Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Questo metodo potrebbe essere utile per ematologi e immunologi che studiano la produzione e la funzione delle cellule mieloidi, inclusi neutrofili, monociti e cellule dendritiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'identificazione più precisa dei sottogruppi progenitori mieloidi rispetto alle strategie precedenti. Per arricchire le cellule del midollo osseo per i progenitori mediante smistamento cellulare attivato magneticamente, o MACS, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 40 microlitri di tampone di colorazione MACS per una volta 10 per le sette cellule del midollo osseo.

Per esaurire le cellule positive al lignaggio differenziato, aggiungere 10 microlitri di cocktail di anticorpi alla biotina per una volta 10 alle sette cellule e mescolare pipettando per un'incubazione di 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri di tampone di colorazione per una volta 10 alle sette cellule con miscelazione, seguiti da 20 microlitri di microsfere anti-biotina per una volta 10 alle sette cellule. Dopo 15 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le celle con un millilitro di tampone di colorazione per una volta da 10 a sette celle e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di colorazione fresco per un massimo di una volta da 10 a otto celle.

Quindi, impostare il separatore magnetico automatizzato secondo le istruzioni del produttore e posizionare il tubo di celle etichettate nel separatore. Inizia il programma di selezione negativa per raccogliere la frazione negativa che contiene le cellule negative del lignaggio arricchito con il progenitore. Pellettare le cellule negative del lignaggio mediante centrifugazione e risospendere il pellet, che ora è bianco, in due millilitri di tampone di colorazione per topo per il conteggio.

Per isolare le cellule progenitrici mieloidi mediante FACS, aggiungere una volta 10 alle cellule negative del quinto lignaggio a ciascuna delle otto provette per microcentrifuga di controllo per la selezione della tensione e la compensazione del colore e aggiungere il resto del campione di cellule a una nona provetta per microcentrifuga per la colorazione con tutti e sette gli anticorpi marcatori di superficie di interesse per l'identificazione e lo smistamento dei progenitori. Pellettare le celle mediante centrifugazione e risospendere i pellet di controllo in 100 microlitri di tampone di colorazione FACS e il pellet del campione sperimentale in 100 microlitri di tampone di colorazione per cinque volte 10 alle sei cellule. Quindi, aggiungere l'anticorpo anti-CD16/CD32 alla provetta a colorazione singola del recettore gamma Fc e alla provetta del campione.

Agitare delicatamente e incubare i campioni per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere gli altri anticorpi alle provette a colorazione singola corrispondenti e alla provetta del campione e, dopo una leggera agitazione, incubare i campioni per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 900 microlitri di tampone di colorazione alle provette di controllo e un millilitro di tampone di colorazione per una volta 10 alle sette cellule della provetta per la centrifugazione.

Risospendere i pellet di controllo in 200 microlitri di tampone di colorazione fresco per provetta e il pellet sperimentale in 500 microlitri per 2,5 volte 10 nelle sette celle e trasferire le cellule marcate in singole provette FACS da cinque millilitri corrispondenti. Quindi impostare il citometro a flusso secondo i protocolli standard e utilizzare i controlli non colorati e a macchia singola per impostare le tensioni e le compensazioni del colore. Per identificare e isolare le cellule progenitrici mieloidi, caricare il campione di cellule sperimentali sul citometro e creare un grafico dell'area di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione laterale, escludendo i detriti e le cellule morte.

Crea un grafico dell'altezza di dispersione in avanti rispetto alla larghezza di dispersione in avanti delle celle vive e del gate per escludere i doppietti. Ripetere questo processo con un grafico dell'altezza di dispersione laterale rispetto alla larghezza di dispersione laterale dei singoletti di dispersione in avanti e del gate per escludere i doppietti. Crea un grafico e un gate Sca-1 versus c-Kit per selezionare i progenitori c-Kit positivi e Sca-1 negativi.

Quindi creare un grafico e un gate del recettore gamma CD-34 rispetto a FC per selezionare le popolazioni miste di progenitori mieloidi comuni e progenitori di monociti a granulociti misti. È importante controllare il progenitore mieloide comune misto e le popolazioni progenitrici di monociti a granulociti misti nel modo più preciso possibile. Può essere utile utilizzare un grafico di pseudo-densità di colore o un grafico di contorno per un gating più accurato.

Utilizzare le cellule nel gate progenitore mieloide comune misto per creare un grafico CD115 rispetto a Flt3 e un gate per selezionare il progenitore mieloide comune Flt3 positivo CD115 cellule basse, il progenitore mieloide comune Flt3 negativo CD115 cellule basse e i progenitori Flt3 positivi CD115 di cellule dendritiche monocitiche alte. Utilizzare le cellule nel gate progenitore dei monociti a granulociti misti per creare un grafico e un gate del recettore Ly6C rispetto al recettore gamma FC per selezionare le cellule Ly6C negative e le cellule Ly6C positive. Quindi creare un grafico CD115 rispetto a Flt3 per ogni sottopopolazione di cellule progenitrici di monociti a granulociti misti gated e gate i progenitori dei monociti a basso granulocita Ly6C negativi, i progenitori dei monociti a basso granulocita Ly6C negativi Flt3 negativi CD115 e i progenitori dei monociti alti Ly6C positivi Flt3 negativi CD115.

La deplezione massima del lignaggio è efficiente nell'esaurimento delle cellule differenziate e nell'arricchimento delle cellule progenitrici positive per c-Kit. La frazione negativa del lignaggio contiene ancora alcune cellule c-Kit negative, ma queste cellule verranno eliminate nelle successive fasi di gating della citometria a flusso. Le rese dei progenitori dopo la selezione FACS possono variare a seconda delle impostazioni del selezionatore utilizzate, ma dovrebbe essere possibile ottenere da una a quattro volte da 10 a quattro celle per frazione da ciascun topo con una purezza post-selezione superiore al 95% per ciascuna frazione.

Una buona colorazione è fondamentale per una netta separazione delle popolazioni. Potrebbe essere necessario titolare gli anticorpi o scegliere fluorofori diversi per garantire una separazione ottimale. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare le cellule progenitrici per valutare le differenze nella composizione del midollo osseo tra i campioni, per isolare i progenitori per l'analisi molecolare o per valutare la loro capacità di produrre cellule mieloidi.