Isolamento delle cellule T basato sulla flottazione mediante smistamento cellulare attivato dalla galleggiabilità

Per isolare le cellule T, globuli bianchi essenziali per il sistema immunitario, utilizzando la selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità, BACS, prendi una sospensione di cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC. Le PBMC contengono cellule T bersaglio e cellule non bersaglio come cellule B, monociti, cellule natural killer e cellule dendritiche.

Aggiungere un tampone contenente una quantità adeguata di anticorpi anti-CD3 biotinilati e incubare per la durata richiesta. L'anticorpo si lega al complesso CD3, un complesso proteico multimerico sulla superficie cellulare, una caratteristica distintiva delle cellule T.

Aggiungere microbolle funzionalizzate - piccole particelle sferiche rivestite di streptavidina - per una selezione positiva delle cellule T legate agli anticorpi. Il nucleo di ogni microbolla è una sfera cava, che le rende particelle a bassa densità in grado di galleggiare in una soluzione acquosa.

Incubare la miscela sotto agitazione, lasciando che le microbolle e il campione si mescolino accuratamente. Durante l'incubazione, la streptavidina sulla microbolla si lega alla biotina sull'anticorpo legato alle cellule T, immobilizzando le cellule sulle microbolle.

Centrifugare la provetta. Le cellule non bersaglio si separano dalla miscela come un pellet sul fondo.

Le microbolle bersaglio legate alle cellule T rimangono a galla sulla superficie, portando alla separazione delle cellule T basata sulla galleggiabilità. Questa tecnica di separazione limita lo stress sulle cellule bersaglio. Con una pipetta sottile, rimuovere il pellet e il subnatante senza disturbare lo strato di microbolle.

Risospendere le cellule T isolate legate a microbolle in un terreno di coltura appropriato per un'ulteriore elaborazione.

Per iniziare, incubare 3 x 10⁸ PBMC ottenuti commercialmente in 2,5 millilitri di tampone di separazione con anticorpo biotinilato anti-CD3. Mescolare delicatamente i componenti mediante pipettaggio e incubarli a temperatura ambiente per 10 minuti.

Aggiungere microbolle di streptavidina alle cellule in un rapporto di 0,5 a 1, secondo le istruzioni del produttore, e mescolare utilizzando un rotatore end-over-end commerciale a 20 giri/min per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, le cellule selezionate positivamente saranno nella parte superiore della sospensione con le microbolle di streptavidina e le restanti cellule non selezionate saranno nel pellet cellulare sul fondo della provetta.

Utilizzando una pipetta di vetro da 9 pollici, inserire il puntale sotto lo strato di cella a bolle sul fondo della provetta. Aspirare il pellet cellulare e il subnatante con una pipetta elettronica e trasferirli in una nuova provetta.

Risospendere lo strato di cella a bolle rimasto nella provetta originale in 1 millilitro di terreno completo di cellule T. Centrifugare il surnatante a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e utilizzarlo per la misurazione indiretta della purezza e del recupero.