Saggio di perdita di fluorescenza per studiare l'interazione del peptide che penetra nelle cellule con la membrana

I peptidi che penetrano nelle cellule, CPP, peptidi corti e caricati positivamente, possono interagire e attraversare le membrane cellulari, facilitando la consegna di carichi impermeabili alle cellule.

Per studiare il potenziale di permeabilizzazione della membrana di un test CPP in vitro utilizzando un imitatore della membrana cellulare, iniziare con una grande vescicola unilamellare, LUV, sospensione.

I LUV comprendono un doppio strato fosfolipidico caricato con una sonda fluorescente impermeabile alla membrana e una corrispondente coppia di quencher. All'interno delle vescicole, il quencher interagisce con la sonda fluorescente a causa della loro vicinanza, causando il quencing della fluorescenza.

Pipettare la sospensione LUV in una cuvetta a fluorescenza al quarzo e diluire con il tampone. Aggiungi una barra magnetica. Trasferire su uno spettrofluorimetro con agitazione magnetica per prevenire la sedimentazione dei LUV durante la corsa. Determinare la fluorescenza di fondo per eliminare eventuali perdite di LUV.

Aggiungere la concentrazione desiderata di CPP alla sospensione LUV a intervalli regolari.

Sulla base dell'idrofobicità e della carica dei residui amminoacidici dei CPP, perturbano la membrana lipidica del LUV, portando alla penetrazione e alla permeabilizzazione della membrana.

Il danno alla membrana della vescicola provoca la fuoriuscita della sonda fluorescente e del quencher nella soluzione circostante, aumentando la loro separazione spaziale. Di conseguenza, la sonda mostra fluorescenza.

Un'ulteriore aggiunta di soluzione CPP porta ad un aumento della permeabilizzazione dei LUV e dell'intensità della fluorescenza. Un aumento dell'intensità della fluorescenza con l'aggiunta di CPP suggerisce il potenziale di permeabilizzazione della membrana del peptide.

Per misurare la perdita di fluorescenza, diluire i LUV in 1 millilitro di HEPES Buffer 2 in una cuvetta di fluorescenza al quarzo a una concentrazione finale di 100 micromolari e aggiungere un agitatore magnetico per facilitare l'omogeneizzazione della soluzione durante l'esperimento.

Misurare i LUV da soli durante i primi 100 secondi per valutare la fluorescenza di fondo, prima di misurare la perdita come aumento dell'intensità della fluorescenza dopo l'aggiunta di aliquote di soluzione peptidica nei successivi 900 secondi.

Per misurare la perdita di fluorescenza al 100% come controllo positivo, aggiungere 1 microlitro di Triton X-100 ai LUV per solubilizzare le vescicole, ottenendo un completo disinserimento della sonda durante gli ultimi 100 secondi dell'analisi. Quindi, usa la formula per calcolare la percentuale di perdita in ogni momento.