Protocollo per l'isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epatologia e della tossicologia e offrirci l'opportunità di sviluppare nuovi modelli di co-coltura in vitro e fegati ingegnerizzati. Il vantaggio di questa nuova tecnica consiste nell'isolare tutte le popolazioni cellulari epatiche dallo stesso donatore e dallo stesso piccolo frammento di tessuto epatico. Per iniziare questa procedura, pesare il tessuto epatico appena dissezionato in condizioni sterili e posizionare il campione di tessuto epatico all'interno della cappa a flusso laminare.

Quindi rimuovere il sangue dalla superficie del campione di tessuto. Successivamente, lavare le cannule utilizzando la soluzione di perfusione 1X soluzione uno. Utilizzare la colla per tessuti per fissare le estremità delle cannule nei vasi sanguigni più grandi.

Successivamente, verificare la perfusione e controllare la presenza di perdite dalle cannule. Chiudere quindi tutti i vasi sanguigni da cui fuoriesce una soluzione di perfusione chiara 1X utilizzando colla tissutale. Successivamente, posizionare il campione di tessuto epatico cannullato nel becher di Buchner.

Quindi, impostare la portata della pompa peristaltica tra 7,5 e 14,6 millilitri al minuto, in base al numero di cannule utilizzate e alla resistenza del tessuto epatico. Perfundere il tessuto fino a quando non viene eliminato completamente il sangue, per almeno 20 minuti e al massimo per 30 minuti. In alcuni casi, potrebbe essere necessario occludere una delle cannule con pinze di plastica o aumentare la pressione interna di un'area premendo delicatamente contro la capsula epatica con una spatola, al fine di ottimizzare la perfusione.

Un completo cambiamento di colore da rosso brunastro a marrone chiaro o giallo chiaro indica una buona perfusione. Successivamente, sostituire il liquido di perfusione con la soluzione di digestione contenente collagenasi P. Poi, riorganizzare l'apparato per la fase di digestione. In seguito, eseguire un flusso circolare della soluzione di digestione per un massimo di 15 minuti.

Interrompere periodicamente la perfusione e verificare il grado di digestione. È essenziale interrompere immediatamente la perfusione con la soluzione digestiva quando il campione di tessuto epatico è sufficientemente digerito. Rimuovere il fegato dal dispositivo quando è pronto e collocarlo in una capsula di vetro.

Risciacquare l'esterno del campione di tessuto con la Soluzione di Arresto fredda di ghiaccio. Rimuovere le cannule dal campione di tessuto epatico. Successivamente, utilizzare un bisturi per aprire il campione di tessuto epatico praticando un'incisione al centro della zona in cui erano applicate le cannule, assicurandosi che la capsula di Glisson rimanga integra.

Risciacquare l'interno del campione di tessuto, quindi coprire completamente il campione di tessuto con la Soluzione di Arresto. Successivamente, agitare delicatamente il tessuto per favorire il rilascio delle cellule. Poi, raccogliere la sospensione cellulare e filtrarla attraverso un imbuto con garza in 10 tubi di plastica da 50 millilitri.

Aggiungere ulteriore Soluzione di Arresto al campione di tessuto epatico fino a raggiungere un volume finale di 500 millilitri. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare, raccogliere il soprannatante per l'isolamento successivo delle NPC e raccogliere i pellet cellulari in provette di plastica da 250 millilitri. In seguito, lavare i pellet cellulari con PBS.

Per fare ciò, centrifugare la sospensione cellulare. Raccogliere il soprannatante, raggruppare i pellet e risospendere il pellet nel mezzo di incubazione per epatociti. Quindi, determinare il numero di cellule e la vitalità nella sospensione cellulare risultante mediante colorazione con blu di tripano.

Per isolare le cellule epatiche non parenchimali, centrifugare il sopranatante raccolto per eliminare gli eritrociti e gli epatociti rimanenti. Raccogliere i sopranatanti e centrifugarli due volte per ottenere i pellet cellulari destinati alla sedimentazione di HCS, LEC, parzialmente KC e i KC rimanenti. Successivamente, risospendere i pellet in HBSS. Quindi, preparare un gradiente di densità al 25% e uno al 50% mescolando la soluzione per gradiente di densità e PBS per la centrifugazione a gradiente di densità.

Posizionare con attenzione la soluzione al 25% di gradiente di densità sopra lo strato di soluzione al 50% di gradiente di densità. Successivamente, aggiungere con attenzione e lentamente la sospensione di NPC sopra lo strato di soluzione al 25% di gradiente di densità per ottenere una chiara separazione tra i due strati. Centrifugare la sospensione cellulare sul gradiente di densità senza frenata.

Gli NPC si trovano nell'interfase tra i livelli del gradiente di densità al 25% e al 50%. Aspirare le cellule morte e i detriti cellulari dal livello più superficiale e raccogliere con attenzione l'interfase. Dopo la doppia centrifugazione, eseguire un conteggio cellulare per la frazione di KC e per quella di MPC.

Quindi, centrifugare la frazione di NPC con il passaggio di doppia centrifugazione precedentemente descritto e risospendere il NPC nel mezzo di semina per cellule di Kupffer. Seminare la frazione contenente le KC su vasi di coltura in plastica a una densità di cinque volte 10 alla 5a KC per centimetro quadrato. Incubare le colture di KC per 20 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

I KC primari dovrebbero aderire alle plastiche per colture cellulari entro un breve periodo di tempo. Successivamente, raccogliere il sopranatante contenente le NPC non aderenti, costituite principalmente da LEC e HSC. Per separare le LEC dagli HSC, iniziare con una centrifugazione del sopranatante.

Quindi, lavare il pellet con PBS. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere le cellule nel mezzo di separazione delle cellule stellate e delle cellule endoteliali ed eseguire un conteggio cellulare per tutte le cellule rimanenti. Successivamente, risospendere 10 milioni di cellule in un millilitro di mezzo di separazione delle cellule stellate e delle cellule endoteliali.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di soluzione di blocco del kit MAX e 20 microlitri di microperle CD31 per l'etichettatura immunoistochimica e incubare la sospensione risultante per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, separare le LEC dalle HSC come descritto nel protocollo del produttore per il sistema di separazione cellulare attivato magneticamente max e raccogliere la frazione di HSC. Eluire le LEC positive per CD31 trattenute magneticamente e sospenderle in mezzo di coltura cellulare endoteliale per cellule stellate.

Qui, queste immagini mostrano le diverse popolazioni di cellule epatiche isolate immediatamente dopo il processo di isolamento, in vista al microscopio a contrasto di fase. Questo insieme di immagini presenta le cellule isolate e coltivate dopo 24 ore di coltura. Viene mostrata la caratterizzazione mediante immunofluorescenza delle diverse frazioni cellulari.

I PHH hanno mostrato segnali positivi per il marcatore degli epatociti CK18 a 24 ore dall'isolamento, le KC sono risultate positive per il marcatore CD68 a 24 ore dall'isolamento, le LEC hanno mostrato segnali positivi per la vimentina a 72 ore dall'isolamento e le HSC sono risultate positive per la GFAP a 72 ore dall'isolamento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che un isolamento riuscito dipende da una digestione ottimale del campione di tessuto epatico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come controllare la digestione e di come eseguire la separazione su gradiente di densità, che sono i passaggi critici di questa procedura.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca medica per esplorare le funzioni epatiche e le malattie in colture cellulari in vitro appena create e in modelli di fegato ingegnerizzati a livello tissutale.