Protocollo per l'isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epatologia e della tossicologia e offrirci l'opportunità di sviluppare nuovi modelli di co-coltura in vitro e di fegato ingegnerizzato tissutale. Il vantaggio di questa nuova tecnica è quello di isolare tutte le popolazioni di cellule epatiche dallo stesso donatore e dallo stesso piccolo pezzo di tessuto epatico. Per iniziare questa procedura, pesare il tessuto epatico appena sezionato in condizioni di stile e posizionare il campione di tessuto epatico nella cappa del flusso d'aria laminare.

Quindi pulire il sangue dalla superficie del campione di tessuto. Quindi, sciacquare le cannule utilizzando la soluzione di perfusione 1X. Usa la colla per tessuti per fissare le olive delle cannule nei vasi sanguigni più grandi.

Quindi, testare la perfusione e verificare la presenza di perdite delle cannule. Successivamente, chiudere tutti i vasi sanguigni che perdono una soluzione di perfusione 1X trasparente con colla per tessuti. Successivamente, posizionare il campione di tessuto epatico cannulato nell'imbuto di Buchner.

Quindi, impostare la portata della pompa peristaltica tra 7,5 e 14,6 millilitri al minuto, a seconda del numero di cannule utilizzate e della resistenza del tessuto epatico. Perfondere il tessuto fino a quando l'intero sangue non viene espulso per almeno 20 minuti e per un massimo di 30 minuti. In alcuni casi, può essere necessario bloccare una delle cannule con pinze di plastica o aumentare la pressione interna di un'area premendo delicatamente contro la capsula epatica con una spatola per ottimizzare la perfusione.

Un completo cambiamento di colore dal rosso brunastro al marrone chiaro o al giallo chiaro indica una buona perfusione. Successivamente, cambiare il fluido di perfusione in una soluzione digestiva contenente collagenasi P.Quindi, riorganizzare la configurazione per la fase di digestione. Successivamente, eseguire un flusso circolare di soluzione digestiva per un massimo di 15 minuti.

Interrompere periodicamente la perfusione e controllare il grado di digestione. È essenziale che la perfusione con la soluzione digestiva venga interrotta immediatamente quando il campione di tessuto epatico viene digerito a sufficienza. Estrarre il fegato dal dispositivo quando è pronto e metterlo in un piatto di vetro.

Sciacquare l'esterno del campione di tessuto con una soluzione Stop ghiacciata. Rimuovere le cannule dal campione di tessuto epatico. Quindi, utilizzare un bisturi per aprire il campione di tessuto epatico incidendo il centro dell'area in cui erano attaccate le cannule e assicurarsi che la capsula di Glisson rimanga intatta.

Sciacquare l'interno del campione di tessuto e quindi coprire l'intero campione di tessuto con la soluzione Stop. Quindi, scuotere delicatamente il tessuto per liberare le cellule da esso. Quindi, raccogliere la sospensione cellulare e filtrarla attraverso un imbuto di garza in 10 provette di plastica da 50 millilitri.

Aggiungere altra soluzione Stop al campione di tessuto epatico fino a consumare un volume finale di 500 millilitri. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare, raccogliere il surnatante per l'isolamento NPC in un secondo momento e raccogliere i pellet cellulari in provette di plastica da 250 millilitri. Successivamente, lavare i pellet delle celle con PBS.

Per questo, centrifugare la sospensione cellulare. Raccogliere il surnatante, raccogliere i pellet e risospendere il pellet nel terreno di incubazione degli epatociti. Quindi, determinare il numero di cellule e la vitalità nella sospensione cellulare risultante utilizzando la colorazione con blu di tripano.

Per isolare le cellule epatiche non parenchimali, centrifugare il surnatante raccolto per eliminare gli eritrociti e gli epatociti rimanenti. Raccogliere i surnatanti e centrifugarli due volte per ottenere i pellet cellulari per la sedimentazione di HCS, LEC, in parte KC e il KC rimanente. Quindi, risospendere i pellet in HBSS. Quindi, preparare un gradiente di densità del 25% e uno del 50% mescolando la soluzione del gradiente di densità e il PBS per la centrifugazione del gradiente di densità.

Posizionare con cura la soluzione del gradiente di densità al 25% sopra lo strato della soluzione del gradiente di densità al 50%. Successivamente, posizionare la sospensione NPC con cura e lentamente sopra lo strato di soluzione a gradiente di densità del 25% per ottenere una netta separazione di entrambi gli strati. Centrifugare la sospensione cellulare sul gradiente di densità senza interruzioni.

Gli NPC si trovano nell'interfase tra gli strati di gradiente di densità del 25% e del 50%. Aspirare le cellule morte e i detriti cellulari dallo strato più superficiale e raccogliere accuratamente l'interfase. Dopo la doppia centrifugazione, eseguire una conta cellulare per la frazione KC e MPC.

Quindi, centrifugare la frazione NPC con la doppia fase di centrifugazione precedentemente descritta e risospendere l'NPC nel terreno di semina Kupffer Cell. Seminare la frazione contenente KC sui recipienti di coltura cellulare di plastica a una densità di cinque volte 10 fino al 5° KC per centimetro quadrato. Incubare le colture KC per 20 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica.

Il KC primario dovrebbe aderire alle plastiche per colture cellulari entro un breve periodo di tempo. Quindi, raccogli il surnatante contenente l'NPC non aderente costituito principalmente da LEC e HSC. Per separare la LEC dall'HSC, iniziare con una centrifugazione del surnatante.

Quindi, lavare il pellet con PBS. Dopo la seconda centrifugazione, sospenderle nuovamente nel mezzo di separazione delle cellule endoteliali delle cellule stellate ed eseguire una conta delle cellule per tutte le cellule rimanenti. Successivamente, risospendere 10 milioni di cellule in un millilitro di mezzo di separazione delle cellule endoteliali delle cellule stellate.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di soluzione bloccante dal kit MAX e 20 microlitri delle microsfere CD31 per l'immuno-marcatura e incubare la sospensione risultante per 15 minuti a una temperatura di quattro gradi Celsius. Successivamente, separare LEC da HSC come descritto nel protocollo del produttore per il sistema di smistamento delle celle attivato magneticamente max e raccogliere la frazione HSC. Eluire le LEC CD31 positive trattenute magneticamente e sospenderle in un terreno di coltura cellulare endoteliale a cellule stellate.

Qui, queste immagini mostrano le diverse popolazioni di cellule epatiche isolate subito dopo il processo di isolamento in visualizzazione al microscopio a contrasto di fase. Questa serie di immagini presenta le cellule isolate e coltivate dopo 24 ore di coltivazione. Qui viene mostrata la caratterizzazione basata sull'immunofluorescenza di diverse frazioni cellulari.

PHH ha mostrato segnali positivi per il marcatore degli epatociti CK18 24 ore dopo l'isolamento, KC erano positivi per il marcatore CD68 24 ore dopo l'isolamento, LEC ha mostrato segnali positivi per la vimentina 72 ore dopo l'isolamento e HSC erano positivi per GFAP 72 ore dopo l'isolamento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che un isolamento di successo dipende da una digestione ottimale del campione di tessuto epatico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come controllare la digestione e come eseguire la separazione del gradiente di densità, che sono i passaggi critici di questa procedura.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca medica per esplorare le funzioni e le malattie epatiche in colture cellulari in vitro di nuova creazione e modelli di fegato ingegnerizzati tissutali.