere.

Caricare un sistema di perfusione con la soluzione di lavaggio preriscaldata e quindi collegarlo al catetere. Iniziare la perfusione in C 2 a una velocità di 10 millilitri al minuto. Allo stesso tempo, praticare un taglio nella parete destra dell'atrio con le forbici da dissezione.

Continuare la profusione per 10 minuti, quindi passare la soluzione di profusione alla soluzione di collagenasi e perfondere per 10-20 minuti. A una velocità di 10 millilitri al minuto, riempire un becher sterile con 25 millilitri di soluzione di collagenasi. Quindi rimuovere e posizionare con cura il fegato perfuso nel becher.

Tritare il fegato a pezzetti con le forbici. Aggiungere 75 millilitri di MEM freddo nella sospensione cellulare risultante. Dopo un pipettaggio delicato, filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri.

Per rimuovere il tessuto connettivo nei frammenti di tessuto non digerito, raccogliere il filtrato in tubi conici da 50 millilitri. Trasferire il filtrato in provette coniche da 50 millilitri e lavare le celle quattro volte facendo girare prima le celle a 50 Gs per un minuto a quattro gradi Celsius. Con la rottura, scartare con cura il surnatante e quindi risospendere il pellet in MEM freddo e far girare nuovamente le celle verso il basso dopo l'ultimo lavaggio.

Risospendere le cellule del fegato nel mezzo di crescita. Ora semina le cellule in fiasche di coltura tissutale da cinque a 10 T 75 a una densità di 6,7 volte 10 per la quarta cellula per centimetro quadrato. Metti i palloni di coltura in un'incubatrice e sostituisci il terreno di coltura ogni due o tre giorni.

Dopo un giorno di coltura, gli epatociti parenchimali si diffondono sulla superficie del pallone e mostrano la tipica morfologia poligonale simile alla pietra copale con uno o due nuclei rotondi. Entro pochi giorni dalla coltura, gli epatociti parenchimali perdono la loro morfologia cellulare epiteliale e si trasformano in cellule fibroblastiche più appiattite Intorno al sesto giorno, le cellule macrofagiche rotonde e luminose iniziano a proliferare sul foglio cellulare fibroblastico. La crescita delle cellule simili ai macrofagi raggiunge i livelli massimi intorno al 12° giorno.

Il numero di cellule simili ai macrofagi diminuisce intorno al giorno 19, quando il foglio cellulare fibroblastico inizia a degenerare. Quindi, intorno ai sette-10 giorni di coltura, sospendiamo i macrofagi che hanno proliferato sul foglio cellulare nel terreno di coltura agitando reciprocamente le fiasche di coltura per 30 minuti dopo che i macrofagi sono stati risospesi. Suonare ciascuna delle piastre di plastica da 100 millimetri non per coltura tissutale con il mezzo di due fiasche T 75.

Riempire nuovamente i palloni di coltura con il terreno di coltura e rimetterli nell'incubatrice. Incubare le piastre di plastica per 30 minuti dopo il periodo di incubazione, lavare le piastre tre volte aspirando il terreno e risciacquare delicatamente la capsula di plastica con PBS come si vede qui già 10 minuti dopo aver placcato le cellule simili ai macrofagi attaccate alla superficie della capsula mentre altre cellule fibroblastiche contaminanti rimangono sospese. Dopo il risciacquo con PBS, si ottiene una popolazione di macrofagi altamente purificata.

Come si vede in questa figura, le cellule acquisiscono la tipica morfologia macrofagica dopo 40 minuti di coltura e le cellule mitotiche sono frequentemente osservate come indicato dalle frecce. Per raccogliere questa nuova popolazione di macrofagi altamente purificata, a un millilitro di distanza, la soluzione LE Express si riversa nelle cellule lavate e rimette le piastre nell'incubatore per altri 10 minuti. Dopo questo periodo di incubazione, aggiungere nove millilitri di terreno di crescita e quindi raschiare delicatamente i macrofagi attaccati con il raschietto cellulare e trasferirli in una centrifuga a provetta conica da 15 millilitri e scartare il surnatante.

Aggiungere un millilitro di terreno di coltura, dissociare i grumi di cellule risospese in singole cellule mediante pipettaggio vigoroso, enumerare il numero di cellule mediante emocitometro come mostrato in questo grafico, più di 10 delle sei cellule possono essere raccolte da un pallone di coltura T 75 ripetutamente a intervalli di due o tre giorni per più di due settimane, consentendo una resa totale di celle da 10 a sette per pallone di coltura T 75. Come mostrato in queste immagini, le cellule isolate sono immuno colorate con anticorpi monoclonali contro gli antigeni dei macrofagi di ratto come CD 68 o ED one e CD 1 72 A o OX 41. Queste cellule possedevano proprietà funzionali dei macrofagi come la fagocitosi attiva delle microsfere marcate FITC.

In questo video, abbiamo presentato un metodo semplice ed efficiente per ottenere macrofagi da colture primarie miste di cellule di fegato rosso adulto. La nostra procedura non richiede attrezzature o competenze complesse, ma fornisce un numero sufficiente di macrofagi puri che possono essere raccolti ripetutamente dalla stessa coltura di ottone. Questo metodo può essere applicato ad altre specie di mammiferi.

Grazie per aver guardato il video e buona fortuna per i tuoi futuri esperimenti. Cin cin.