Ingegneria Cell-permeabile proteine
28 dicembre 2009
Trasduzione proteina consente la fornitura diretta di proteine biologicamente attive nelle cellule. A differenza dei metodi tradizionali come la transfezione di DNA o di trasduzione virale questo non invasivo consente paradigma altamente efficiente manipolazione cellulare in modo titolabile eludere tossicità cellulare e il rischio di trasformazione oncogena permanente da modificazione genetica.
La manipolazione della funzione cellulare può essere ottenuta attraverso gli approcci classici della trasfezione del DNA o della trasduzione virale negli ultimi 15 anni. Si è evoluto un altro metodo. La proteina biologica attiva di trasduzione della proteina può essere consegnata direttamente nelle cellule di mammifero utilizzando piccoli peptidi fusi alla proteina di interesse, che ne promuove l'assorbimento cellulare.
Poiché non viene utilizzato DNA, si previene il rischio di agenesia da sforzo. In contrasto con i metodi classici sopra menzionati. La trasduzione delle proteine consente la consegna delle proteine in modo titolabile.
Inoltre, possono essere modulate popolazioni di piccole cellule e cellule non in divisione, come i neuroni post-mitotici. Per esprimere la proteina ricombinante in modo efficiente, si consiglia l'uso del sistema vettoriale Paciz. Si tratta di un sistema vettoriale modulare costituito da un terminale terminale e da una variante terminale C.
Entrambi i vettori consentono l'inserimento facile del gene di interesse per i mezzi di purificazione. È integrato un tag di istidina e un dominio di trasduzione proteica. Nel nostro caso, toccare con mano il virus HI che promuove l'assorbimento cellulare per la distribuzione cellulare.
Un segnale di localizzazione nucleare completa il vettore per motivi di controllo, i tag di fusione possono essere semplicemente rimossi. Inoltre, la disposizione di questi tag può avere una grande influenza sulle proprietà delle proteine di fusione. L'influenza sulla resa e sulla purezza, nonché sulla vendibilità e sulla funzione biologica, non è prevedibile.
Ciao, mi chiamo Bernard Mus e lavoro nel gruppo di Ingegneria delle Cellule Staminali presso l'Istituto di Neurobiologia Ricostruttiva di Bond, in Germania. Ciao, mi chiamo Christoph P e sono anche un membro dell'in Hoover Lab. Il nostro gruppo di lavoro sfrutta intensamente la tecnica di trasduzione delle proteine per veicolare direttamente la proteina attiva biologica in varie cellule di mammifero, e oggi vogliamo guidarvi attraverso il processo di espressione e purificazione in e da e coli.
Successivamente, vorremmo mostrarvi come applicare la proteina di fusione permanente cellulare in coltura cellulare per esemplificare l'intera procedura di espressione, purificazione e applicazione. Utilizziamo la ricombinazione sito-specifica Cree per modificare geneticamente le cellule staminali oniche di topo. Ok.Okay. Iniziamo.
Per inoculare la coltura notturna, utilizziamo batteri già trasformati conservati in uno stock di glicerolo a meno 80 gradi centigradi. Questi batteri contengono già il vettore che codifica per la ricombinazione dei decre. Usando una punta di piper, graffiamo una piccola quantità di batteri sulla punta del piper e la lasciamo cadere nel becher contenente la coltura notturna.
La coltura notturna consiste in terreni LB integrati con glucosio a una concentrazione finale di oh 0,5% e 50 microgrammi di insulina carbonica per ml. Il becher viene quindi inserito in un'incubatrice funzionante a 37 gradi centigradi per l'espressione del Cree Recombinate sito-specifico. Stiamo utilizzando i media prebellici per la TBC per la nostra cultura dell'espressione su larga scala.
Per velocizzare l'espressione, si consiglia l'uso di terreni TB riscaldati fino a 37 gradi centigradi, che rappresentano la temperatura durante l'espressione della proteina ricombinante. Successivamente, aggiungiamo glucosio al terreno di coltura per la TB a una concentrazione finale di oh 0,5%Il glucosio impedisce un aumento dell'espressione basale della proteina di fusione durante la crescita della coltura di espressione prima dell'induzione. Infine, l'ampicillina viene aggiunta alla coltura di espressione ad una concentrazione finale di 100 microgrammi per ml per garantire una coltura pura contenente solo i batteri che ancora ospitano il plasmide che codifica per la proteina decreto.
Ora possiamo ottenere la nostra coltura notturna e inoculare la coltura di espressione in un rapporto di uno a 50. I bicchieri vengono poi trasferiti in un'incubatrice funzionante alla temperatura di 37 gradi centigradi. È necessario prelevare campioni per misurare la densità ottica su base regolare durante l'espressione.
Non appena la coltura ha raggiunto una densità ottica di 1,5, i batteri vengono indotti con una concentrazione finale di 0,5 millimolari di IPTG. Dopo un'ora di induzione, la coltura di espressione viene trasferita in tubi e successivamente raccolta tramite centrifugazione. A tale scopo, utilizziamo un rotore SLA 3000.
La centrifuga funziona a una velocità di 5.000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi anterogrado. La trappola viene quindi scartata e il pellet batterico può essere conservato a tempo indeterminato a meno 20 gradi centigradi. I pellet congelati vengono risospesi in lizza buffer, un appellato corrispondente a un litro di coltura di espressione.
Usiamo 10 ml di tampone lizza, aspettiamo circa 15 minuti fino a quando la soluzione diventa omogenea. Viene quindi aggiunto un milligrammo di lisozima per ogni ML di sospensione. La soluzione viene miscelata per 20 minuti per consentire all'enzima di aprire i batteri.
Successivamente, Benson Nase viene aggiunto in una diluizione da uno a 1000 per altri 15 minuti, che taglierà il DNA risultando in una soluzione non viscosa. Infine, viene utilizzato un sonatore per garantire la lisi delle cellule. Il programma è in esecuzione per un minuto e mezzo con una potenza del 45% dopo il completamento della certificazione.
Ricordati di prendere un campione di ogni passaggio qui, il lisato grezzo o l'analisi della pagina SDS della purificazione. Ora è davvero importante aggiungere un ml di tampone TSB ghiacciato per ML di sospensione, poiché la proteina del decreto tenderà a precipitare all'interno dello stock di glicerolo. Se hai intenzione di saltare questo passaggio, la soluzione viene miscelata a breve e il grezzo è ora pronto per la centrifugazione.
A tale scopo, utilizziamo un rotore SS 34. La centrifuga funziona a 17.000 giri/min per 30 minuti a quattro gradi centigradi. Al termine, centrifuge Inc ha trasferito con cura il surnatante S in provette Falcon fresche da 50 ml.
Ora aggiungi il liquame di nichel anti A al nichel surnatante. Anti A è un reagente cruciale per la corretta purificazione delle proteine di fusione histidine tech. L'istidina forma un complesso con gli ioni di nichel che consentono la purificazione dell'affinità, ora agitare delicatamente i tubi di parcheggio per 60 minuti a 40 gradi centigradi.
Dopo un'ora, è ora possibile applicare la sospensione su colonne da 20 ML e lasciare che la soluzione scorra attraverso il flusso per gravità. Per produzioni su larga scala, è possibile dividere la sospensione su più colonne. Successivamente laviamo la colonna due volte con un tampone contenente 15 millimolari di soletta interna.
La quantità di tampone applicata dipende dal volume della resina. Due MLS di nichel NTA corrispondono a un ml di resina per i mezzi di lavaggio. Mettiamo cinque volumi di resina di tampone di lavaggio sulla colonna dopo il lavaggio, ora siamo pronti per eludere le nostre proteine.
Pertanto, utilizziamo un tampone di eluizione con una concentrazione di 250 millimolari di immuno. Quindi nota come il colore della resina cambia verso il verde. A causa delle alte concentrazioni di proteina CRE, la frazione OID a volte diventa secca.
Per evitare ciò, mescolare la soluzione e aggiungere ulteriore tampone di lis, tutte le frazioni vengono ora raggruppate e successivamente trasferite in un tubo di lisi. La lisi rimuoverà il primo passaggio del dializzatore eseguito contro il tampone contenente un'alta concentrazione di sale. Dopo un'ora, il tampone ad alto contenuto di sale viene sostituito e la procedura di dialisi viene applicata durante la notte.
Il giorno successivo, il tubo della dialisi viene estratto dal tampone ad alto contenuto di sale e trasferito in un tampone di glicerolo. Dopo tre-cinque ore, il tampone glicerolo viene sostituito e le dialisi vengono nuovamente eseguite durante la notte. La lisi contro il tampone glicerolo si tradurrà in una soluzione madre concentrata almeno tre volte.
La soluzione madre può ora essere conservata a meno 20 gradi centigradi per diversi anni senza perdita di attività Per garantire la qualità, è possibile caricare i campioni di pagina SDS raccolti su un gel e colorarli successivamente. Per Kamasi, la proteina di fusione Cree è rilevabile come una banda prominente nella frazione OID. Per utilizzare la concentrazione appropriata di ricombinazione dell'equipaggio, è necessario determinare la concentrazione tramite il saggio di Redford.
Come applicare proteine così permanenti nelle cellule di mammifero. Prima di tutto, prepara le tue cellule bersaglio per ottenere la massima efficienza di trasduzione delle proteine. Guarda le cellule monostrato alla densità risultante nello strato cellulare di confluenza dall'80 al 90% il giorno successivo nel caso in cui le tue cellule target siano cellule sì, che vengono coltivate in colonie compatte.
Separare le cellule e somaticamente e vederle in una sospensione di una singola cellula con cinque ore di anticipo. È importante realizzare una sospensione di una singola cellula prima della trasduzione delle proteine, perché altrimenti possono essere trasfuse solo le cellule d'aria sulla superficie di una colonia. Aspira ai media e guarda brevemente le celle d'aria con PPS prima di provare il trattamento.
Rimuovere il siero rimanente Sì, grossolano. Dopo aver aspirato il PPS, sovrapporre le cellule con gocciolamento e lasciarle incubare da tre a cinque minuti. Ora controlla con il microscopio se tutte le colonie sono disciolte in singole cellule.
Per le ragioni appena citate, questo è un passaggio cruciale per la trasduzione delle proteine nelle cellule yes. Trasferire le cellule staccate in una provetta. Posizionare la provetta in un tavolo, centrifugare e far girare le celle verso il basso, aspirare il super agente e risospendere la cella.
Il P nei terreni di crescita diluisce le cellule in un numero di cellule appropriato. Questo, naturalmente, dipende dalle dimensioni della coltura tissutale. Incubare le celle d'aria in discarica per altre cinque ore.
Questo darà alle celle d'aria abbastanza tempo per attaccarsi al fondo e crescere aderenti. Le file di tre classi possono essere conservate a meno 20 gradi per più di due anni. Quando si lavora con la proteina di fusione permanente delle cellule ricombinanti, è molto vantaggioso avere una soluzione madre che può essere utilizzata su richiesta.
Mentre si attende che le cellule si attacchino al piatto, si può preparare il mezzo di trasduzione C semplicemente diluire un volume appropriato di proteina di scorrimento permanente cellulare dal ceppo di colesterolo in se stessi. Media. Poiché la soluzione madre Clare non è ancora sterile, i trans devono essere filtrati in modo sterile prima della loro applicazione. Si consiglia di utilizzare una siringa che può essere avvitata su un filtro legante le proteine del lobo.
La concentrazione finale del torrente dipende dal tipo di cellula o dagli integratori di terreni. Ad esempio, il siero ha una forte influenza negativa sull'efficienza di trasduzione. Questo può essere superato utilizzando terreni privi di siero o aumentando la concentrazione nel torrente.
Troviamo la condizione ottimale che consente la massima efficienza di ricombinazione. Concentrazione del decreto di idrato a partire da oh 0,5 fino a 10 micromolari. Si consiglia di testare diversi tempi di incubazione, tra le sei e le 18 ore.
Dopo cinque ore di incubazione, estrarre le cellule bersaglio e aspirare i terreni incrociati. Successivamente, lo sostituiamo con mezzi di trasduzione delle proteine, rimettiamo le cellule d'aria nell'incubatore dopo l'incubazione notturna. Ha lavato brevemente le cellule D con PPS e ha cambiato il terreno di trasduzione delle proteine in terreno ES normale.
48 ore dopo l'incubazione della cellula, l'espressione genica permanente dello sfiato Cree può essere rilevata tramite xul. Le cellule colorate con fenotipo bega positivo sono state geneticamente modificate con successo mediante la ricombinazione sito-specifica. Cree il rapporto.
Le cellule ospitano il costrutto LAE utilizzato da CRE dopo la ricombinazione pre-mediata. Viene asportata una sequenza di arresto del fianco P e viene attivato un gene reporter di lusso guidato dal promotore del team. Per valutare l'efficienza di ricombinazione nelle celle d'aria reporter pretrattate, le celle devono essere fissate.
Aspirare due volte le celle di lavaggio del terreno con le celle di rivestimento PBS con PFA al 4% e incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente lavare nuovamente le celle tre volte con PBS. Dopo aver aspirato il PBS dall'ultima fase di lavaggio con la soluzione Xal Stain ai pozzetti, incubare le cellule per una notte a 37 gradi in un incubatore.
Il giorno successivo, l'attività di Beal può essere monitorata dalle cellule del colletto blu. L'efficienza della ricombinazione può essere determinata dal numero di colonie blu. In condizioni ottimali, dovresti essere in grado di raggiungere un'efficienza di ricombinazione superiore al 90%Bene, oggi ti abbiamo mostrato come esprimere e purificare la ricombinazione di query sito-specifiche da e coli.
In questo studio di prova di principio, siamo stati in grado di indurre la ricombinazione nella maggior parte dei sali. Ok, questo è tutto. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.I.
Panoramica
Questo articolo discute la trasduzione proteica come metodo per consegnare proteine biologicamente attive direttamente nelle cellule di mammiferi. A differenza dei metodi tradizionali come la trasfezione del DNA, la trasduzione proteica è non invasiva e permette una efficiente manipolazione cellulare senza i rischi associati alla modificazione genetica permanente.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ingegneria proteica
Sfondo
- I metodi classici per la manipolazione cellulare includono la trasfezione del DNA e la trasduzione virale.
- La trasduzione proteica utilizza piccoli peptidi per migliorare l'assorbimento cellulare delle proteine.
- Questo metodo è particolarmente utile per le cellule non in divisione, come i neuroni post-mitotici.
- Il sistema vettoriale Paciz è raccomandato per l'espressione efficiente di proteine ricombinanti.
Scopo dello studio
- Dimostrare il processo di espressione e purificazione delle proteine in E. coli.
- Illustrare l'applicazione di proteine di fusione cellulare permanente nella coltura cellulare.
- Esplorare l'uso della ricombinazione sito-specifica per la modificazione genetica delle cellule staminali.
Metodi utilizzati
- Inoculazione di colture notturne da batteri trasformati.
- Utilizzo di media LB e TB per l'espressione proteica.
- Induzione dell'espressione proteica utilizzando IPTG.
- Purificazione delle proteine utilizzando la cromatografia di affinità al nichel.
Risultati principali
- Espressione riuscita di proteine ricombinanti in E. coli.
- Purificazione efficiente di proteine di fusione marcate con istidina.
- Dimostrazione della trasduzione proteica nelle cellule di mammiferi.
- Approfondimenti sull'influenza dei tag di fusione sulle proprietà delle proteine.
Conclusioni
- La trasduzione proteica è un'alternativa praticabile ai metodi tradizionali di modificazione genetica.
- Il sistema vettoriale Paciz facilita l'espressione e la purificazione efficiente delle proteine.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per ottimizzare le proprietà delle proteine di fusione per applicazioni specifiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Protein transduction enables direct delivery of functional proteins into mammalian cells without genetic modification, offering a titratable and reversible approach for target validation in early discovery. This method supports mechanistic de-risking by allowing rapid interrogation of protein function in disease-relevant systems, including non-dividing cells such as neurons. It provides a scalable platform for assay development and phenotypic screening where genetic tools are limited or undesirable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of target proteins through direct delivery, supporting hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Provides a titratable system to modulate protein activity in a controlled, dose-dependent manner.
- Predictive Value: Reduces reliance on overexpression artifacts, improving confidence in target engagement and phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively measurable outputs such as recombination efficiency, enabling robust assay readouts for compound or modulator screening.
- Operational Value: Utilizes standardized purification via histidine tag and nickel affinity chromatography, ensuring reproducibility across batches.
- Scalability: Supports large-scale expression in E. coli using TB media and IPTG induction, facilitating consistent reagent supply for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers active Cre recombinase to validate loxP-based reporter systems, enabling preclinical assessment of genetic modification efficiency.
- Disease-Relevant System: Effective in post-mitotic neurons and primary cells, supporting target validation in neurologically relevant models.
- Mechanistic De-risking: Allows temporal control of protein activity to distinguish on-target effects from compensatory mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a chemically inducible, non-genetic tool for target validation, bridging recombinant protein production with functional cellular assays in a scalable format.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein function through direct delivery and intracellular activity measurement.
- Screening: Enables standardized, reproducible protein preparation for high-confidence screening of modulators or genetic backgrounds.
- Analytics: Generates quantitative functional readouts (e.g., recombination efficiency via blue-white screening) to compare conditions and guide decision-making.
- Translational Research: Connects in vitro recombination efficiency to preclinical genetic modification outcomes in stem cell models.
- Enterprise Reuse: The Paciz vector system and purification protocol establish a reusable platform for producing diverse cell-permeable proteins across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by avoiding genomic integration and enabling acute, reversible protein modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, purified recombinant protein with consistent activity, reducing variability in functional assays.
- Strategic Value: Increases go/no-go decision accuracy by providing direct functional evidence of target engagement in complex cellular environments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant, non-dividing cell types.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, purification, and mammalian cell culture for transduction assays.
- Dependent on nickel-affinity chromatography infrastructure and access to IPTG, TB media, and protease inhibitors for lysis.
- Necessitates standardization of transduction conditions (e.g., protein concentration, incubation time) across cell types due to serum sensitivity and variable uptake efficiency.
- Requires optimization of fusion tag arrangement (e.g., TAT, NLS, His-tag) to balance solubility, yield, and biological activity.
- Limited by the need to empirically determine active concentration and incubation duration for each target protein and cell type.
