Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le interazioni sensibili ai detergenti tra le proteine di membrana o altre proteine. Questa procedura richiede che una proteina sia marcata con istidina e sovraespressa nelle cellule, mentre l'altra è un peptide marcato con myc. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della biochimica, importanti studi di interazione proteica.

Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di rilevare l'interazione tra le proteine di membrana in modo sensibile ai detergenti. La procedura è facile e veloce. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni proteiche di membrana, può anche essere utilizzato per studiare le interazioni proteiche deboli.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo verificare l'interazione tra le proteine di membrana, Saltilin e GLUT4, ma i tentativi di co-immunoprecipitarle dalla lisi dei mammiferi rimangono infruttuosi. Per effettuare un ordine per il peptide, selezionare la sequenza target del peptide critico per l'interazione e aggiungere un epitopo myc alla fine o al terminale C della sequenza. Una volta che il peptide è arrivato, pepare 100 microgrammi per millilitro di soluzione di lavoro del peptide in acqua ultra pura.

Seminare tre cellule pre-adipocitarie 3T3-L1 in quattro piastre di coltura da 10 centimetri e conservarle nell'incubatore. Successivamente, trasfettare due piastre di coltura con la proteina bersaglio marcata con istodina 6X ed etichettare come HISP nelle altre due piastre con due plasmidi di controllo ed etichettare come WT. Dopo la trasfezione, lasciare le cellule nell'incubatore per 48 ore per raggiungere l'80-90% di confluenza. Per preparare il lisato cellulare, lavare le cellule su ghiaccio tre volte con 10 millilitri di soluzione salina tamponata 1X raffreddata a quattro gradi Celsius.

Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi a ciascuno di essi. Quindi, staccare le cellule dai piatti utilizzando un raschietto cellulare per preparare il lisato. Trasferire il lisato cellulare preparato da ciascuna piastra di coltura in quattro provette separate da 1,5 millimetri ed etichettare tutte le provette.

Quindi, passare il lisato cellulare attraverso una siringa con ago da 26 gauge su e giù per cinque volte per la lisi cellulare totale. Quindi, centrifugare i lisati cellulari a 16000xg per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire i surnatanti in quattro nuove provette etichettate in modo identico.

Per futuri esperimenti di risoluzione dei problemi e di controllo, aliquotare 20 microlitri di lisato cellulare e conservarlo a 20 gradi Celsius. Per un uso successivo, titolare il tampone di lavaggio a PH8 con acido cloridrico per ottenere PH6 e conservare il tampone a quattro gradi Celsius. Successivamente, per preparare una sospensione omogenea delle perle di cobalto, agitare con cura la bottiglia.

Quindi, trasferire 40 microlitri di sospensione di perle di cobalto in tutte le quattro provette contrassegnate individualmente. Dopo aver aggiunto le perle di cobalto, aggiungere un millilitro di tampone di lisi alle provette. Quindi, centrifugare le provette a 1000xg per cinque secondi.

Scartare il surnatante e pipettare 40 microlitri di tampone di lisi nelle perle depositate. Quindi, trasferire il lisato cellulare nelle provette corrispondenti e incubare a quattro gradi Celsius per 90 minuti su un rotatore di provette. Dopo 90 minuti, centrifugare i campioni a 1000xg per cinque secondi.

Quindi, raccogliere il surnatante etichettato Flowthrough-1 e conservarlo a 20 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio con PH8 ai singoli tubi e risospendere delicatamente le perle. Centrifugare le provette a 1000xg per cinque secondi ed espellere i surnatanti.

Quindi, aggiungere il tampone di lavaggio con PH8 con o sei ai tubi, secondo le etichette e risospendere bene le perline. Centrifugare le provette a 1000xg per cinque secondi ed espellere i surnatanti. Preparare un microgrammo per millilitro di soluzione di lavoro del peptide e del tampone acquoso con PH6 o otto.

Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione peptidica alle perle lavate corrispondenti a un PH simile. Quindi, incubare le perle a quattro gradi Celsius su un rotatore per tubi per 30 minuti. Quindi, prendere quattro microcolonne, etichettarle e posizionare le colonne in provette di raccolta etichettate Flowthrough-2. Al termine dell'incubazione, aggiungere la miscela di incubazione alle colonne.

Lasciare che la soluzione passi attraverso la forza gravitazionale e raccogliere il campione dal flusso. Posizionare le colonne in nuovi tubi di raccolta e conservarle a 20 gradi Celsius. Quindi, passare 500 microlitri di tampone di lavaggio con PH6 o otto mediante flusso gravitazionale attraverso le singole colonne ed eliminare il flusso.

Ripeti questo passaggio quattro volte. Centrifugare le provette a 1000xg per cinque secondi. Posizionare la colonna nella nuova provetta di raccolta etichettata Elution.

È importante lavare le perle in tutti i tubi con molta attenzione e allo stesso modo per eliminare il peptide non legato. Alle perle lavate, aggiungere 40 microlitri di tampone per campioni di tricina con beta mercaptoetanolo. Lasciate riposare per 20 minuti a temperatura ambiente.

Centrifugare la colonna a 8000xg per due minuti. Scartare le colonne e riscaldare i tubi di raccolta a 100 gradi Celsius per 10 minuti. E poi, centrifugalo a 1000xg per cinque secondi.

In alternativa, aggiungere 40 microlitri di tampone Elution Imidazole alle perle lavate e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare le provette a 8000xg per due minuti. Scartare le colonne e aggiungere un campione di tricina da 40 microlitri.

Riscaldare le provette di raccolta a 100 gradi Celsius per 10 minuti, quindi centrifugarle a 1000xg per cinque secondi. Utilizzare i gel gradienti di tricina al 10-20% disponibili in commercio. Utilizzare il tampone di corsa Tris/Tricine/SDS, quindi caricare 20 microlitri ciascuno dei campioni eluiti e i lisati totali sul gel e iniziare a far funzionare l'unità di elettroforesi.

Una volta terminata l'elettroforesi, utilizzare un tampone di trasferimento integrato con il 20% di metanolo per trasferire il materiale dal gel su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 micrometri. Dopo aver bloccato la membrana, tagliarla orizzontalmente. Quindi, sonda la parte superiore della membrana con l'anticorpo Anti His P nella metà inferiore della membrana con anti myc.

Per studiare l'interazione tra la sortilina immobilizzata sulle perle di cobalto in GLUT4, è stata eseguita l'analisi immunoblot. I lisati cellulari e gli eluati sono stati ottenuti in cellule 3T3-L1 wild type e trasfettate con Sortilin-myc/His-tagged e quindi caricate sulla pagina SDS. Il blot è stato sondato con anticorpi anti-myc.

Il blot mostra un 110 kilodotin Sortili-myc/His-tagged e cinque kilotin myc-first luminal loop-GLUT4 dagli eluati trasfettati. Successivamente, per studiare l'importanza del PH e l'interazione tra la sortilina immobilizzata su perle di cobalto e GLUT4, è stata eseguita l'analisi immunoblot. In questo saggio, l'ansa luminale GLUT4 di Myc-first è stata incubata con perle immobilizzate con proteine marcate con Sortilin-myc/His-tagged sia a PH6 che a otto.

Il blot mostra una chiara interazione tra Sortilin-myc/His e myc-first luminal loop GLUT4 sia a PH6 che a otto dagli eluati ottenuti dalle cellule 3T3-L1 trasfettate con Sortilin-myc/His-tagged. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore fino a quando i campioni non sono pronti per l'analisi del sangue occidentale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di progettare un peptide solubile, preferibilmente in acqua.

Per rafforzare i risultati, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoprecipitazione dopo la reticolazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare le proteine di membrana e le interazioni proteiche in una procedura sensibile ai detergenti. Permette anche di esplorare l'interazione tra frammenti proteici.

Jazz ritmico morbido.