Name: Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri la dissezione della funzione genica nelle fasi precoci e tardive dell'eritropoiesi terminale utilizzando un sistema di coltura in vitro del fegato fetale di topo.

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Questo studio è stato sostenuto da NIH R00HL102154, e un American Society of Hematology premio studioso P Ji.

Gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. 1 Preparazione del terreno di coltura <ol><li> Preparare la soluzione fibronectina. Aggiungere 1 ml di acqua per una fiala di fibronectina umana (1 mg). Lasciare soluzione nel cappuccio coltura tissutale per 30 minuti senza agitazione. Trasferire il liquido totale di 50 ml di PBS per fare una concentrazione finale di 20 mg / ml e mescolare delicatamente bene. Rendere la soluzione fibronectina fresco prima del rivestimento della piastra (vedi sotto). </li><li> Preparare 50 ml di mezzo privo di Epo (SCF medio). Unire gli ingredienti elencati nella Tabella 1. Il terreno può essere conservato a 4 ° C per 1 mese se fatta fresca. </li><li> Preparare 50 ml di terreno contenente Epo. Unire gli ingredienti elencati nella Tabella 2. Il terreno può essere conservato a 4 ° C per 1 mese se fatta fresca. </li></ol&gt; 2 fibronectina piastra ricoperta <ol><li> Aggiungere 1 ml di soluzione fibronectina a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti (o 0,5 ml a ciascun pozzetto di una piastra ben 12). Lasciare la piastra nella cappa coltura tissutale per 1 ora. </li><li> Sciacquare pozzi con acqua sterile per due volte e asciugare la piastra. </li><li> Avvolgere la piastra e salvare in cella a 4 ° C. </li></ol> 3. Purificazione di fegato fetali eritroblasti NOTA: Utilizzare i fegati fetali da E13 a E15 cronometrati topi in gravidanza (C57BL / 6). Fegati E13.5 sono preferiti per massimizzare il rendimento di CFU-E progenitori. Per ottenere i topi in gravidanza cronometrati, da 6 a 8 settimane di età maschi e femmine di topo sono stati collocati in una gabbia (di solito un maschio con una o due femmine). Tappi vaginali femminili sono state controllate la mattina seguente per determinare se l&#39;accoppiamento ha avuto successo. Il primo giorno di gestazione è stato il giorno dopo che è stata trovata la spina. <ol><li> Preparazione delle cellule totali fetale epatiche <ol><li> Sacrifica il mouse da CO 2 inalazione e dislocazione cervicale. Spruzzare l&#39;addome con etanolo al 70% per la disinfezione. Aprire l&#39;addome con dissezione forbici per rimuovere l&#39;utero. Lavare l&#39;utero in 1x PBS. </li><li> Sezionare i feti in condizioni sterili utilizzando una cappa coltura tissutale e strumenti in autoclave e lavare in PBS 1x. </li><li> Sezionare i fegati fetali da feti. Tenere il corpo del feto con una pinza, tirare delicatamente il fegato fetale (di colore rosa) lontano dal corpo con un altro pinze. Pulire il fegato fetale con le pinze per rimuovere i tessuti fibrotici associati. Mettere tutti i fegati fetali in fresco 1x PBS contenente siero fetale bovino al 10%. </li><li> Meccanicamente interrompere fegati fetali pipettando su e giù. </li><li> Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 40 micron in una provetta da 50 ml. Agglomerare le cellule a 800 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di PBS con 10% FBS (circa 8 E13.5 fegati fetaliper ml). </li></ol></li><li> Purificazione di TER119 eritroblasti negativi <ol><li> Bloccare le cellule con IgG di ratto (0,2 mg / ml) in ghiaccio per 15 min. </li><li> Senza lavaggio o centrifugazione, aggiungere anticorpo anti-TER119 biotinilato alla sospensione cellulare (1 mg / ml). Incubare per 15 min in ghiaccio. </li><li> Lavare in 1x PBS con 10% FBS (1,10) e centrifugare a 800 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS con 10% FBS. </li><li> Aggiungere 75 microlitri streptavidina coniugata con particelle magnetiche e incubare per 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Aggiungere il volume a 2,5 ml con PBS contenente 10% FBS. Trasferire la sospensione cellulare in un 5 ml in polipropilene tondo tubo inferiore. </li><li> Inserire il tubo in un apparato cellulare smistamento magnetico e incubare per 10 min. Cellule positive TER119 potranno allegare al lato del tubo. Gli eritroblasti negativi TER119 distaccato rimarranno in sospensione. </li><li> Versare la sospensione cellulare in un nuovo 5 ml in polipropilene tondo tubo inferiore. </li><li><html> Ripetere i punti 3.2.6 e 3.2.7 per rimuovere le cellule positive TER119 residuo. </li><li> Agglomerare le cellule a 800 xg per 5 min. Aspirare il sopranatante. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS contenente 10% FBS e contare le cellule vive con Trypan Blue. </li></ol></li></ol> 4. trasduzione con virus codifica cDNA o shRNA <ol><li> Piastra le cellule del fegato fetali negativi TER119 purificata a 3-5 x 10 5 / bene in un fibronectina rivestito 12-pozzetti (regolare il numero di cellulare se si utilizza un piatto diverso). </li><li> Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 10 mg / ml per facilitare trasduzione virale. Spin infettare le cellule con lentivirus o retrovirus, cDNA codifica o shRNA, a 800 xg per 1-1,5 ore a 37 ° C. </li></ol> 5. Cultura dei trasdotte TER119 mouse Negativo fetali Fegato eritroblasti <ol><li> Per provare le funzioni del gene nella fase iniziale dell&#39;eritropoiesi terminale (Figura 1 linee tratteggiate).&quot;&gt; </ol.><ol><li><ol. li=""> Coltivare le cellule trasdotte in Epo mezzo privo (SCF media) per 12 ore per consentire l&#39;espressione dei geni e la manutenzione dello stato progenitore trasdotte. </ol.></li><li> Centrifugare le cellule a 800 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di Epo contenenti mezzo in ogni pozzetto di una piastra 12 pozzetti. </li><li> Dopo cultura per 24 o 48 ore, raccogliere le cellule per ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Funzioni del gene Test nella fase tardiva dell&#39;eritropoiesi terminale (Figura 1 linee continue). <ol><li> Coltivare le cellule trasdotte immediatamente in terreno contenente Epo. </li><li> Dopo cultura per 24 o 48 ore, raccogliere le cellule per ulteriori analisi. </li></ol></li></ol> 6. colorazione delle cellule in coltura fetale fegato per analisi citofluorimetrica <ol><li> Lavare e risospendere le cellule in PBS 1x. Harvest 2 x 10 5 cellule in coltura per l&#39;analisi di citometria di flusso. </li><li> Covarele cellule con anticorpi coniugati fluoroforo per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Per testare la differenziazione, utilizzare APC coniugato anti-CD71 e PE coniugato anti-TER119. Per testare enucleazione, utilizzare Hoechst 33342 macchia in aggiunta agli altri anticorpi. </li><li> Lavare le cellule con PBS 1x. Risospendere le cellule in 0,5 ml di PBS contenente 1% FBS e ioduro di propidio (PI) (1 mg / ml) per colorare le cellule morte ed escluderli dall&#39;analisi. </li><li> Comportamento analisi dei flussi cytrometric. Analizzare colore macchiato e non colorati cellule di controllo singole primo per la regolazione e la compensazione del citometro a flusso. </li></ol>

<ol><li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+stem+cell+to+red+cell%3A+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins%2C+RNAs%2C+and+chromatin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li>
<li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+cells+red%3A+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li>
<li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis%3A+integrins+in+red+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li>
<li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li>
<li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li>
<li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li>
<li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li>
<li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li>
<li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research%22%5BJournal%5D)">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li>
<li>Bhatia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acid-mediated+effects+on+erythropoiesis+in+primary+definitive+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells.</a> Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells%3A+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li>
<li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a%28-%2F-%295b%28-%2F-%29+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li>
<li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li>
<li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells%3A+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li>
<li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li>
<li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis%3A+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li>
<li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui vi presentiamo un sistema unico per analizzare cronologicamente topo fetale eritropoiesi terminale del fegato. Attraverso l&#39;applicazione di diverse condizioni di coltura, abbiamo sezionato con successo l&#39;eritropoiesi terminale in fase precoce e tardiva. Ciò è particolarmente importante per determinare i meccanismi di geni con funzioni multiple. Ad esempio, GTPasi Rac svolgono un ruolo importante in diverse fasi della eritropoiesi terminale. Inibizione della Rac GTPasi nella fase iniziale della differenziazio...

L&#39;eritropoiesi è il processo di differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche multipotenti a maturare eritrociti. Questo processo graduale prevede la formazione di unità formanti impegnata a raffica eritroide (BFU-Es), le unità formanti colonia in rapida divisione eritroidi (CFU-Es), e morfologicamente riconoscibili eritroblasti 1,2. Eritropoiesi Terminal da cellule progenitrici CFU-E coinvolge sequenziale eritropoietina-dipendente e fasi indipendenti 2,3. Nella fase iniziale dell&#39;eritropoiesi terminale, eritropoietina (Epo) si lega al suo recettore sulla superficie cellulare e induce una serie di vie di segnalazione a valle che impediscono l&#39;apoptosi delle cellule e promuovono divisioni cellulari rapidi e l&#39;espressione genica 1,4. Nella fase tardiva dell&#39;eritropoiesi terminale, eritroblasti subiscono uscita cellula terminale del ciclo, cromatina e di nuclei di condensazione, e l&#39;estrusione dei nuclei altamente condensati 5. La nostra comprensione di terminaleeritropoiesi ha notevolmente migliorato negli ultimi decenni, che è in gran parte dovuto il successo nell&#39;uso di diversi in vitro e in modelli in vivo di topo 6-9. Tra questi modelli, la coltura in vitro di topo fetale eritroblasti fegato fornisce molti vantaggi tra cui la facilità di purificazione delle cellule, la proliferazione e la differenziazione veloce, e una mimica più vicino a eritropoiesi umana 10,11. In questo sistema, un gran numero di cellule progenitrici eritroidi da topo fegati fetali possono essere facilmente isolate dalla purificazione singolo passo di TER119 (un marcatore per le cellule eritroidi mature) eritroblasti negativi. Durante la cultura di due giorni degli eritroblasti, la differenziazione di queste cellule può essere monitorato da un citometria a flusso basato sulla superficie espressione del recettore della transferrina (CD71) e la TER119 dell&#39;antigene 12. Inoltre, l&#39;enucleazione dei eritroblasti differenziazione terminale può essere rilevata da un produttore di DNA (Hoechst 33342) 13. Inoltre, i progenitori purificati possono essere geneticamente modificati espressione esogena di cDNA o piccoli RNA hairpin (shRNAs) per i geni di interesse, che facilita gli studi meccanicistici delle funzioni di espressione genica su eritropoiesi 11,13,14. D&#39;altra parte, il tasso di crescita delle cellule veloce può essere una lama a doppio taglio poiché è difficile caratterizzare funzioni geniche nelle diverse fasi di eritropoiesi terminale. Nella maggior parte dei casi, è difficile stabilire se una specifica funzioni del gene nella fase iniziale dell&#39;eritropoiesi terminale fin dal momento in cui il cDNA o shRNAs espresso, le cellule già superato la fase iniziale. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un sistema unico di sezionare prime e ultime fasi dell&#39;eritropoiesi terminale. Per la fase iniziale di eritropoiesi terminale, geneticamente modificati TER119 eritroblasti negative sono state coltivate in terreno Epo-libero ma contenente fattore delle cellule staminali (SCF), IL-6 e FLT3ligando di mantenere il loro status progenitore e consentire i cDNA trasdotte o shRNA all&#39;espressione 13. Le cellule sono state modificate per Epo contenente medio dopo 12 ore per indurre la proliferazione e differenziazione cellulare. In questo modo, quando le cellule hanno cominciato a differenziarsi, i cDNA trasdotte o shRNAs erano già espressi. Per la fase tardiva dell&#39;eritropoiesi terminale, TER119 eritroblasti negative sono state coltivate in terreno contenente Epo subito dopo la trasduzione. Pertanto, si può analizzare le funzioni dei geni di interesse nella fase tardiva della eritropoiesi terminale. In sintesi, una vasta applicazione di questo sistema aiuterebbe funzioni geniche sezionare in diverse fasi della eritropoiesi terminale.

<table><tbody><tr><td>Medium di Dulbecco modificato di IscoveIMDM (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>GEMINI Bio-prodotto</td><td>700-102P</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Hyclone SV30010</td><td></td><td>100x</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>Mouse FIT3 Ligando (Flt-3L)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>14-8001-80</td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina-6 ricombinante di topo (IL-6)&nbsp;</td><td>GEMINI Bio-prodotto</td><td>300-327P</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>354008</tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>STEMCELL TECH</td><td>9300</td><td>10% stock in IMDM</td></tr><tr><td>Eritropoietina (Epo)</td><td>PROCRIT</td><td>NOC 59676-303-00</td><td>3.000 U/ml stock</td></tr><tr><td>Particelle di streptavidina Plus</td><td>BD Pharmingen</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>Magnete EasySep</td><td>STEMCELL TECH</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo a fondo tondo in polipropilene, 5 ml</td><td>FALCON</td><td></td><td></td>352063</tr></tbody></table>

mouse fetale fegato cultura di sistema per sezionare funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del terminal eritropoiesi

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Eritropoiesi comporta un processo dinamico che inizia con unità formanti impegnata a raffica eritroide (BFU-Es), seguita da rapida divisione eritroide unità formanti colonia (CFU-E). Dopo CFU-Es, le cellule sono morfologicamente riconoscibili e generalmente chiamato eritroblasti terminali. Una delle sfide per lo studio dell&#39;eritropoiesi terminale è la mancanza di approcci sperimentali per analizzare le funzioni del gene in modo cronologico. In questo protocollo, si descrive una strategia unica per determinare le funzioni del gene nelle prime e ultime fasi dell&#39;eritropoiesi terminale. In questo sistema, il mouse TER119 fegato fetale (marker delle cellule eritroidi mature) eritroblasti negativi sono stati purificati e trasdotto con espressione esogena di cDNA o piccoli RNA hairpin (shRNAs) per i geni di interesse. Le cellule sono state poi coltivate in terreno contenente fattori di crescita diversi eritropoietina (Epo) per mantenere la loro fase progenitore per 12 ore, consentendo cDNA esogeni o shRNAsdi esprimere. Le cellule sono state modificate per Epo media dopo 12 ore di indurre il differenziamento e la proliferazione cellulare, mentre il materiale genetico esogeno erano già espressi. Questo protocollo facilita l&#39;analisi delle funzioni dei geni nella fase iniziale dell&#39;eritropoiesi terminale. Per studiare terminale eritropoiesi fase tardiva, le cellule sono state coltivate in Epo immediatamente medio dopo trasduzione. In questo modo, le cellule sono state già differenziate per la fase tardiva dell&#39;eritropoiesi terminale quando sono stati espressi i materiali genetici trasdotte. Si consiglia una applicazione generale di questa strategia che potrebbe aiutare a capire le funzioni del gene dettagliate in diverse fasi della eritropoiesi terminale.

La figura 1 illustra le strategie sperimentali. Il protocollo consiste di due condizioni indipendenti per il targeting le funzioni delle molecole di segnalazione nelle prime e ultime fasi della eritropoiesi terminale. TER119 eritroblasti fegato fetale negativi sono stati purificati da topo E13.5 feto. Analisi citofluorimetrica delle cellule eritroidi fegato fetale prima e dopo la purificazione dimostrato che la purificazione era efficiente (Figure 2A e 2B). Per la fase ...

Vi presentiamo un mouse fetale sistema di coltura in vitro eritroblasto fegato che analizza le fasi precoce e tardiva dell&#39;eritropoiesi terminale. Questo sistema facilita l&#39;analisi funzionale di geni specifici in diversi stadi di sviluppo.

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sezionare la funzione genica in diversi stadi dell'eritropoiesi terminale utilizzando un sistema di coltura epatica fetale di topo in vitro. Ciò si ottiene purificando prima TER uno eritroblasti epatici fetali di topo 19 negativi da topi embrionali del giorno 13,5 gravidi Come secondo passo, gli eritroblasti purificati vengono trasdotti con virus che codifica CD NA o S-H-R-N-A del gene di interesse per studiare rispettivamente il guadagno o la perdita di funzione del gene. Infine, le cellule TER 19 negative trasdotte vengono coltivate in una delle due diverse condizioni per sezionare la funzione del gene nelle fasi precoci e tardive dell'eritropoiesi terminale.In definitiva, le diverse cinetiche del differenziamento e dell'enucleazione delle cellule trasdotte possono essere valutate mediante analisi citofluorimetrica. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla osisi atriale del topo. Può essere applicato anche ad altri sistemi HESI come la linfa, la osi e la miosi.Per purificare gli eritroblasti epatici fetali, iniziare disinfettando l'addome di una topolina gravida eutanasia da E 13 a E 15 con etanolo al 70%. Quind

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Immunologia e Infezioni

Un metodo di citometria a flusso per l'identificazione e l'analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.

Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Mentre i macrofagi infiltranti vengono reclutati continuamente nei tessuti adulti da precursori circolanti, i macrofagi residenti seminano il loro tessuto durante lo sviluppo, dove vengono mantenuti senza ulteriori input da progenitori. I progenitori per i macrofagi residenti sono stati recentemente identificati. Qui presentiamo metodi per la mappatura genetica dei fenomeni genetici dei progenitori macrofagi.

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

Qui vi presentiamo il nostro protocollo per produzione indotta da progenitori eritroidi (iEPs) dai fibroblasti adulti del mouse utilizzando la trascrizione factor-driven diretto lignaggio riprogrammazione (DLR).

Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

La traduzione della purificazione dell'affinità dei ribosomi (TRAP) consente un isolamento rapido ed efficiente dell'mRNA di traslazione specifico del tipo di cellula. Qui, dimostriamo un metodo che combina l'iniezione idrodinamica della vena della coda in un modello murino di ripopolamento e del trap per esaminare il profilo di espressione degli epatociti ripopolamento.

Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse

Qui, descriviamo un nuovo metodo citometrico a flusso per l'isolamento prospettico dei progenitori eritroidi dell'unità esplosiva precoce (BFU-e) e dell'unità eritroide formante colonie (CFU-e) direttamente dal midollo osseo e dalla milza freschi di topo. Questo protocollo, sviluppato sulla base di dati trascrittomici a singola cellula, è il primo a isolare tutti i progenitori eritroidi del tessuto con elevata purezza.

Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

La modellizzazione dell'eritropoiesi fornisce una preziosa opportunità per comprendere il significato biologico degli attori in questo processo e per valutare nuovi approcci terapeutici che possono alleviare i difetti di differenziazione. Qui, descriviamo un metodo semplice e affidabile per differenziare in modo efficiente le cellule staminali ematopoietiche CD34+ e le cellule progenitrici ex vivo.

Una pipeline completa per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro ed ex vivo

Durante il processo di infezione, un passo fondamentale è l'adesione di patogeni con cellule ospiti. Nella maggior parte dei casi questo passo adesione avviene in presenza di sollecitazioni meccaniche generate dal flusso liquido. Descriviamo una tecnica che introduce sforzo di taglio come un parametro importante nello studio della adesione batterica.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

Scopri la dissezione della funzione genica nelle fasi precoci e tardive dell'eritropoiesi terminale utilizzando un sistema di coltura in vitro del fegato fetale di topo.

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi (Video) | JoVE Journal

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

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