Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale

L'obiettivo generale di questo processo di funzionalizzazione della superficie del vetro è quello di consentire la cattura e il rilascio delicato delle cellule di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'angiogenesi tumorale, consentendo lo screening di biomarcatori cellulari che indicano resistenza ai farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è completamente personalizzabile, praticamente per qualsiasi tipo di cellula di interesse.

Finché c'è un anticorpo specifico per il tipo di cellula, la superficie può essere adattata per la sua cattura. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'angiogenesi del cancro, può essere applicato anche ad altre malattie poiché i campioni purificati sono necessari per lo sviluppo di regimi di trattamento più personalizzati. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando stavamo cercando di sviluppare un meccanismo di rilascio reversibile per catturare le cellule, utilizzando l'interazione tra la destiobiotina e la famiglia degli adivini.

Dopo aver pulito una superficie di vetro in una macchina al plasma a ossigeno per cinque minuti secondo il protocollo di testo, preparare 2,5 millilitri di 3-aminopropil trietossisilano ricostituito al 2%, o soluzione APTES, combinando 50 microlitri di APTES e 2,45 millilitri di etanolo in un tubo conico. Pipettare la soluzione APTES sulle superfici di vetro, quindi coprire le superfici e posizionarle su una piattaforma di agitazione a temperatura ambiente per 50 minuti per distribuire uniformemente lo strato di APTES. Nel frattempo, preriscalda il forno a 55 gradi Celsius per le piastre a otto e 24 pozzetti, o 90 gradi Celsius per le piastre di vetro.

Dopo aver rimosso le piastre dallo shaker, utilizzare l'etanolo per sciacquare le superfici in vetro secondo il protocollo di testo. Con azoto gassoso al 100%, asciugare le superfici. Quindi mettere le piastre a otto e 24 pozzetti in forno per due ore, o le piastre di vetro in forno per un'ora.

Successivamente, preparare 2,5 millilitri di d-destiobiotina, o soluzione DSB, mescolando 1,5 milligrammi per millilitro di DSB in 37,5 microlitri di DMSO e aggiungendo cinque milligrammi per millilitro di EDC a 2.462,5 microlitri di tampone MES molare 0,1, pH 6. Combina quindi le due soluzioni. Dopo 15 minuti, aggiungere un microlitro di BME per spegnere la reazione tra DSB e EDC.

Togliete dal forno le superfici calde in vetro funzionalizzato APTES e lasciatele raffreddare per cinque-10 minuti. Aggiungere un tampone MES sulle superfici di vetro per risciacquarle tenendo la pipetta a un angolo di 70 gradi in modo che la punta non sia puntata direttamente verso la superficie. Quindi scaricare e prelevare il buffer da un punto fisso, come l'angolo del pozzo.

Quindi, utilizzare il tampone MES per risciacquare altre due volte. Applicare la soluzione DSB sulle superfici in vetro. Trasferiscili su un tovagliolo di carta umido all'interno di una capsula di Petri, copri la capsula e incubali in frigorifero per 18-24 ore.

Dopo l'incubazione a quattro gradi Celsius, utilizzare il PBS per risciacquare ogni superficie del vetro tre volte, come dimostrato in precedenza in questo video. Quindi, diluire la streptavidina, o soluzione madre SAV, a 0,4 milligrammi per millilitro e applicarla uniformemente sulle superfici di vetro in modo che si formi uno strato sottile. Dopo aver incubato il bicchiere per 18-24 ore, utilizzare 150 microlitri di PBS per risciacquare ogni superficie tre volte.

Quindi bagnare un tovagliolo di carta con acqua deionizzata e posizionarlo in una capsula di Petri di 14 centimetri che circonda le piastre per trattenere l'umidità nei pozzetti. Copri la capsula di Petri con le superfici di vetro e mettila in un frigorifero di livello 1 di biosicurezza a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per effettuare la cattura cellulare, aspirare il terreno da fiasche di cellule T175.

Quindi utilizzare il PBS per sciacquare le cellule e aspirare il tampone. Aggiungere 10 millilitri di agente liftante non enzimatico, come la soluzione di dissociazione cellulare, al pallone. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per sei minuti.

Dopo sei minuti, aggiungere 10 millilitri di HBSS freddo per diluire l'agente liftante. Quindi pipettare 20 microlitri di cellule e utilizzare un emocitometro per contarle. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g, a quattro gradi Celsius, per cinque minuti.

E usa l'HBSS per risospendere le cellule a una volta da 10 a una sesta cellula per millilitro. Pipettare su e giù per risospendere le cellule in soluzione e ridurre l'aggregazione cellulare che può ridurre il legame con gli anticorpi. Quindi, dividere la sospensione cellulare in soluzioni di controllo e sperimentali separate.

Aggiungere gli anticorpi biotinilati alle rispettive soluzioni cellulari e incubare su un miscelatore end-over-end a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzare 150 microlitri di HBSS per lavare tre volte il vetro funzionalizzato in piastre a otto pozzetti, come dimostrato in precedenza nel video. Aggiungere la soluzione cellulare ai pozzetti e incubare con ghiaccio sullo shaker per 45 minuti.

Nel frattempo, preparare una soluzione da 20 millimolari di biotina in HBSS sterile. Quindi, dopo l'incubazione, utilizzare delicatamente 150 microlitri di HBSS per sciacquare la soluzione cellulare dal bicchiere. Dopo aver ripetuto il risciacquo altre due volte, aggiungere 150 microlitri della soluzione di biotina a ciascun pozzetto di rilascio e incubare per 20 minuti per consentire alla reazione di procedere.

Raccogliere le cellule legate in modo non specifico utilizzando HBSS per lavare le cellule. Quindi, procedere all'imaging e all'analisi della fluorescenza secondo il protocollo di testo. Includere immagini di cellule vive in un pallone come controllo.

In questo esperimento, MCF7GFP cellule sono state esposte alla superficie funzionalizzata. Il 60% delle cellule è stato catturato utilizzando l'anticorpo HLA-ABC. Dopo l'esposizione a 20 millimolari di biotina, l'80% delle cellule catturate è stato rilasciato.

Come mostrato qui, quando le cellule MCF7GFP sono state mescolate con cellule RAW 264.7, il 50% dei macrofagi RAW è stato catturato e l'aggiunta di 20 biotina micromolare ha successivamente rilasciato l'80% delle cellule RAW catturate. Questa figura illustra che i macrofagi RAW di controllo positivo non mostrano attività di fluorescenza. Tuttavia, il controllo negativo MCF7GFP cellule è positivo per la fluorescenza GFP.

Poiché l'eccesso di anticorpi può ridurre la cattura cellulare, la concentrazione di anticorpi è stata ottimizzata titolando da zero a 10.000 nanogrammi per millilitro di anticorpi HLA. I risultati hanno mostrato che la concentrazione ideale di anticorpi era compresa tra 100 e 1.000 nanogrammi per millilitro. Inoltre, gli esperimenti di ottimizzazione cellulare hanno determinato che la concentrazione ideale di cellule che possono essere catturate è compresa tra una volta 10 e la quinta e una volta 10 per la sesta cellula, poiché le quantità inferiori a tale numero sono inferiori al fondo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni, con meno di sei ore di tempo sperimentale, escluse le incubazioni notturne. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di raccogliere i lavaggi cellulari durante gli esperimenti, in quanto possono fornire informazioni vitali sull'efficacia della superficie. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la citometria a flusso per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali livelli di espressione del recettore possono avere le cellule di interesse.

Dopo il suo sviluppo, la funzionalizzazione delle superfici ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei biomateriali per esplorare l'integrazione biosicura dei materiali, come gli impianti nei pazienti per una varietà di malattie e lesioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come funzionalizzare le superfici di vetro per catturare e rilasciare le cellule di interesse, consentendo l'analisi a valle. Non dimenticare che lavorare con cellule vive in azoturo di sodio può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come un'adeguata formazione, DPI e smaltimento.