ReAsH / Flash Etichettatura e Image Analysis di proteine ​​sensore Tetracysteine ​​nelle celle

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare le cellule che esprimono una tetra cisteina e una proteina marcata in fluorescenza con i coloranti flash o ash e di analizzare quantitativamente i risultati. Ciò si ottiene effettuando prima il transzionamento di un plasmide che trasporta una proteina fluorescente e la proteina bersaglio contenente un tag di tetra cisteina nella linea cellulare di interesse. Successivamente, la proteina espressa viene etichettata con R o flash e la dieta non specificamente legata viene rimossa lavandola con BAL per prepararsi all'imaging microscopico.

Quindi viene utilizzato un microscopio confocale per raccogliere immagini fluorescenti delle cellule con la cenere o il flash e i canali proteici fluorescenti. Infine, le immagini vengono analizzate utilizzando l'immagine J per quantificare il legame di cenere o flash alla proteina bersaglio. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'entità del legame della cenere o del flash alla proteina bersaglio nelle cellule attraverso la correlazione della fluorescenza della cenere con la fluorescenza della proteina fluorescente.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il semplice prelievo della proteina bersaglio con GFP, è che può tracciare una seconda proprietà della proteina, come il cambiamento conformazionale oltre alla sua localizzazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della sottostruttura e della funzione delle proteine, come gli eventi di polarizzazione, i cambiamenti conformazionali e gli eventi di legame LI che alterano la capacità del TAC di vietare la cenere o il flash. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo valutare quanto si formasse il piccolo poligamo submicroscopico di met Huntington nelle cellule.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di analisi dei dati sono difficili da imparare perché sono tecnicamente complesse Dimostrazione delle procedure sperimentali. I passaggi da uno a tre saranno Yasmin Ranson, un'assistente di ricerca del nostro laboratorio, che dimostrerà l'analisi dei dati. La quarta fase sarà Sevki GaN, uno studente laureato del nostro laboratorio che utilizza metodi di coltura cellulare standard per la tua linea cellulare di interesse e un vetrino per l'imaging di cellule vive pronto per la trasfezione.

Prepara una coltura di cellule aderenti e trasfetta il tuo plasmide contenente il gene tag TC di interesse. Secondo un metodo di trasfezione scelto, è importante avere controlli positivi e negativi in modo da valutare l'entità del legame specifico ai tag TC, nonché per valutare il flusso di fluenza tra i canali durante la raccolta di micrografie confocali. Pertanto, per due colori, assicurarsi che i campioni siano preparati per i singoli colori, sia la proteina fluorescente da sola che, se possibile, una proteina T ctech legata alla carne o vs.Ma

senza una proteina fluorescente. Uno o due giorni dopo la trasfezione, sciacquare delicatamente le cellule con 300 microlitri di soluzione salina di Hank's Balance prebellica o HBSS, preparare un fresco preriscaldamento HBSS con 10 micromolari, uno, due, et Ethan dia tiolo o EDT e un flash micromolare o cenere. E dopo aver rimosso l'HBSS dalle cellule, sostituirlo delicatamente con 300 microlitri di mezzo di cenere, incubare per esattamente 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale.

Nella nostra esperienza, tempi di incubazione più lunghi aumentano significativamente la fluorescenza di fondo. Aspirare delicatamente la soluzione di marcatura dalle cellule e sostituirla con 300 microlitri di HBSS preriscaldato con 250 micromolari, due tre dimeri, cap propanolo o BAL per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la soluzione di lavaggio mediante aspirazione delicata e sostituirla con 300 microlitri di prewarm HBSS.

Dopo questo lavaggio, le cellule possono essere fissate con l'altezza della paraforma, anche se abbiamo scoperto che questo aumenta la fluorescenza cinica non specifica. Quindi, di solito immaginiamo che le celle vivano a temperatura ambiente. Inoltre, la fissazione delle cellule prima della marcatura impedisce il legame del colorante biale.

Per iniziare l'imaging delle cellule al microscopio confocale, impostare i parametri per l'imaging dei singoli fluorofori e assicurarsi che vi sia un sanguinamento trascurabile tra i canali. Quindi, regolare le impostazioni del moltiplicatore di foto in modo che la fluorescenza massima nel campione non saturi il rivelatore. Una volta determinate le migliori impostazioni di imaging, non modificarne nessuna tra i campioni.

Utilizzare una velocità di scansione di 200 hertz, raccogliere quattro medie di linea e impostare il diametro del foro stenopeico su un'unità di area. Il diametro del foro stenopeico può essere espanso se il rapporto segnale/rumore è un problema. Tuttavia, ciò potrebbe comportare una perdita di risoluzione dell'imaging.

Se possibile, raccogli le immagini confocali in un formato a 12 bit o superiore. Massimizzare la qualità dell'analisi quantitativa dei dati. Raccogli immagini per il canale proteico fluorescente e anche per il canale del die dell'arsenale BI per tutti i campioni.

Per analizzare i dati, utilizzare il software Image J con i seguenti plug-in. Se si utilizza una versione dell'immagine J precedente alla versione 1.32 C, fare clic sulle seguenti opzioni. Per abilitare l'apertura di più immagini contemporaneamente, modificare le opzioni input slash output, fare clic sulla casella per utilizzare j file chooser per aprire la condivisione slash.

Fare clic su OK. Apri le immagini di interesse. L'immagine J definirà automaticamente l'intensità massima e minima dei pixel che vengono visualizzate sullo schermo per ciascuna immagine separatamente, poiché immagini diverse avranno intensità di pixel diverse.

Ciò significa che le immagini visualizzate non sono confrontabili con quelle visualizzate. Per garantire che le immagini aperte siano tutte sulla stessa scala, definire fisicamente l'intensità dei pixel superiore e inferiore da visualizzare. Per impostare questi valori, scegliere l'immagine, regolare il contrasto della barra di luminosità.

Fare clic su imposta, definire i valori minimo e massimo visualizzati. Quindi scegli Propaga a tutte le immagini aperte e fai clic su OK. In alternativa, posiziona tutte le immagini per un particolare canale insieme in un unico file o pila.

L'immagine J regolerà quindi automaticamente tutte le immagini alla stessa scala. Per fare ciò, scegli le pile di immagini, le immagini da impilare, inserisci un nome comune a ciascun file e scegli i titoli utilizzati come etichette. Fare clic su OK.

Converti tutte le immagini aperte a otto bit per l'analisi. Scegliendo il tipo di immagine a otto bit, questo ridimensionerà l'intervallo di visualizzazione in un intervallo da zero a 255. È importante non salvare il formato originale a 12 bit o superiore in quanto ciò perderà il contenuto informativo.

Salva una copia in una nuova cartella chiamata convertita a otto bit utilizzando l'opzione Salva con nome. Un metodo per esaminare l'entità del legame del dado bi arsal in un'intera immagine consiste nell'eseguire un grafico di correlazione dell'intensità dei pixel. Questo traccia ogni valore di pixel in un canale rispetto al valore di pixel corrispondente in un secondo canale.

Quindi, una posizione di pixel ad alta fluorescenza GFP sarà anche ad alta fluorescenza di cenere se c'è un alto legame. Per analizzare la correlazione dei pixel, assicurati che le immagini REA e GFP a otto bit siano aperte nell'immagine J.Successivamente, apri il plug-in del correlatore di immagini scegliendo il correlatore di immagini dei plug-in. Assegna i file immagine all'immagine uno e all'immagine due.

Quindi fare clic su OK. La pila risultante potrebbe non visualizzare informazioni dettagliate. E 'normale.

Salvare lo stack in una nuova cartella denominata scatterplot e assegnargli lo stesso nome file dell'esempio a cui si riferisce. Ad esempio, grafico di correlazione Ash GFP. Per visualizzare i dati, scegliere una delle due opzioni.

Innanzitutto, trasforma i dati in modo che siano un formato di registro scegliendo process math log auto. Quindi, per ridimensionare visivamente i dati, fare clic sull'immagine, regolare la luminosità, slash, contrast e selezionare auto. In secondo luogo, ridimensionare visivamente i dati per mostrare solo i valori bassi e visualizzare i dati utilizzando una tabella di ricerca speciale o LUT per creare una LUT personalizzata.

Clicca su immagine colore modifica LUT per una LUT molto semplice. Fare clic sul pixel in alto a sinistra e scegliere il colore nero. Quindi seleziona il pixel successivo a destra e scegli il colore rosso.

Quindi, fai clic sul terzo pixel e, tenendo premuto il pulsante del mouse, trascina la selezione sul pixel in basso a destra. Selezionare il colore rosso, fare clic su OK, quindi selezionare il colore bianco e fare clic su OK. Selezionare l'intervallo di contrasto della barra di luminosità da zero a 255 come descritto in precedenza per bloccare l'immagine a quella mostrata sullo schermo.

Convertilo in formato RGB per copiare e incollare le immagini in altri programmi. Innanzitutto, apri le immagini a otto bit o a 16 bit come descritto in precedenza. Assegna una combinazione di colori LUT alle immagini per GFP.

Assegna la LUT verde facendo clic sull'immagine. Guarda i tavoli in verde. Infine seleziona l'immagine da copiare e copiala negli appunti Scegliendo modifica copia nel sistema, questa figura mostra un risultato tipico per la calza chinasi fusa, la GFP e un tag TC che è stato colorato per 30 minuti.

Con ASH in cellule HEC 2 9 3, sembra che ASH si leghi in modo efficiente alla proteina bersaglio che trasporta un tag TC con elevata affinità. Al contrario, questa figura mostra il corrispondente campione di controllo di SARK fuso con GFP, ma privo del tag TC, che è essenziale per verificare sia la specificità del tag TC che il livello di colorazione di fondo. Questo risultato mostra che l'RH non ha reattività con la proteina bersaglio, mancando il tag TC, che indica la specificità del tag TC per il legame SSH.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non permettere alle cellule di essere confluenti e calme, poiché ciò influirà sul legame V nelle cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare semplicemente i tuoi dati quantitativamente e puoi perfezionare questi metodi per sviluppare il tuo IUTS unico per la visualizzazione dei dati.