Saggio di impedenza basato su array a tre camere: una tecnica di analisi in tempo reale per valutare il potenziale invasivo delle cellule tumorali misurando l'impedenza elettrica

Le cellule stromali associate al cancro secernono fattori chimici che possono innescare le cellule tumorali metastatiche che risiedono sulla membrana basale del tessuto. Di conseguenza, le cellule tumorali invadono la membrana basale e migrano verso lo spazio extracellulare del tessuto.

Per misurare la capacità invasiva delle cellule tumorali in vitro, iniziare con una piastra multipozzetto con più array a tre camere. In ogni array, la camera inferiore ha una coltura aderente di cellule stromali. La camera superiore con microelettrodi fusi per la misurazione dell'impedenza - elettrodi miniaturizzati che misurano l'attività elettrica di una cellula - è ricoperta da cellule tumorali, che aderiscono alla membrana microporosa rivestita di matrice extracellulare presente sopra gli elettrodi.

Durante l'incubazione su un analizzatore basato sull'impedenza, le cellule stromali rilasciano fattori chemiotattici nel mezzo, che si muovono verso le cellule tumorali. Questi fattori si muovono attraverso la membrana semipermeabile presente nella parte inferiore della camera centrale.

I fattori secreti dalle cellule stromali segnalano alle cellule tumorali aderenti di trasformarsi in fenotipi invasivi. In risposta, le cellule invasive migrano attraverso la membrana microporosa raggiungendo gli elettrodi interdigitati sul lato opposto della membrana.

Nel corso del tempo, man mano che più cellule tumorali si attaccano agli elettrodi, causano impedenza cellulare, ovvero un ostacolo al flusso di corrente da parte delle cellule. La misurazione dell'impedenza cellulare è indicativa del potenziale invasivo delle cellule tumorali.

Posizionare tutte e tre le camere sterili nella cappa di coltura tissutale. Individuare la manopola sul lato corto della camera inferiore e orientare la camera inferiore in modo che la manopola sia rivolta verso lo sperimentatore.

Aggiungere da 30.000 a 50.000 cellule in 90 microlitri di terreno in ciascun pozzetto dalla camera inferiore senza formare bolle. Utilizzare il 5% di terreni integrati con siero fetale bovino in due camere inferiori come controllo positivo per la motilità cellulare e utilizzare lo 0% di terreni integrati con siero come controllo negativo.

Ruotare la camera inferiore di 90 gradi dopo averla lasciata riposare per 10-15 minuti nella cappa. Quindi, posizionare la camera centrale in alto, in modo che la manopola sulla camera inferiore scivoli nella tacca sulla camera centrale. Spingere la camera verticalmente verso il basso, fino a quando non si sente un clic da ciascuno dei lati lunghi del gruppo.

Aggiungere 160 microlitri di terreno privo di siero a tutti i pozzetti della camera centrale. Assicurarsi che un menisco a forma di cupola sia visibile dopo che i pozzetti sono stati riempiti e posizionare la camera superiore, con gli elettrodi rivolti verso il basso, sulla camera centrale per allineare i punti blu sulla camera centrale e superiore. Spingere la camera verticalmente verso il basso finché non si sente un clic da ciascuno dei lati lunghi del gruppo.

Aggiungere da 20 a 50 microlitri di terreno privo di siero nella camera superiore. Montare il gruppo sull'analizzatore cellulare a doppia funzione nell'incubatore per colture tissutali e attendere 30 minuti prima di misurare il fondo.

Aprire il software dell'analizzatore di celle, quindi selezionare la base da utilizzare, quindi fare clic sulla scheda "Messaggio" e assicurarsi che sia indicato "Connessioni OK" per assicurarsi che l'array sia ben posizionato nella base e che gli elettrodi siano ben allineati con i sensori.

Fai clic sulla scheda "Note dell'esperimento" e inserisci tutte le informazioni possibili sull'esperimento. Quindi, fai clic sulla scheda "Layout" e inserisci la descrizione del layout dell'array. Quindi, fai clic sulla scheda "Programma" e aggiungi due passaggi dal menu "Passaggi"; un passaggio in background con uno sweep e un passaggio di test con 100 sweep.

Una volta che l'array è rimasto nell'incubatore dell'analizzatore di cellule a doppia funzione per 30 minuti, fare clic sul pulsante "Riproduci" per avviare la misurazione in background.

Al termine della misurazione di fondo, rimuovere l'array dalla base e riposizionarlo nella cappa di coltura cellulare. Quindi, aggiungere da 30.000 a 50.000 cellule in 100 microlitri di terreno privo di siero in ciascun pozzetto della camera superiore. Queste sono le cellule che l'elettrodo rileverà una volta che migreranno con successo attraverso la membrana.

Lasciare riposare il gruppo nella cappa per 30 minuti prima di montarlo sull'analizzatore di celle a doppio uso per la misurazione dell'impedenza.

Riposizionare l'array nell'analizzatore di celle a doppio uso e controllare la scheda "Messaggio" per il messaggio "Connessioni OK". Fare clic sul pulsante "Riproduci" per avviare la misurazione dell'impedenza, quindi fare clic sulla scheda "Traccia" per monitorare l'andamento del segnale.

Se l'endpoint viene raggiunto prima di 25 ore, fare clic sul passaggio "Interrompi" dal menu a discesa "Esegui". Per esportare i dati, fai clic con il pulsante destro del mouse sul grafico, scegli "Copia" nel formato elenco, quindi incolla i dati in un foglio di calcolo.