Name: Protocollo per lisolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara un protocollo per isolare epatociti umani primari e popolazioni di cellule non-parenchimali dal medesimo donatore. Questa tecnica garantisce alta resa e vitalità cellulare per modelli epatici in vitro e ingegneria tissutale.

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Vorremmo ringraziare Jia Li Liu per il loro supporto nella creazione della figura 1. Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e Progetto di ricerca (BMBF) Fegato virtuale: 0.315.741.

Nota: Tutte le cellule sono state isolate da tessuto epatico resecato non tumorale umano, che è rimasto dopo resezione parziale del fegato con tumori epatici primari o secondari. Il consenso informato dei pazienti è stato ottenuto secondo le linee guida etiche del Charité - Universitätsmedizin Berlino. 1. Preparazione di materiali e soluzioni <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti ed i materiali in anticipo per evitare contaminazione batterica durante il processo di isolamento. </li><li> Preparare le soluzioni richieste per la perfusione del campione di tessuto epatico, il processo di isolamento di epatociti e cellule epatiche non parenchimali e la coltivazione di cellule epatiche umane primarie secondo le tabelle 1 e 2, ad eccezione di digestione-Solution che viene preparato fresco prima dell&#39;uso. Tutte le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C e si raccomanda di utilizzarle entro 4 settimane dopo la preparazione. </li><li> Sterilizzaretutte le soluzioni che utilizzano un filtro alto 0,22 micron bottiglia. </li></ol> 2. Preparazione di perfusione attrezzature <ol><li> Impostare l&#39;apparecchiatura per la perfusione e la digestione del campione di tessuto epatico come mostrato nella Figura 1A. </li><li> Regolare la temperatura del bagno di acqua a 39 ° C per garantire un&#39;attività P ottimale collagenasi durante la perfusione e la digestione. </li></ol> 3. perfusione e la digestione del Campione tessuto di fegato (1,5 ore) <ol><li> Selezionare un campione di tessuto con la capsula intatta di Glisson dal tessuto epatico asportato. Quando si taglia il campione di tessuto, cercare di ottenere una piccola superficie di taglio con buoni vasi visibili. Evitare tempi di ischemia calda per il trasporto e la manipolazione del campione di tessuto epatico in ghiaccio fino perfusione. </li><li> Prendere il peso del tessuto in condizioni sterili e posizionare il campione di tessuto epatico in una capsula di Petri nel flusso d&#39;aria laminare. Pulire la superficie del campione di tessuto con una compressa sterile reprodotti minerali di sangue e lavare il set cannula utilizzando 1x perfusione-Soluzione per assicurare che tutte cannula erano permeabili. </li><li> Utilizzare colla tessuto per fissare le olive delle cannule in alcuni vasi sanguigni più grandi. A seconda della dimensione del campione di tessuto epatico e il numero dei vasi sulla superficie, utilizzare una cannula set con 3 a 8 cannule. Testare la perfusione e verificare la presenza di perdite. Chiudere tutti i vasi sanguigni, che fuoriescono 1x perfusione-Soluzione, con la colla del tessuto. </li><li> Posizionare il campione di tessuto epatico cannulato nell&#39;imbuto Büchner sul suo disco filtrante forato (Figura 1A). </li><li> Impostare la portata della pompa peristaltica tra 7,5 ml / min e 14,6 ml / min a seconda del numero di cannule utilizzati e sulla resistenza del tessuto epatico. Regolare la portata ogni volta per garantire che vi sia una perfusione corrente ma lento. Profumato il tessuto fino al sangue intero viene risciacquato ma almeno 20 min. Osservare il tessuto diventerà più luminosa in aree con buone perfusisopra. Nota: In alcuni casi, può essere necessario bloccare uno dei cannule con fascette di plastica o per aumentare la pressione interna di una zona spingendo dolcemente con una spatola contro la capsula epatica, per ottimizzare la perfusione. Un cambiamento di colore completo ad un giallo chiaro al colore marrone chiaro indica un buon perfusione. </li><li> Cambiare il liquido di perfusione alla digestione-Soluzione contenente collagenasi P (Tabella 1). </li><li> Riorganizzare la configurazione (Figura 1A) per la fase di digestione. Pertanto eseguire un flusso circolare di digestione-Solution di figura 1B per un massimo di 15 min. Nota: E &#39;fondamentale per fermare immediatamente la perfusione quando il campione di tessuto epatico è sufficientemente digerito. Una buona digestione può essere osservato, quando il tessuto non mostra alcun segno di elasticità valutata mediante manutenzione di deformazioni capsula, quando viene spinto con una spatola. </li></ol> 4. L&#39;isolamento degli epatociti (1 ora) <ol><li> Turna la pompa peristaltica off e collocare il campione di tessuto epatico in un piatto di vetro. Risciacquare l&#39;esterno del campione di tessuto con ghiaccio freddo Stop-Solution (Tabella 1). Rimuovere le cannule dal campione di tessuto epatico. Utilizzare un bisturi per aprire il campione di tessuto epatico, incidendo in mezzo alla zona in cui erano attaccate le cannule. Mantenere la cura che la capsula Glisson&#39;s rimane intatto. </li><li> Risciacquare l&#39;interno del campione di tessuto e quindi coprire l&#39;intera campione di tessuto con ghiaccio freddo Stop-Solution. Agitare il tessuto delicatamente per rilasciare le cellule di tessuto. </li><li> Raccogliere la sospensione cellulare e filtrare attraverso un imbuto di sguardo (imbuto di plastica rivestito con garza compressa) in 50 ml tubi di plastica. Aggiungere più Stop-Solution al campione di tessuto epatico fino consumato un volume finale di 500 ml. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Raccogliere il surnatante per l&#39;isolamento delle cellule non parenchimali in seguito. Lavare il pellet di cellule con PBS (Figura 2A). </li><li> Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Raccogliere il surnatante e risospendere il pellet in mezzo epatociti incubazione (Tabella 2, Figura 2B). </li><li> Determinare il numero di cellulare e la vitalità nella sospensione cellulare risultante utilizzando trypan colorazione blu. Contare le cellule vive e morte in una camera di conta Neubauer. Calcolare il numero di cellule, la vitalità e la resa dei PHH utilizzando le formule seguenti. rendimento (cellule contate) = cellule contate x fattore di diluizione x volume di sospensione cellulare (ml) x 10.000 Resa (epatociti / (g fegato campione di tessuto)) = (resa (epatociti / (supporti ml)) x volume di sospensione cellulare (ml)) / (peso del campione di tessuto epatico (g)) redditività (%) = 100% x (numero di cellule vive) / (numero totale di cellule) </li></ol> 5. Purificazione degli epatociti (1 ora) Nota: Si raccomanda Questa fase di purificazione, la vitalitàè inferiore al 70%. <ol><li> Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio. Preparare un gradiente di densità 25% mescolando 5 ml di soluzione gradiente di densità e 15 ml di PBS per centrifugazione in gradiente di densità. </li><li> Mettere un massimo di 50 celle Mio totale fuori dalla ricca sospensione cellulare di epatociti lentamente e sopra dello strato gradiente di densità 25% per garantire che una chiara separazione dei due strati è ottenuto (Figura 2C). Mettere attentamente le valvole nella centrifuga e centrifugare a 1250 xg, 20 min, 4 ° C senza freno (Figura 2D). </li><li> Aspirare il restante sospensione cellulare e le cellule morte della interfase. A seconda del contenuto di grasso uno potrebbe anche aspirare il gradiente-soluzione densità. Nota: PHH con basso contenuto lipidico formare un pellet denso e il gradiente di densità può essere aspirato completamente. PHH con alto contenuto lipidico formare un pellet più diffuso e un sacco di cellule vitali possono rimanere nella soluzione gradiente di densità sopra il pellet. </li><li>Risospendere il pellet di epatociti con PBS e centrifugare di nuovo a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Si riuniscono gli pellets, sciacquare con PBS e risospendere purificata PHH in mezzo Hepatocyte incubazione. Effettuare il conteggio delle cellule, come descritto al punto 4.6. </li></ol> 6. La coltivazione di epatociti <ol><li> Preparare i piatti di coltura cellulare per la semina di PHH da rivestimento con una matrice extracellulare, per il collagene coda esempio di ratto (collagene di tipo I). Preparare il collagene coda di ratto secondo il protocollo stabilito da Rajan et al. 17 </li><li> Diluire la coda di topo collagene Soluzione 1: 200 in PBS. Trasferire 100 microlitri / cm 2 di ratto soluzione di collagene di coda nei piatti di coltura, avendo cura che l&#39;intera superficie è coperta. Incubare le plastiche di coltura cellulare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione rimanente collagene coda di topo. </li><li> Seme di 15 x 10 4 epatociti / cm 2 a mezzo di epatociti di incubazione sulla cultura dishes rivestito con collagene coda di topo. Coltivare le cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% CO 2 per almeno 4 ore. Dopo 4 ore epatociti hanno aderito e il mezzo può essere modificato. </li><li> Eseguire ricerche a seconda del setup sperimentale. Si consiglia un tempo di coltura 48 h per permettere alle cellule di recuperare dal processo di isolamento. </li></ol> 7. L&#39;isolamento delle cellule epatiche non parenchimali (1,5-2 ore) <ol><li> Centrifugare il supernatante raccolto (passo 4.5 e 4.6) a 72 xg, 5 min, 4 ° C per eliminare gli eritrociti e epatociti. Pool i supernatanti e centrifugare due volte per ottenere due pellet cellulari: 300 xg, 5 min, 4 ° C per la sedimentazione di HSC, LEC e parzialmente KC e 650 xg, 7 min, 4 ° C per sedimentazione dei rimanenti KC. </li><li> Pool entrambi i pellet e li ri-sospendere in HBSS. Preparare un 25% e una densità del 50% gradienti di miscelazione soluzione gradiente di densità e PBS per gradiente di densità centrifugation (25% soluzione gradiente di densità: 5 soluzione gradiente di densità e ml 15 ml PBS, soluzione al 50% in gradiente di densità: soluzione gradiente di 10 ml di densità e 10 ml di PBS, vedere Figura 2). Posizionare la soluzione gradiente di densità 25% attenzione sulla parte superiore dello strato soluzione gradiente di densità 50%. </li><li> Mettere la sospensione NPC cura e lentamente sulla parte superiore dello strato soluzione gradiente di densità 25% in modo da ottenere una netta separazione dei due strati. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare sul gradiente di densità a 1.800 xg, 20 min, 4 ° C senza freno (Figura 2.2). </li><li> Aspirare le cellule morte e detriti cellulari dal livello più alto. L&#39;NPC si trovano nella interfase tra lo strato gradiente di densità 25% e 50% (Figura 2). Raccogliere NPC, lavarli con HBSS e centrifugare la sospensione cellulare applicando la fase di centrifugazione sopra descritta doppia (punto 7.2.). </li></ol> 8. separazione delle cellule di Kupffer (aderenzaSeparazione Step) (1 ora) <ol><li> Eseguire una conta di cellule per la KC nella frazione NPC come descritto al punto 4.6. (Per la comparsa di KC in sospensione vedi Figura 3B). Centrifugare la frazione NPC con la fase di centrifugazione dual descritto sopra (passo 7.2) e risospendere il NPC in Kupffer cellulare semina medio (Tabella 2). </li><li> Seme della frazione contenente KC in serbatoi di plastica coltura cellulare ad una densità di 5 x 10 5 KC / cm 2. Incubare le culture KC per 20 min in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% CO 2. Primaria KC aderire su plastica coltura cellulare entro un breve periodo di tempo (Figura 2.3). </li><li> Raccogliere il surnatante contenente non abbia aderito NPC, che consiste principalmente di LEC e HSC. PISCINA La surnatanti per dopo la separazione di LEC (vedere la sezione 9) e HSC (vedi punto 10). Lavare l&#39;aderente KC con HBSS e coltivare Kupffer coltura cellulare medio (Tabella 2) a 37 ° C, 5% CO2 in un incubatore umidificato. </li></ol> 9. separazione delle cellule endoteliali (1,5 ore) <ol><li> Centrifugare il surnatante raccolto (fase 8.5.) A 300 xg, 5 min, 4 ° C. Lavare il pellet con PBS. Dopo centrifugazione a 300 xg, 5 min, 4 ° C risospendere le cellule in cellule stellato / mezzo di separazione delle cellule endoteliali ed eseguire un conteggio delle cellule per tutte le celle rimanenti come descritto al punto 4.6. </li><li> Risospendere 1 x 10 7 cellule Mio in 1 ml cella stellato / endoteliale mezzo di separazione cellulare, aggiungere 20 ml soluzione bloccante dal MACS-kit e 20 ml delle perline CD31 Micro per immunomarcatura e incubare la sospensione risultante per 15 minuti a 4 ° C di temperatura (Figura 2.4). </li><li> LEC separata da HSC come descritto nel protocollo del produttore di sistema per cell sorting attivato magneticamente MACS (Figura 2.5). Eluire magneticamente mantenuto LEC CD31-positivo e sospenderle in stellato CEll / terreno di coltura di cellule endoteliali (Tabella 2). </li><li> Eseguire cella conta per LEC come descritto al punto 4.6. Seed LEC in una densità di 1,25 x 10 5 cellule / cm 2 in recipienti di coltura delle cellule rivestite di collagene coda di ratto (vedi punto 6.1). Coltivare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li></ol> 10. La separazione delle cellule stellate (0,5 ore) <ol><li> Senza etichetta HSC passare la colonna di separazione durante la procedura MACS. Raccogliere la frazione HSC (vedi punto 9.5, figura 2.5). Effettuare il conteggio delle cellule, come descritto al punto 4.6. </li><li> HSC Seed con una densità di 5 x 10 4 cellule / cm 2 in recipienti di coltura delle cellule rivestite di collagene coda di ratto (vedere il punto 6.1) nel stellato cellulare / terreno di coltura di cellule endoteliali (Tabella 2) e li coltivano a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li></ol><img alt= &quot;Tabella 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; Tabella 1: Perfusione e soluzione di isolamento. <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> Tabella 2: cultura e di isolamento dei media.

<ol><li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , Maywood. (2014).</li>
<li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+and+development+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li>
<li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li>
<li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes%2C+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity%2C+cell+signaling+and+ADME%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li>
<li>Gómez-Lechón, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man%3A+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li>
<li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li>
<li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li>
<li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li>
<li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li>
<li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G. The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussler%2C+AK+%22Strategies+in+Regenerative+Medicine%22">Strategies in Regenerative Medicine</a>. Santin, M. , Springer. New York. 1-38 (2009).</li>
<li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes%2C+Kupffer+cells%2C+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li>
<li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li>
<li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li>
<li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver%3A+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li>
<li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li>
<li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li>
<li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832(2013).</li>
<li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li>
<li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation%2C+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li>
<li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis%3A+results+of+a+2-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Il protocollo pubblicato descrive una tecnica per isolare puro PHH e NPC, cioè KC, HSC e LEC, simultaneamente in alta qualità e purezza dallo stesso campione di tessuto epatico umano. La maggior parte delle pubblicazioni che si occupano di isolamenti cellule del fegato coprono solo una di quelle popolazioni cellulari 18-20 e le procedure di isolamento eseguiti con i tessuti umani sono rari (recensito da Damm et al.) 21. Adattamento dei metodi stabiliti con tessuto animale (ad esempio,<...

tessuto epatico umano è molto complesso e consiste di due diverse entità cellulari, cellule parenchimali e cellule non parenchimali (NPC). cellule epatiche parenchimali includono epatociti e colangiociti. Gli epatociti rappresentano dal 60 al 70% delle cellule del fegato totali e rappresentano la maggior parte delle funzioni epatiche metaboliche, ad esempio, acidi biliari e completano la sintesi fattore, biotrasformazione ed energia metabolismo 2,3. La frazione NPC minore costituisce il 30-40% delle cellule epatiche totali. NPC includono diverse popolazioni di cellule, ovvero cellule di Kupffer (KC), le cellule del fegato endoteliali (LEC) e le cellule stellate epatiche (HSC). Questa frazione cellulare eterogenico gioca un ruolo centrale in processi fisiologici del fegato. Inoltre, NPC partecipare a mediare danno epatico acuto, ad esempio, lesioni indotte dal farmaco fegato (DILI), così come nelle lesioni croniche del fegato, come la cirrosi 4. Negli ultimi anni, hcellule epatiche Uman sono diventati sempre più essenziale nella ricerca e nello sviluppo di test anti-droga, lo sviluppo di farmaci e l&#39;identificazione di nuove vie biochimiche nelle malattie del fegato. Per i test in vitro monocolture PHH sono ancora considerati come il &quot;gold standard&quot; 5. La principale limitazione degli attuali modelli di fegato omotipiche è dedifferentiation e perdita di funzione degli epatociti nel giro di pochi giorni 4. La creazione di tecniche (3D) cultura 3-dimensionale ha dimostrato che questi limiti possono essere compensate 4,6. Tuttavia, anche le moderne tecniche di coltura 3D non sono in grado di visualizzare tutte le modalità epatotossici di azioni 7. Manca popolazioni NPC nei modelli esistenti in vitro sono discussi come possibile motivo di questa discrepanza per la situazione in vivo. È stato dimostrato che la comunicazione cellula-cellula tra le diverse popolazioni cellulari fegato gioca un ruolo centrale nella omeostasi fisiologica, ma anche in pathophysiologic elabora 8. Pertanto l&#39;attenzione scientifica si concentra sempre di più sulla NPC e le loro interazioni cellula-cellula. Il loro utilizzo mirato in co-coltura e sistemi di ingegneria tessutale potrebbe essere una soluzione per la forte domanda di modelli di fegato in vitro 8,9 che sono il più vicino alla situazione in vivo possibile. Attualmente la sfida principale è lo sviluppo di un modello di fegato di co-cultura umana standardizzata, che contiene porzioni ben definite di PHH e NPC. Di conseguenza, tecniche di isolamento per le cellule del fegato molto eterogenei sono necessari e quelli devono essere ottimizzate per ottenere popolazioni di cellule pure. Mentre esistono protocolli standardizzati per l&#39;isolamento PHH 10, l&#39;isolamento standardizzato di NPC umano è ancora in fase di sviluppo. Protocolli di isolamento NPC più pubblicati sono basati su esperimenti con le cellule non umane 11,12. Solo pochi pubblicazioni descrivono il processo di isolamento della NPC umana e la maggior parte coprono soloMetodi per l&#39;isolamento di una singola cellula tipo 11-16. Le caratteristiche cellulari più importanti che sono stati sfruttati per la separazione cellulare sono dimensione, densità, comportamento di attaccamento, e l&#39;espressione di proteine ​​di superficie. Sulla base di queste caratteristiche abbiamo sviluppato un protocollo semplificato per isolare PHH, KC, LEC e HSC, che è stato pubblicato in precedenza in Biologia e Medicina Sperimentale 1. A causa del grande interesse in questa tecnica, lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo più dettagliata del processo di isolamento delle cellule epatiche tra cui un video, che consentirà riproducendo la tecnica più facilmente. Il protocollo include anche i metodi di controllo di qualità per la valutazione della resa e la vitalità, nonché per l&#39;identificazione e la purezza valutazione con immunostainings specifici.

<table><tbody><tr><td>General Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Pipette Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopio Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urine Becher</td>, <td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>perfusore siringa 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>Bottle Top Filter</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Polipropilene Tubo conico</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Provetta conica in polipropilene da 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td> Pipette sierologiche <td>a 24 pozzetti</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td> puntali per pipette <td>da 25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td></td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &; l, 200 & micro; l, 1.000 &micro; l</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Isolation Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>water bath</td><td></td> Pompa peristaltica Lauda <td></td><td></td></tr> circolazione <tr><td></td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td> termostato</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scale fini</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; Imbuto chner</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>imbuto</td><td></td><td></td><td></td>in plastica</tr> cannule <tr><td>per tubi</td><td></td><td></td><td></td>in silicone</tr><tr><td>con punte</td><td></td><td></td><td></td>di oliva</tr><tr><td>piatto in</td><td></td><td></td><td></td>vetro</tr><tr><td>pinza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td><td>Feather</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Neubauer</td><td>Sollevatore di cellule per travaglio</td><td></td><td></td>ottico</tr><tr><td></td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telo chirurgico</td><td>Charit&eacute; Università tsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>impacco</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>guanti chirurgici sterili</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>Colla per tessuti</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>flacone di vetro</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll soluzione</td> <td>di separazioneBiochrom</td><td>L6145</td><td>Densità 1,124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>senza Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49.361.000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Basso contenuto di glucosio (1 g/L) (senza L-glutammina)</td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES 1&nbsp; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>senza L-Glutammina</td></tr><tr><td>Piruvato di Sodio</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypan Blue Soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4%</td></tr><tr><td>William' s E&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>con GlutaMAX&trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>Insulina umana</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-acetil cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Apparecchiature per immunocolorazioni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R& D Systems, USA</td><td></td><td>monoclonale</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>policlonale</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>monoclonale</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoclonale</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoclonale</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-PE anti-topo di capra</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide 4%</td><td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Accanto epatociti parenchimali, il fegato è costituito da cellule non parenchimali (NPC) vale a dire cellule di Kupffer (KC), fegato le cellule endoteliali (LEC) e le cellule stellate epatiche (HSC). Bidimensionale (2D) cultura di primaria epatociti umani (PHH) è ancora considerato come il &quot;gold standard&quot; per i test in vitro del metabolismo dei farmaci e di epatotossicità. È ben noto che la monocultura 2D PHH soffre dedifferentiation e perdita di funzione. Recentemente è stato dimostrato che epatica NPC giocano un ruolo centrale nel fegato (patologica) fisiologia e il mantenimento delle funzioni PHH. La ricerca attuale si concentra sulla ricostruzione di vivo dell&#39;architettura tessuto da 3D-e co-coltura modelli di superare i limiti di monocolture 2D. In precedenza abbiamo pubblicato un metodo per isolare le cellule di fegato umano e studiato l&#39;idoneità di queste cellule per il loro impiego in colture cellulari in Biologia e Medicina Sperimentale 1. Sulla base del vasto interesse in questo technique lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo più dettagliata del processo di isolamento delle cellule epatiche tra cui un video, che permetterà un facile riproduzione di questa tecnica. cellule epatiche umane sono state isolate da campioni di tessuto di fegato umano di interventi chirurgici da un EGTA / collagenasi tecnica P perfusione in due fasi. PHH stati separati dal NPC da una centrifugazione iniziale a 50 x g. Densità fasi di centrifugazione a gradiente sono stati usati per la rimozione delle cellule morte. popolazioni di cellule individuali del fegato sono stati isolati dalla frazione arricchita NPC utilizzando le proprietà cellulari specifici e le procedure di separazione delle cellule. Accanto l&#39;isolamento PHH siamo stati in grado di separare KC, LEC e HSC per ulteriori coltivazione. Nel loro insieme, il protocollo presentato permette l&#39;isolamento di PHH e NPC in alta qualità e la quantità di campione di tessuto da un donatore. L&#39;accesso alle popolazioni di cellule del fegato purificati potrebbe consentire la creazione di in vivo come Li umanamodelli ver.

La separazione in una frazione parenchimale e non parenchimali, con densità centrifugazione in gradiente come una procedura di pulizia combinato con l&#39;uso di proprietà di aderenza e MACS porta a successo isolamento PHH e NPC. PHH e NPC possono essere isolati in alta qualità e quantità. Figura 1 mostra la configurazione rappresentante delle attrezzature per la perfusione del fegato e la digestione. 10% FCS è stato aggiunto alla collagenasi P contenente perfusione - so...

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epatologia e della tossicologia e offrirci l'opportunità di sviluppare nuovi modelli di co-coltura in vitro e fegati ingegnerizzati. Il vantaggio di questa nuova tecnica consiste nell'isolare tutte le popolazioni cellulari epatiche dallo stesso donatore e dallo stesso piccolo frammento di tessuto epatico. Per iniziare questa procedura, pesare il tessuto epatico appena dissezionato in condizioni sterili e posizionare il campione di tessuto epatico all'interno della cappa a flusso laminare.Quindi rimuovere il sangue dalla superficie del campione di tessuto. Successivamente, lavare le cannule utilizzando la soluzione di perfusione 1X soluzione uno. Utilizzare la colla per tessuti per fissare le estremità delle cannule nei vasi sanguigni più grandi.Successivamente, verificare la perfusione e controllare la presenza di perdite dalle cannule. Chiudere quindi tutti i vasi sanguigni da cui fuoriesce una soluzione di perfusione chiara 1X utilizzando colla tissutale. Successivamente, posizionare il campione di tessuto epatico cannullato nel becher di Buchner.Quindi, impostare la portata della pompa peristaltica tra 7,5 e 14,6 millilitri al minuto, in base al numero di cannule utilizzate e alla resistenza del tessuto epatico. Perfundere il tessuto fino a quando non viene eliminato completamente il sangue, per almeno 20 minuti e al massimo per 30 minuti. In alcuni casi, potrebbe essere necessario occludere una delle cannule con pinze di plastica o aumentare la pressione interna di un'area premendo delicatamente contro la capsula epatica con una spatola, al fine di ottimizzare la perfusione.Un completo cambiamento di colore da rosso brunastro a marrone chiaro o giallo chiaro indica una buona perfusione. Successivamente, sostituire il liquido di perfusione con la soluzione di digestione contenente collagenasi P. Poi, riorganizzare l'apparato per la fase di digestione. In seguito, eseguire un flusso circolare della soluzione di digestione per un massimo di 15 minuti.Interrompere periodicamente la perfusione e verificare il grado di digestione. È essenziale interrompere immediatamente la perfusione con la soluzione digestiva quando il campione di tessuto epatico è sufficientemente digerito. Rimuovere il fegato dal dispositivo quando è pronto e collocarlo in una capsula di vetro.Risciacquare l'esterno del campione di tessuto con la Soluzione di Arresto fredda di ghiaccio. Rimuovere le cannule dal campione di tessuto epatico. Successivamente, utilizzare un bisturi per aprire il campione di tessuto epatico praticando un'incisione al centro della zona in cui erano applicate le cannule, assicurandosi che la capsula di Glisson rimanga integra.Risciacquare l'interno del campione di tessuto, quindi coprire completamente il campione di tessuto con la Soluzione di Arresto. Successivamente, agitare delicatamente il tessuto per favorire il rilascio delle cellule. Poi, raccogliere la sospensione cellulare e filtrarla attraverso un imbuto con garza in 10 tubi di plastica da 50 millilitri.Aggiungere ulteriore Soluzione di Arresto al campione di tessuto epatico fino a raggiungere un volume finale di 500 millilitri. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare, raccogliere il soprannatante per l'isolamento successivo delle NPC e raccogliere i pellet cellulari in provette di plastica da 250 millilitri. In seguito, lavare i pellet cellulari con PBS.Per fare ciò, centrifugare la sospensione cellulare. Raccogliere il soprannatante, raggruppare i pellet e risospendere il pellet nel mezzo di incubazione per epatociti. Quindi, determinare il numero di cellule e la vitalità nella sospensione cellulare risultante mediante colorazione con blu di tripano.Per isolare le cellule epatiche non parenchimali, centrifugare il sopranatante raccolto per eliminare gli eritrociti e gli epatociti rimanenti. Raccogliere i sopranatanti e centrifugarli due volte per ottenere i pellet cellulari destinati alla sedimentazione di HCS, LEC, parzialmente KC e i KC rimanenti. Successivamente, risospendere i pellet in HBSS. Quindi, preparare un gradiente di densità al 25% e uno al 50% mescolando la soluzione per gradiente di densità e PBS per la centrifugazione a gradiente di densità.Posizionare con attenzione la soluzione al 25% di gradiente di densità sopra lo strato di soluzione al 50% di gradiente di densità. Successivamente, aggiungere con attenzione e lentamente la sospensione di NPC sopra lo strato di soluzione al 25% di gradiente di densità per ottenere una chiara separazione tra i due strati. Centrifugare la sospensione cellulare sul gradiente di densità senza frenata.Gli NPC si trovano nell'interfase tra i livelli del gradiente di densità al 25% e al 50%. Aspirare le cellule morte e i detriti cellulari dal livello più superficiale e raccogliere con attenzione l'interfase. Dopo la doppia centrifugazione, eseguire un conteggio cellulare per la frazione di KC e per quella di MPC.Quindi, centrifugare la frazione di NPC con il passaggio di doppia centrifugazione precedentemente descritto e risospendere il NPC nel mezzo di semina per cellule di Kupffer. Seminare la frazione contenente le KC su vasi di coltura in plastica a una densità di cinque volte 10 alla 5a KC per centimetro quadrato. Incubare le colture di KC per 20 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.I KC primari dovrebbero aderire alle plastiche per colture cellulari entro un breve periodo di tempo. Successivamente, raccogliere il sopranatante contenente le NPC non aderenti, costituite principalmente da LEC e HSC. Per separare le LEC dagli HSC, iniziare con una centrifugazione del sopranatante.Quindi, lavare il pellet con PBS. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere le cellule nel mezzo di separazione delle cellule stellate e delle cellule endoteliali ed eseguire un conteggio cellulare per tutte le cellule rimanenti. Successivamente, risospendere 10 milioni di cellule in un millilitro di mezzo di separazione delle cellule stellate e delle cellule endoteliali.Quindi, aggiungere 20 microlitri di soluzione di blocco del kit MAX e 20 microlitri di microperle CD31 per l'etichettatura immunoistochimica e incubare la sospensione risultante per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, separare le LEC dalle HSC come descritto nel protocollo del produttore per il sistema di separazione cellulare attivato magneticamente max e raccogliere la frazione di HSC. Eluire le LEC positive per CD31 trattenute magneticamente e sospenderle in mezzo di coltura cellulare endoteliale per cellule stellate.Qui, queste immagini mostrano le diverse popolazioni di cellule epatiche isolate immediatamente dopo il processo di isolamento, in vista al microscopio a contrasto di fase. Questo insieme di immagini presenta le cellule isolate e coltivate dopo 24 ore di coltura. Viene mostrata la caratterizzazione mediante immunofluorescenza delle diverse frazioni cellulari.I PHH hanno mostrato segnali positivi per il marcatore degli epatociti CK18 a 24 ore dall'isolamento, le KC sono risultate positive per il marcatore CD68 a 24 ore dall'isolamento, le LEC hanno mostrato segnali positivi per la vimentina a 72 ore dall'isolamento e le HSC sono risultate positive per la GFAP a 72 ore dall'isolamento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che un isolamento riuscito dipende da una digestione ottimale del campione di tessuto epatico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come controllare la digestione e di come eseguire la separazione su gradiente di densità, che sono i passaggi critici di questa procedura.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca medica per esplorare le funzioni epatiche e le malattie in colture cellulari in vitro appena create e in modelli di fegato ingegnerizzati a livello tissutale.

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Epatociti primari costituirà un valido strumento per valutare le funzioni biochimiche, molecolari e metaboliche in un sistema fisiologicamente rilevante sperimentale. Noi descriviamo un protocollo affidabile per la perfusione di fegato di ratto in situ, che genera costantemente epatociti vitali fino to1.0 ×...

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

A due fasi procedura di perfusione con collagenasi modificata per l'isolamento di epatociti umani è descritta. Questo metodo può essere applicato anche ad altri fegati mammiferi. Gli epatociti isolati sono disponibili in alta resa e redditività, che li rende un modello adatto per la ricerca scientifica in settori quali la rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l'analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

L&#39;isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento degli epatociti primari del topo sano e funzionale. Istruzioni per la rilevazione sintesi epatica delle proteine nascenti dal substrato di etichettatura non radioattivo erano fornite per aiutarvi a comprendere i meccanismi alla base della sintesi proteica nel contesto dell'omeostasi del metabolismo energetico nel fegato.

Isolamento degli epatociti primari del topo per l'analisi di sintesi della proteina nascente dal metodo di etichettatura Non radioattivo L-azidohomoalanine

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire una guida dettagliata per eseguire esperimenti di 3D "fegato-on-a-chip" infezione con virus dell'epatite B.

"Fegato-on-a-Chip" colture di epatociti primari e cellule di Kupffer per infezione da Virus dell'epatite B

Gli epatociti primari sono uno strumento prezioso per studiare la risposta epatica e il metabolismo in vitro. Utilizzando reagenti disponibili in commercio, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari del topo.

Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

Questo protocollo descrive l'uso di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura integrato da monitoraggio in tempo reale e un sistema di allarme per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per migliorare la coerenza nella vitalità, nella resa e nella funzionalità degli epatociti primari isolati di ratto.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.

Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Impara un protocollo per isolare epatociti umani primari e popolazioni di cellule non-parenchimali dal medesimo donatore. Questa tecnica garantisce alta resa e vitalità cellulare per modelli epatici in vitro e ingegneria tissutale.

Protocollo per lisolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali (Video) | JoVE Journal

Protocollo per l'isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

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