Name: Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Impara a isolare sei sottopopolazioni di progenitori mieloidi dal midollo osseo di topo usando MACS e FACS. Questo protocollo avanzato consente analisi precise di ematologia e immunologia.

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Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando fondi dal Consiglio dei governatori rigenerativa medicina Institute al Cedars-Sinai Medical Center (HSG), una carriera in comunione di immunologia dal Associazione americana di immunologi (a AY e HSG) e un Scholar Award da la società americana di Ematologia (di AY). Ringraziamo il nucleo di Cytometry di flusso al Cedars-Sinai Medical Center per assistenza con l'ordinamento FACS.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolamento del midollo osseo di topo e preparazione di una sospensione singola cella
<ol><li>Eutanasia il mouse secondo le linee guida istituzionali.</li>
	<li>Posizionare il mouse eutanasizzato sul dorso e spruzzarlo con 70% di etanolo (EtOH). Praticare un'incisione di piccolo (3-5 mm) in ogni arto presso la caviglia livello utilizzando sharp, forbici appuntite e tirare la pelle verso il corpo per rimuoverlo dalle gambe ed esporre i muscoli e ossa.</li>
	<li>Per rimuovere i muscoli (quadricipiti, muscoli posteriori della coscia, ecc.) dalle ossa, li taglio con le forbici, seguendo la direzione dell'osso. Fare attenzione a non danneggiare le ossa.</li>
	<li>Dislocare i femori da articolazioni dell'anca e tagliare via il tessuto connettivo e muscolare per staccare le gambe, facendo attenzione a non tagliare le ossa.</li>
	<li>Rimuovere i piedini di lussazione della caviglia dalle tibie, collocare le ossa in una provetta sterile PBS o media e trasportarli sul ghiaccio per la camera di coltura del tessuto. Nota: Per alcune applicazioni (ad es., derivazione di macrofagi da cellule del midollo osseo totale) è possibile lasciare le ossa sul ghiaccio per un po', ma per l'isolamento di cellule progenitrici è importante procedere più rapidamente possibile per evitare downregulation di marcatori di superficie importanti (soprattutto CD115).</li>
	<li>In una cappa di biosicurezza, rimuovere qualsiasi tessuto molle rimanente dalle ossa strofinandoli con carta velina. Nota: Il protocollo deve essere eseguito in una cappa di biosicurezza se un campione sterile è necessario per le analisi di cultura o in vivo delle cellule dopo l'ordinamento FACS. Se le cellule sterili non sono necessari, l'intero processo può essere eseguito sul banco di laboratorio.</li>
	<li>Immergere brevemente le ossa in 70% EtOH per disinfettare e poi in PBS sterile per lavarli.</li>
	<li>Separare i femori dalle tibie e fibule tagliando attraverso il ginocchio e scartare le fibule.</li>
	<li>Tagliare le estremità fuori le ossa con forbici affilate.</li>
	<li>Raccolta del midollo osseo con PBS sterile fredda come segue fino a quando le ossa appaiono bianche:<ol>
<li>Ogni osso di afferrare con una pinza e inserire un ago 26G collegato ad una siringa da 10 mL contenente PBS sterile fredda nell'albero dell'osso ad una estremità.</li>
		<li>Tenere l'osso sopra un tubo di centrifuga da 50 mL e a filo 2-5 mL di PBS attraverso l'osso per raccogliere il midollo.</li>
		<li>Raccogliere il midollo dalle ossa tutti 4 per topo (2 femori e 2 tibie).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipettare delicatamente su e giù con una pipetta da 1 mL a disaggregare il midollo osseo per formare una sospensione cellulare.</li>
	<li>Filtrare la sospensione di midollo osseo attraverso un pezzo di maglia di nylon 30 μm per eliminare i pezzi di ossa e aggregati, generando così una sospensione singola cella di cella.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione unicellulare a 280 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in sterile colorazione buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), con 5 mL di tampone per topo (ad es., 10 mL per le cellule in pool dai femori e le tibie di 2 topi) di colorazione.</li>
	<li>Prendere un 10 μL di aliquota del campione, mescolare con 10 μL di Trypan Blue e carico 10 μL del campione tripan blu-etichettato risultante a un emocitometro. Contare le celle utilizzando un microscopio ottico. Nota: Se le celle sono troppo concentrate per il conteggio affidabile, diluire il campione prima dell'aggiunta di Trypan Blue.</li>
</ol>2. progenitore arricchimento di magnetico-Activated Cell Sorting (Mac)
<ol><li>Centrifugare la sospensione intera singola cella (o il numero di celle come è necessari per ottenere la resa desiderata) a 280 x g per 5 min a 4° C e risospendere il pellet cellulare in 40 μL di buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) per 107 cellule di colorazione. Nota: È anche possibile utilizzare MACS buffer del produttore di kit di svuotamento lignaggio (Vedi Tabella materiali) come alternativa al buffer di colorazione.</li>
	<li>Eseguire lo svuotamento di stirpe secondo le istruzioni fornite con il kit di svuotamento di stirpe. Le seguenti istruzioni sono per il kit visto nella Tabella materiali. Se si utilizza un kit diverso, seguire le istruzioni del produttore e quindi passare al punto 2.3.<ol>
<li>Aggiungere 10 μL biotina-anticorpo cocktail a 107 cellule, Miscelare pipettando e incubare per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 30 µ l tampone/Mac la macchiatura buffer per 107 cellule e mescolare.</li>
		<li>Aggiungere 20 μL anti-biotina microsfere per 107 cellule. Mescolare bene e incubare per altri 15 min a 4 ° C. Nota: Vortex le microsfere prima di aggiungerli alle cellule per assicurarsi che essi sono completamente dispersa.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di buffer buffer/Mac per 107 cellule di colorazione, centrifugare le cellule a 280 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in 500 μL colorazione buffer/MACS tampone per fino a 108 celle. Per più di 108 cellule, aumentare il volume di macchiatura buffer buffer/MACS di conseguenza.</li>
		<li>Preparare il separatore magnetico automatizzato secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Collocare la provetta contenente le celle con etichettate nel separatore e scegliere il programma di selezione negativa.</li>
		<li>Raccogliere la frazione negativa, che contiene le cellule di progenitrici-arricchita lignaggio-negativi (Lin–). Scartare la frazione positiva, che contiene le cellule di lignaggio-positive magneticamente-etichettati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare la Lin– cellule a 280 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di buffer buffer/Mac per topo (ad es., 4 mL se midollo osseo era pool da 2 topi) di colorazione. Nota: Il pellet dovrebbe essere bianco anziché rosso perché gli eritrociti sono stati esauriti.</li>
	<li>Prendere un 10 μL di aliquota delle cellule Lin– , mescolare con 10 μL di Trypan Blue e carico 10 μL del campione tripan blu-etichettato risultante a un emocitometro. Contare le celle utilizzando un microscopio ottico. Nota: Se le celle sono troppo concentrate per il conteggio affidabile, diluire il campione prima dell'aggiunta di Trypan Blue.</li>
</ol>3. mieloidi progenitrici identificazione e isolamento di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS)
<ol><li>9 etichetta per microcentrifuga (1,5 o 2 mL) per: 1) senza macchia celle, 2-8) cellule singole colorate con anticorpi coniugati fluoroforo contro FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C e CD115 per compensazione della tensione di selezione e colore e 9) campione di cellule per essere macchiato con 7 tutti gli anticorpi per l'identificazione di cellule progenitrici e ordinamento.</li>
	<li>È possibile distribuire 100.000 cellule per ciascuna delle provette controllo (tubi 1-8) e tutte le celle rimanenti (o meno se lo si desidera) per il campione tubo (9). Nota: Se il volume del campione è maggiore di 1,5-2 mL, può essere necessario distribuire le cellule del campione in una provetta da 15 mL, centrifugare li e risospendere il pellet (fase 3.3 sotto) e quindi trasferire le cellule ad un tubo del microcentrifuge per le successive fasi di colorazione.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 1.500 x g per 5 min e risospendere il pellet di tubo di controllo in 100 μL buffer (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) e il pellet di tubo campione in 100 μL di colorazione colorazione buffer per 5 x 106 cellule (ad es., 200 μL per 1 x 107 cellule).</li>
	<li>Aggiungere 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR macchia singolo tubo e il tubo di campionamento. Vortice delicatamente per mescolare e incubare per 10 min a 4 ° C. Nota: È importante a macchiare il campione di cellule con l'anticorpo FcγR (CD16/32) prima di aggiungere gli altri anticorpi per impedire la concorrenza a causa del legame non specifico Fc-mediata anticorpo. Non Incubare le cellule con un FcγR reagente bloccante.</li>
	<li>Aggiungere gli altri anticorpi per provette corrispondenti singola macchia (1 dell'anticorpo) e la provetta del campione (tutti gli 6 anticorpi): 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy 5.5 e 4 μg/mL CD115-PE. Vortice delicatamente e incubare per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 900 μL buffer colorazione per i tubi di controllo e 1 mL di tampone di colorazione per 107 cellule in provetta del campione. Centrifugare le cellule a 1.500 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare nella macchiatura buffer: 200 µ l per provetta di controllo e 500 μL per 25 x 106 cellule nella provetta del campione. Trasferire le cellule sedimento per provette da 5 mL FACS. Nota: Se il volume del campione è maggiore di 1,5-2 mL, può essere necessario trasferire le cellule in una provetta da 15 mL per centrifugazione.</li>
	<li>Preparare il citometro a flusso (analizzatore o selezionatore) secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Eseguire singole e non macchiate macchiato le cellule di controllo attraverso il citometro a flusso per impostare la compensazione di colore e di tensioni.</li>
	<li>Eseguire il campione di cellule, cancello i sottoinsiemi di cellule progenitrici come descritto qui di seguito e riassunti nella Figura 2e se lo si desidera, eseguire FACS ordinamento per isolare i sottoinsiemi di progenitrici pertinenti. Nota: È in genere necessario acquisire circa 200.000 cellule per ottenere almeno 1.000 eventi in ogni cancello progenitrici.<ol>
<li>Crea una stampa di puntino di tutte le cellule, visualizzazione FSC-A (asse x) e SSC-A (asse y) e del cancello per escludere detriti e cellule morte = > cellule "vive".</li>
		<li>Crea una stampa di puntino di cellule "vive", visualizzati da FSC-H (asse x) e FSC-W (asse y) e del cancello per escludere doppietti = > cancello live/canottiera (FSC).</li>
		<li>Creare un terreno di puntino di vivere/canottiera celle (FSC), visualizzazione SSC-H (asse x) e SSC-W (asse y) e del cancello per escludere doppietti = > live/canottiera (FSC) / porta di singoletto (SSC).</li>
		<li>Creare un terreno di puntino di vivere/canottiera (FSC) / cellule di singoletto (SSC), visualizzazione di Sca-1 (asse x) e c-Kit (asse y) e porta a selezionare c-Kit+ Sca-1– cellule = > cellule LKS– .</li>
		<li>Crea una stampa di puntino delle cellule LKS– , visualizzazione di CD34 (asse x) e FcγR (asse y) e porta a selezionare CD34+ FcγRlo cellule = > "CMP" e CD34+ FcγRCiao cellule = > "PGM". Nota: È importante per cancello il "CMP" e "PGM" come precisamente possibile. È utile utilizzare una trama di densità pseudocolor o una trama di contorno per gating accurata.</li>
		<li>Creare una trama di puntino del "CMP", visualizzazione CD115 (asse x) e Flt3 (asse y) e porta a selezionare: FLT3+ CD115lo cellule = > CMP-Flt3+ CD115lo cellule, FLT3– CD115lo cellule = > CMP-Flt3– cellule, FLT3+ CD115Ciao cellule = > MDPs.
</li>
		<li>Crea una stampa di puntino delle "PGM", Ly6C di visualizzazione (asse x) e FcγR (asse y) e porta a selezionare Ly6C cellule–= > "Cellule GMP-Ly6C– " e Ly6C+ cellule = > "GMP-Ly6C+ cellule".</li>
		<li>Creare una trama di dot "GMP-Ly6C– di cellule", visualizzazione CD115 (asse x) e Flt3 (asse y) e porta a selezionare: FLT3– CD115lo cellule = > GMPs.
</li>
		<li>Creare una trama di dot "GMP-Ly6C+ di cellule", visualizzazione CD115 (asse x) e Flt3 (asse y) e porta a selezionare: FLT3– CD115lo cellule = > GPs, FLT3– CD115Ciao cellule = > MPs + cMoPs.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li>
<li>Yáñez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li>
<li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Yáñez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Weissman gating strategia per mouse progenitrici mieloidi identificazione1 è stato il gold standard per gli immunologi ed ematologi per quasi 20 anni, ma ora è evidente che i cancelli "CMP" e "GMP" sono molto eterogenei e più preciso sono necessarie strategie di Gate. Il protocollo che abbiamo descritto qui consenta l'identificazione dell'oligopotent e dei sottoinsiemi di lignaggio-commesso in topi C57BL/6J per più precisa quantificazione dei progenitori mieloidi specifici e mappatura delle vie mi...

Monociti, neutrofili e cellule dendritiche (DCs) sono cellule mieloidi che derivano da progenitori ematopoietici, principalmente nel midollo osseo, tramite un processo chiamato mielopoiesi. Comune dei progenitori mieloidi (CMPs) hanno il potenziale per produrre cellule mieloidi, come pure i megacariociti ed eritrociti, ma cellule non linfoidi. Progenitori del granulocyte-monocito (GMP), che sono derivati da CMPs, producono di granulociti e monociti, ma hanno perso dei megacariociti e potenziali dell'eritrocito. Monociti e classica e plasmacytoid DCs (cDCs/PDC) sono anche pensato di derivano da progenitori comuni, noti come progenitori del monocito-DC (MDPs), che sono prodotte da CMPs. graduale limitazione del potenziale di lignaggio infine provoca lignaggio-commesso progenitori: progenitori granulociti, monociti progenitori e dei progenitori delle cellule dendritiche (Figura 1).
Weissman e colleghi ha riferito che CMPs si trovano in Lin– c-Kit+ Sca-1– CD34 (LKS–)+ FcγRlo frazione del midollo osseo di topo, mentre le GMP sono contenute nel CD34 LKS– + FcγR Ciao frazione1. Tuttavia, queste frazioni "CMP" e "GMP" sono molto eterogenee. Per esempio, la frazione "GMP" contiene anche dei progenitori del granulocyte lignaggio-commessi e monocito progenitori1,2. MDPs separatamente sono stati segnalati per essere CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitori che inoltre esprimono CD34 e FcγR3,4. MDPs danno luogo a cDC/pDC-produzione comune DC progenitori (CDP), che sono stati segnalati per esprimere più bassi livelli di c-Kit (CD117) e non sono inclusi nella frazione LKS– 5.
Si è precedentemente ipotizzato che monociti derivano attraverso una singola via (CMP-GMP-MDP-monocito). Coerente con questo modello, monocito-commesso dei progenitori prodotto da PGM (denominato progenitori del monocito, MPs)2 e MDPs (denominato comuni progenitori del monocito, cMoPs)6 sembrano essere le stesse celle sulla base dell'espressione dei marker di superficie condivisa . Tuttavia, abbiamo recentemente dimostrato che monociti sono prodotte in modo indipendente da GMPs e MDPs e sono stati in grado di distinguere tra MPs e cMoPs di cella singola sequenziamento del RNA,7.
Abbiamo recentemente modificato il Weissman "CMP" e "GMP" gating strategia per identificare 6 subfractions del midollo osseo di topo C57BL/6J contenente diversi oligopotent e sottoinsiemi di lignaggio-commesso progenitrici mieloidi. Abbiamo segnalato prima che la macchiatura per Ly6C e CD115 consente l'isolamento di GMPs oligopotent, così come di progenitori del granulocyte (GPs) e di progenitori del monocito (MPs e cMoPs, che siamo attualmente in grado di separare) dalla frazione "GMP"2 (LKS - CD34+ FcγRCiao cancello; Figura 1). Abbiamo successivamente dimostrato che MDPs si trovano principalmente nella frazione "CMP" (CD34 LKS– + FcγRlo cancello), che contiene anche Flt3+ CD115lo e Flt3– sottoinsiemi7 (Figura 1 ). Il CMP-Flt3+ CD115lo frazione rendimenti sia GMPs e MDPs su trasferimento adottivo. Il sottoinsieme di CMP-Flt3– contiene dei progenitori che sembrano essere intermedi tralo cellule CD115 CMP-Flt3+ e GMP. A differenza di MDPs, CMP-Flt3+ CD115lo sia il CMP-Flt3– frazioni anche possiedono megacariocita e potenziali dell'eritrocito.
È importante notare, tuttavia, che non è attualmente chiaro se le frazioni "CMP" contengono progenitori che sono veramente oligopotent (ad es., cellule individuali all'interno del CMP-Flt3+ CD115lo frazione che possiedono dei neutrofili, monociti, DC, megacariocita e potenziali dell'eritrocito), o in alternativa, comprendono una miscela di progenitori con più limitato potenziale di lignaggio. Colonie del saggi (culture metilcellulosa) ha rivelato le cellule con potenziale megacariocita (cellule di GEMM) in "CMP", dell'eritrocito, monociti e granulociti (neutrofili) CMP-Flt3+ CD115lo e frazioni di CMP-Flt3– 1 ,7, ma non consentono la valutazione del potenziale di DC. Al contrario, Colonia formando le analisi ha dimostrato l'esistenza di oligopotent PGM (progenitori con neutrofili e monociti potenziali) in "GMP" frazione1,2, e questo è supportato da recenti unicellulare di analisi trascrittomica8. Non è attualmente noto, tuttavia, se questi PGM oligopotent produrre anche altri granulociti (eosinofili, basofili e mastociti).
Sulla base di questi studi, ora dimostriamo come 7 marcatori (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C e CD115) di superficie può essere utilizzato per identificare e isolare questi 6 sottogruppi della oligopotent e dei progenitori mieloidi lignaggio-commesso. Il protocollo descritto qui può essere applicato per i test di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido), esperimenti di trasferimento adottivo in vivo in topi e l'analisi molecolare (sequenziamento di RNA alla rinfusa e a cella singola, Western blotting, ecc).
Il protocollo consiste di 3 fasi: 1) preparazione di una sospensione di singola cellula del midollo osseo cellule, 2) arricchimento di progenitori ematopoietici (ordinamento magnetico-attivata delle cellule) e 3) l'identificazione e l'isolamento se lo si desidera, dei sottoinsiemi di cellule progenitrici di flusso cytometry (utilizzando un analizzatore o un fascicolatore, come appropriato). Il primo passo è l'isolamento delle cellule del midollo osseo dai femori e le tibie di topi eutanasizzati ed è simile ad altri protocolli precedentemente descritti9. Successivamente, il campione si arricchisce per cellule staminali e progenitrici usando un cocktail di anticorpi contro gli indicatori di superficie delle cellule di eritrociti, i neutrofili, monociti, linfociti, ecc., per vuotare le cellule differenziate. Questo non è obbligatorio, ma fortemente consigliato per ottimizzare il rilevamento dei sottoinsiemi progenitore e per ridurre la quantità di anticorpi necessari per l'identificazione di cellule progenitrici e il tempo necessario per citometria a flusso. Il protocollo di deplezione di lignaggio qui sotto descrive l'ordinamento delle cellule Magnetic-Activated (MACS) utilizzando un Kit di svuotamento di Mouse Lineage delle cellule (che contiene anticorpi biotinilati CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 e Ter-119, plus anti-biotina microsfere) e un separatore magnetico automatizzato. Il passo finale è l'individuazione (e l'ordinamento, se lo si desidera) dei sottoinsiemi progenitore tramite flusso cytometry. Il pannello di anticorpi descritti di seguito (Vedi anche tabella 1) è stato progettato per essere utilizzato in un citometro a flusso (analizzatore o selezionatore) con 4 laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Figura 1: vie di differenziazione e progenitori dei neutrofili, monociti e DC. Il modello recentemente riveduto della mielopoiesi7 è illustrato, con i cancelli di Weissman per "CMP" (blu) e "PGM" (verde)1 sovrapposti. Questa figura è stata modificata da Yáñez et al 20177. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Topo: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td><td>The Jackson Laboratories</td><td>Cat#JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#553733</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&gamma; R; clone 93) APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#101327</td><td></td></tr><tr><td>Ratto anti-topo Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#108114</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>Cat#105820</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>Cat#128012</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td><td>BioLegend</td><td>Cat#135506</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#560718</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#C36950</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Utilizzare il programma "deplete"</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 laser, 15 colori</td></tr><tr><td>Selezionatrice cellulare BD FACS Aria III</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 laser, 13 colori</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>https://www.flowjo.com</td><td>Per ulteriori analisi dei file .fcs</td></tr></tbody></table>

identificazione e isolamento di oligopotent e dei progenitori mieloidi lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Progenitori mieloidi che producono neutrofili, monociti e cellule dendritiche (DCs) possono essere identificati e isolati dal midollo osseo di topi per analisi ematologiche ed immunologiche. Ad esempio, studi delle proprietà molecolari e cellulari delle popolazioni di cellule progenitrici mieloidi possono rivelare meccanismi sottostanti la trasformazione leucemica o dimostrare come il sistema immunitario risponde all'esposizione di agente patogeno. In precedenza strategie di citometria a flusso descritto per l'identificazione di cellule progenitrici mieloidi hanno permesso significativi progressi in molti campi, ma le frazioni che identificano sono molto eterogenee. Le strategie più comunemente usate di Gate definiscono frazioni del midollo osseo che sono arricchite per le popolazioni desiderate, ma contengono anche un numero elevato di "contaminare" progenitori. Nostri studi recenti hanno risolto gran parte di questa eterogeneità e il protocollo che presentiamo qui consente l'isolamento 6 sottopopolazioni di oligopotent e dei progenitori mieloidi lignaggio-commessi da 2 precedentemente descritto frazioni del midollo osseo. Il protocollo descrive 3 fasi: 1) l'isolamento del midollo osseo cellule, 2) arricchimento di progenitori ematopoietici di ordinamento magnetico-attivata delle cellule (svuotamento di stirpe di MACS) e 3) identificazione dei sottoinsiemi di cellule progenitrici mieloidi mediante citometria a flusso (tra cui fluorescenza-attivato cella ordinamento, FACS, se lo si desidera). Questo approccio consente la quantificazione di progenitore e isolamento per una varietà di applicazioni in vitro e in vivo e ha già dato romanzo insight sulle vie e sui meccanismi di neutrofili, monociti e differenziazione delle DC.

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, è possibile ottenere cellule 100 milioni (compresi i globuli rossi, o 50 milioni di cellule nucleate) da entrambi i femori e tibie (2 gambe) di un mouse C57BL/6J (6-8 settimane vecchie, maschile o femminile). 1-2 milioni Lin– cellule possono essere isolate per topo da svuotamento di MACS delle cellule Lin+ .
Ognuno dei 6 sottoinsiemi progenitrici mieloidi c...

Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Questo metodo potrebbe essere utile per ematologi e immunologi che studiano la produzione e la funzione delle cellule mieloidi, inclusi neutrofili, monociti e cellule dendritiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'identificazione più precisa dei sottogruppi progenitori mieloidi rispetto alle strategie precedenti. Per arricchire le cellule del midollo osseo per i progenitori mediante smistamento cellulare attivato magneticamente, o MACS, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 40 microlitri di tampone di colorazione MACS per una volta 10 per le sette cellule del midollo osseo.Per esaurire le cellule positive al lignaggio differenziato, aggiungere 10 microlitri di cocktail di anticorpi alla biotina per una volta 10 alle sette cellule e mescolare pipettando per un'incubazione di 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri di tampone di colorazione per una volta 10 alle sette cellule con miscelazione, seguiti da 20 microlitri di microsfere anti-biotina per una volta 10 alle sette cellule. Dopo 15 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le celle con un millilitro di tampone di colora

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo di citometria a flusso per l'identificazione e l'analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

Qui descriviamo un protocollo ottimizzato e altamente riproducibile per isolare le cellule progenitrici mesodermiche (MPC) dal midollo osseo umano (hBM). Le MPC sono state caratterizzate mediante citometria a flusso ed espressione di nestina. Hanno dimostrato la capacità di dare origine a colture cellulari simili alle MSC in crescita esponenziale, pur mantenendo il loro potenziale angiogenico.

Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

Mentre i macrofagi infiltranti vengono reclutati continuamente nei tessuti adulti da precursori circolanti, i macrofagi residenti seminano il loro tessuto durante lo sviluppo, dove vengono mantenuti senza ulteriori input da progenitori. I progenitori per i macrofagi residenti sono stati recentemente identificati. Qui presentiamo metodi per la mappatura genetica dei fenomeni genetici dei progenitori macrofagi.

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Qui vengono presentati protocolli dettagliati per coltura la linea 32D/G-CSF-R cellula precursore mieloide murino, eseguendo le infezioni virali e svolgere le analisi di proliferazione e differenziazione. Questa linea cellulare è adatta per lo studio dello sviluppo delle cellule mieloidi e il ruolo dei geni di interesse in crescita delle cellule mieloidi e differenziazione neutrophilic.

Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule

Qui forniamo un metodo per identificare e isolare un numero elevato di GM-CSF guidato cellule mieloidi utilizzando l'ordinamento delle cellule ad alta velocità. Cinque popolazioni distinte (comune dei progenitori mieloidi, progenitori del granulocita/macrofago, monociti, macrofagi monocito-derivati e DCs monocito-derivato) possono essere identificati sulla base di Ly6C e CD115 espressione.

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Qui, descriviamo un nuovo metodo citometrico a flusso per l'isolamento prospettico dei progenitori eritroidi dell'unità esplosiva precoce (BFU-e) e dell'unità eritroide formante colonie (CFU-e) direttamente dal midollo osseo e dalla milza freschi di topo. Questo protocollo, sviluppato sulla base di dati trascrittomici a singola cellula, è il primo a isolare tutti i progenitori eritroidi del tessuto con elevata purezza.

Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Impara a isolare sei sottopopolazioni di progenitori mieloidi dal midollo osseo di topo usando MACS e FACS. Questo protocollo avanzato consente analisi precise di ematologia e immunologia.

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

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