Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sezionare la funzione genica in diversi stadi dell'eritropoiesi terminale utilizzando un sistema di coltura epatica fetale di topo in vitro. Ciò si ottiene purificando prima TER uno eritroblasti epatici fetali di topo 19 negativi da topi embrionali del giorno 13,5 gravidi Come secondo passo, gli eritroblasti purificati vengono trasdotti con virus che codifica CD NA o S-H-R-N-A del gene di interesse per studiare rispettivamente il guadagno o la perdita di funzione del gene. Infine, le cellule TER 19 negative trasdotte vengono coltivate in una delle due diverse condizioni per sezionare la funzione del gene nelle fasi precoci e tardive dell'eritropoiesi terminale.

In definitiva, le diverse cinetiche del differenziamento e dell'enucleazione delle cellule trasdotte possono essere valutate mediante analisi citofluorimetrica. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla osisi atriale del topo. Può essere applicato anche ad altri sistemi HESI come la linfa, la osi e la miosi.

Per purificare gli eritroblasti epatici fetali, iniziare disinfettando l'addome di una topolina gravida eutanasia da E 13 a E 15 con etanolo al 70%. Quindi aprire l'addome con le forbici da dissezione per rimuovere l'utero e posizionare l'utero in PBS. Successivamente, in una cappa per coltura tissutale, utilizzando strumenti sterili, sezionare i feti e posizionarli in PBS.

Quindi tenendo il corpo di un feto alla volta con una pinza. Estrarre delicatamente ogni fegato fetale rosa dal corpo con un'altra pinza. Utilizzare le pinze per pulire i tessuti fibrotici associati da ciascun fegato e quindi posizionare i fegati in PBS fresco contenente il 10% di FBS, distruggere meccanicamente i fegati pipettando il tessuto su e giù alcune volte, quindi filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un colino cellulare da 40 micrometri.

Dopo aver fatto girare le celle per cinque minuti a 800 Gs a quattro gradi Celsius, risospendere il pellet in un millilitro di PBS e FBS. Per purificare il TER uno 19 eritroblasti negativi, bloccare le cellule con IgG di ratto su ghiaccio. Dopo 15 minuti, aggiungere l'anticorpo biotinilato anti TER one 19 alla sospensione cellulare per altri 15 minuti.

Quindi, dopo aver lavato le cellule in PBS e FBS Reese, sospendere le cellule in un millilitro di PBS fresco più FBS e incubare le cellule in 75 microlitri di streptavidina coniugata con particelle magnetiche su ghiaccio. Dopo 10 minuti, portare il volume totale a 2,5 millilitri con PBS più FBS, quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo inferiore rotondo in polipropilene da cinque millilitri. Inserire la provetta in un apparecchio magnetico per la selezione delle cellule, quindi dopo un'altra incubazione di 10 minuti, versare l'eritroblasti negativi TER one 19 non attaccato in una nuova provetta da cinque millilitri dopo un'altra incubazione.

Per rimuovere le cellule TER 19 positive residue, far girare verso il basso gli eritroblasti TER 19 positivi. Risospendere le cellule in un millilitro di PBS contenente FBS e contare le cellule vive con il blu trian per trasdurre il TER purificato una 19 cellule epatiche fetali negative prima le piastra da tre a 500, 000 per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti rivestita di fibrina actina, quindi aggiungere il poly brain a una concentrazione finale di 10 grammi per millilitro per facilitare la trasduzione virale e lo spin fettare le cellule con il virus di interesse da una a 1,5 ore a 800 GS e 37 gradi Celsius. Per valutare la funzione genica nella fase iniziale dell'eritropoiesi terminale, sono state coltivate le cellule trasdotte in terreno di coltura con fattore di cellule staminali libere da EPO per 12 ore.

Quindi, dopo aver centrifugato le cellule, Reese trascorre le cellule in ogni pozzetto con un millilitro di terreno contenente EPO e le coltiva per 24-48 ore. Le cellule possono quindi essere raccolte per ulteriori analisi per testare la funzione genica nella fase avanzata della coltura dell'eritropoiesi terminale. Le cellule trasdotte immediatamente in EPO contenente terreno e raccolgono le cellule dopo 24-48 ore di coltura per ulteriori saggi in questi grafici di densità, la purezza delle cellule eritroidi del fegato fetale prima e dopo lo smistamento delle biglie magnetiche è mostrata per la fase iniziale dell'eritropoiesi terminale.

Dopo la trasduzione virale, le cellule vengono coltivate in terreno di coltura con fattore di cellule staminali libero da EPO per 12 ore. Durante questo periodo, le cellule mantengono il loro stato progenitore. I geni trasdotti sono stati espressi dopo 12 ore.

Nel terreno SCF, non è stata osservata alcuna apoptosi significativa nelle cellule trasdotte GFP durante i due giorni di coltura in terreno contenente EPO in entrambi i metodi. La maggior parte delle cellule progenitrici eritroidi basse CD 71 e 19 mostrano l'induzione del recettore della transferrina e quella TER 19. Entro il secondo giorno, l'enucleazione avviene il secondo giorno, come osservato sull'ospite con TER alto uno eritroblasti alti 19 e sugli ospiti TER bassi uno 19 liti ad alto retico.

È da notare che le cellule immediatamente coltivate in EPO si differenziano e si nucleano più rapidamente rispetto alle cellule coltivate per prime nel terreno del fattore di cellule staminali Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la proliferazione cellulare, i saggi o l'analisi del sangue occidentale, possono essere eseguiti per determinare le risposte cellulari o molecolari dopo l'espressione orale o la regolazione dei geni di interesse.