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0 visualizzazioni • 2:32 min. • April 30th, 2023
Gli esosomi sono vescicole sferiche nanozzate racchiuse da un doppio strato lipidico contenente DNA, RNA e molecole proteiche presenti all'interno del lume.
Per visualizzare la struttura dell'esosoma utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, o TEM, iniziare prendendo un blocco di esosomi, un blocco di matrice solida contenente gli esosomi incorporati. Utilizzando un ultra-microtomo, ottenere sezioni ultrasottili del blocco dell'esosoma.
Raccogliere la sezione dell'esosoma su una griglia adatta e lasciarla aderire alla superficie. La griglia fornisce un supporto stabile al campione di esosoma per le successive fasi di colorazione.
Quindi, posizionare la griglia su una goccia di acetato di uranile - una macchia di metallo pesante - e incubare per la durata desiderata. Gli ioni uranile interagiscono con i lipidi, le proteine, il DNA e gli RNA presenti negli esosomi.
Successivamente, colorare la sezione dell'esosoma con citrato di piombo, che si lega anche alle biomolecole esosomiali. Il citrato di piombo si lega debolmente agli ioni uranile pre-legati e migliora il contrasto sullo sfondo durante l'imaging.
Osservare gli esosomi doppiamente colorati utilizzando TEM. La TEM focalizza il fascio di elettroni sul campione di esosoma. Le regioni colorate nell'esosoma disperdono gli elettroni più fortemente rispetto alle regioni non colorate.
L'apertura dell'obiettivo filtra questi elettroni altamente dispersi. Pertanto, gli esosomi contenenti biomolecole colorate appaiono più scuri dello sfondo.
Utilizzando un ultra-microtomo, preparare sezioni con uno spessore di 60 nanometri. Posizionare le sezioni su una griglia di nichel e colorare due volte alcune di esse con acetato di uranile al 2% per 20 minuti, seguito da citrato di piombo per 10 minuti. Quindi, posizionare la sezione colorata in un microscopio elettronico a trasmissione e visualizzare il campione utilizzando 80 kV e seguire le impostazioni automatiche per il tempo di esposizione. Con un'immagine dell'esosoma in vista, acquisire e salvare l'immagine utilizzando il software del microscopio.