Saggio colorimetrico per la quantificazione di carboidrati non strutturali in tessuti vegetali

I carboidrati digeribili sono i componenti non strutturali dei tessuti vegetali e funzionano come fonte di energia di riserva per la crescita e il metabolismo delle piante.

Per quantificare i carboidrati non strutturali, prendere una quantità misurata di tessuto vegetale in una provetta. Aggiungere acido solforico diluito alla provetta e riscaldare il campione. Dopo il riscaldamento, l'acido solforico idrolizza i polisaccaridi dei carboidrati digeribili nelle rispettive subunità monosaccaridiche.

Raffreddare il campione. Centrifugare la provetta per pellettare il materiale vegetale non digerito e ottenere un surnatante contenente i monosaccaridi.

Aspirare il surnatante in una provetta nuova e trattare i monosaccaridi con una soluzione di fenolo, seguita dall'aggiunta di acido solforico. Agitare la provetta per mescolare il contenuto e incubare.

Durante l'incubazione, l'acido solforico disidrata i monosaccaridi per produrre derivati furfurali. Questi derivati del furfurale reagiscono con il fenolo per produrre una soluzione giallo-oro.

Determinare spettroscopicamente l'assorbanza della soluzione giallo-oro a 490 nanometri, che corrisponde al contenuto di carboidrati nel campione di pianta.

Successivamente, prendi varie concentrazioni di soluzioni di glucosio e ripeti il trattamento con acido fenolo-solforico per ottenere diverse intensità di colore e traccia una curva standard. Confrontare il valore di assorbanza del campione di carboidrati sconosciuto con lo standard del glucosio per ottenere il contenuto di carboidrati digeribili nel tessuto vegetale.

Innanzitutto, pesare le repliche di ciascun campione di tessuto in provette di vetro da 15 millilitri. Etichettare le provette e registrare la massa esatta di ciascun campione.

Quindi, aggiungere 1 millilitro di acido solforico 0,1 molare a ciascuna provetta e chiudere bene i tappi. Quindi, mettere i tubi a bagnomaria bollente per 1 ora.

Trasferire i tubi a bagnomaria tiepido per raffreddarli. Quindi, versare il contenuto delle provette in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettate. Successivamente, centrifugare le provette a 15.000 g per 10 minuti. Utilizzare una micropipetta per trasferire il surnatante in nuove provette da 1,5 millilitri etichettate.

Utilizzando una pipetta, trasferire 15 microlitri di ciascun campione sconosciuto nella propria provetta. Quindi, aggiungere 385 microlitri di acqua distillata in ogni tubo.

In una cappa aspirante, aggiungere 400 microlitri di fenolo al 5% a ciascuna provetta campione standard e sconosciuta. Subito dopo, aggiungere 2 millilitri di acido solforico a ciascun tubo.

Assicurati di aggiungere l'acido solforico sulla superficie della soluzione.

Dopo aver incubato le provette per 10 minuti, agitare le provette. Quindi, incubare la provetta per altri 30 minuti.

Trasferire 800 microlitri da ciascuna provetta del campione in tre cuvette semi-micro in polistirene da 1,5 millilitri. Quindi, impostare lo spettrofotometro in modo che legga a 490 nanometri e calibrarlo con una cuvetta vuota.

Infine, far passare ogni cuvetta attraverso lo spettrofotometro e registrare l'assorbanza.