Name: Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri un metodo di funzionalizzazione superficiale del vetro con desthiobiotina e streptavidina per isolare cellule specifiche. Questa tecnica personalizzabile consente la cattura e il rilascio reversibile di cellule, supportando la ricerca sull'angiogenesi tumorale e la resistenza ai farmaci.

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Vorremmo ringraziare l'American Cancer Society, la Divisione dell'Illinois (282802) e la National Science Foundation CBET (1512598) per il sostegno finanziario. Vorremmo anche ringraziare la dottoressa Dianwen Zhang dell'Università dell'Illinois Beckman Institute per la formazione in microscopia. Infine, vorremmo ringraziare Jared Weddell, Stacie Chen e Spencer Mamer per le discussioni approfondite.

1. Pulizia della superficie di vetro e Preparazione Reagenti <ol><li> Inserire una superficie di vetro in una macchina di plasma di ossigeno per 5 min a 50% di potenza per pulirlo. </li><li> Preparare ricostituito (3-amminopropil) trietossisilano (APTES) soluzione 2,5 ml 2%, con l&#39;aggiunta di 50 ml di APTES e 2,45 ml di etanolo in un tubo conico. </li></ol> 2. APTES e DSB Funzionalizzazione <ol><li> Aggiungere la soluzione APTES alle superfici. Dispensare 150 ml per pozzetto per 8 pozzetti. Pipettare 100 ul per pozzetto per 24 pozzetti. Pipettare 1,1 ml per piatti di vetro 60 x 15 mm. Coprire le superfici per evitare l&#39;evaporazione e la distribuzione non uniforme della soluzione APTES. Collocare le superfici su un agitatore piattaforma per 50 min a temperatura ambiente, che crea una distribuzione uniforme dello strato APTES. NOTA: APTES è un aminosilane che forma il primo strato di superficie. Se si utilizza una superficie diversa, euristicamente determinare il volume di soluzione necessario per coprire la superficie. </li><li> Selezionare la temperatura del forno, mentre le superfici sono shaker: Riscaldare a 55 ° C per 2 ore per gli 8 pozzetti e 24 pozzetti. vetro di calore solo piatti a 90 ° C per 1 ora. </li><li> Lavare le superfici con etanolo. <ol><li> Somministrare la quantità di etanolo richiesto facendo riferimento basato sulla superficie utilizzata. Aggiungere 150 ml di etanolo a ciascun pozzetto per 8 pozzetti. Aggiungere 125 ml di etanolo a ciascun pozzetto per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml di etanolo per piatti di vetro. </li><li> Risciacquare la superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Risciacquare altre due volte con etanolo. NOTA: Se uno dei fondo di vetro piatti e hanno alcuna plastica in loro, non li riscaldare superiore a 65 ° C, come la plastica inizierà a sciogliersi e ordito. </li></ol></li><li> Lavaggio con gas 100% di azoto erogato da un serbatoio. Mettere le superfici in oVen. </li><li> Preparare 2,5 ml di soluzione di d-desthiobiotin (DSB) combinando 1,5 mg / ml DSB in 37,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO), e 5 mg / ml-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) in 2462,5 microlitri della (pH 6) tampone 0,1 M di acido 4-morpholinoethanesulfonic hydrate (MES). Poi combinare entrambe le soluzioni. </li><li> Aggiungere 1 ml di 2-mercaptoetanolo β, dopo 15 minuti, nella soluzione di estinguere la reazione tra DSB e EDC. Rimuovere APTES calde funzionalizzati superfici di vetro dal forno. Attendere 5-10 min per le superfici in vetro a raffreddarsi. </li><li> Aggiungere MES tampone la superficie da lavare, utilizzando importi basati sulla superficie. Aggiungere 150 ml MES tampone di 8 pozzetti. Aggiungere 125 microlitri MES tampone di per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml MES buffer per piatti di vetro. </li><li> Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo. Tenere la pipetta ad un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamentenella superficie. Risciacquare altre due volte con tampone MES. </li><li> Applicare la soluzione DSB alle superfici da consentire loro di incubare. Aggiungere 150 microlitri soluzione DSB per ben 8 pozzetti. Aggiungere 100 pl per soluzione DSB bene per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml di soluzione di vetro piatti DSB. </li><li> Posizionare le superfici in vetro DSB coperti su un tovagliolo di carta umido all&#39;interno di una capsula di Petri. Coprire e incubare in un C frigo a 4 ° C per 18-24 ore. </li></ol> 3. Streptavidina Funzionalizzazione <ol><li> Risciacquare ogni superficie di vetro tre volte con 1 ml di 1.0x tampone fosfato (PBS). Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Diluire la soluzione streptavidina (SAV) stock di 0,4 mg / ml (consigliato). NOTA: PBS isotonica modo che possa essere utilizzato come mezzo per diluizione e risciacquo. PBS è usato come solvente per il SAv, e quindi, non influenzerà la capacità del SAv per legarsi alla superficie. </li><li> Applicare 0,4 mg / ml di soluzione di SAv uniformemente alle superfici in modo che un sottile strato di forme sul fondo del bicchiere, selezionare la quantità di soluzione basata sulla superficie. Per 8 pozzetti, aggiungere la soluzione SAv 150 ml 0,4 mg / ml per pozzetto. Per 24 pozzetti, aggiungere la soluzione SAv 100 ml 0,4 mg / ml per pozzetto. Per i piatti di vetro, aggiungere la soluzione SAv / ml 1,1 ml 0,4 mg. </li><li> Coprire e spostare le piastre a 14 cm capsula di Petri di trattenere l&#39;umidità. Incubare la piastra di Petri in frigorifero per 18-24 ore. NOTA: E &#39;essenziale utilizzare volumi consistenti di APTES, DSB, e SAV su ogni superficie. </li><li> Risciacquare ogni superficie di vetro per tre volte con 150 ml di PBS per rimuovere SAv. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. </li><li> Bagnare un tovagliolo di carta wesimo acqua deionizzata e posizionare il tovagliolo di carta appartamento a 14 centimetri Petri che circonda le piastre per trattenere l&#39;umidità nei pozzetti. Coprire la piastra di Petri contenente i pozzi. Incubare la piastra di Petri in un livello 1 (BSL-1) frigorifero 4 ° C fino al momento biosicurezza. </li></ol> 4. Acquisizione delle cellule e di uscita <ol><li> Inizia con pallone T175 (s) di cellule destinati per l&#39;esperimento. Aspirare il supporto dal pallone (s). Lavare i media rimanenti con 5 ml di temperatura ambiente PBS. Aspirare PBS dal pallone (s). </li><li> Aggiungere 10 ml di agente di sollevamento non enzimatica, come cellule dissociazione Solution, al pallone T-175 delle cellule. Mettere il pallone in incubatrice per 6 minuti per consentire il sollevamento delle cellule dal pallone. </li><li> Dopo 6 minuti, aggiungere 10 ml di soluzione salina bilanciata freddo di Hank (HBSS; Vedi elenco dei materiali) per inattivare l&#39;agente di sollevamento. Estrarre 20 ml di cellule per contare il numero di cellule in soluzione utilizzando un emocitometro. NOTA: A seconda del funcsuperfici utilizzate nell&#39;esperimento cattura tionalized, il numero di cellule necessaria varia. Per funzionalizzati 8 pozzetti, utilizzare 300.000 cellule per pozzetto. Per i piatti di vetro funzionalizzati, utilizzare 1,1 milioni di cellule. Per funzionalizzati 24 pozzetti, sono raccomandati 125.000 cellule. Maggiori informazioni sul conteggio delle cellule si trova nel Supplemento. </li><li> Ripetere i punti 4.1- 4.3 per un altro fiasco di cellule, se un numero inferiore di cellule sono presenti quanto necessario per l&#39;esperimento. Unire sospensioni cellulari e cellule raccontano per ottenere il numero totale di cellule in soluzione. </li><li> Centrifugare sospensione di cellule in una centrifuga a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C per ottenere un pellet di cellule concentrate. Trova la quantità appropriata di HBSS aggiungere alla sospensione cellulare per ottenere una concentrazione di 1 x 10 6 cellule per ml, quindi aspirare il supernatante dalle cellule centrifugare e aggiungere il volume calcolato. Questo volume può essere calcolata utilizzando le equazioni nel supplemento. </li><li> Pipetta su e giù (triturare) per risospendere °e le cellule in soluzione e ridurre aggregazione cellulare in soluzione che può ridurre legame degli anticorpi. Dividere la soluzione cellulare in soluzioni sperimentali di controllo separata e. Visualizza File supplementare per i componenti e calcoli. </li><li> Aggiungere gli anticorpi biotinilati alle rispettive soluzioni di cellule, come descritto nel file supplementare. Incubare per 30 minuti a 4 ° C in un mixer end-over-end. NOTA: Per le cellule MCF7GFP, 0,5 mg / ml hIgG o 0,5 mg anticorpi / ml HLA-ABC sono raccomandati. Per macrofagi RAW, 1 mg / ml mCD11b sono raccomandati a metà del volume per tenere conto delle differenze di diluizione. Per le cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC), 0,5 mg / ml hCD31 è raccomandato. </li><li> Lavare la superficie di vetro funzionalizzata con HBSS. Per questo esperimento, si consiglia una piastra 8 bene. <ol><li> Aggiungere 150 microlitri HBSS ad ogni pozzetto per 8 pozzetti. Risciacquare altre due volte con HBSS. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo.Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Mantenere freddo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Aggiungere le soluzioni cellulari ai pozzetti ed attendere 45 min per le cellule di incubare su ghiaccio sul shaker. Effettuare la soluzione di biotina in sterili HBSS utilizzando volumi calcolati come descritto nel supplemento. </li><li> Rimuovere la soluzione di cellule dai pozzetti vetro utilizzando HBSS. <ol><li> Delicatamente pipetta 150 microlitri HBSS in tutti i pozzetti. Pipettare quindi il HBSS. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. </li><li> Ripetere altre due volte. Dopo il lavaggio, aggiungere HBSS ai pozzetti per mantenere le cellule bagnato. </li></ol></li><li> Aggiungere 150 ml di soluzione di biotina 20 mm a ogni rispettivo rilascio bene, e poi attendere 20 minuti per consentire la reazione. </li><li> Ricordare cellule non specificamente, legatos mediante lavaggio con HBSS come detto sopra, e quindi se si utilizza cellule fluorescente, procedere alla fluorescenza immagine cellule. Anche immagine cellule vive in un pallone (come controllo, per confrontare con le cellule nel pozzo). Se si utilizza verdi proteina fluorescente (GFP), le cellule trasfettate, l&#39;eccitazione sarà 470 nm, e l&#39;emissione sarà 515 nm. </li></ol> 5. Anticorpo Ottimizzazione: la titolazione degli anticorpi <ol><li> Iniziare sollevando le cellule dal pallone T75 o T175, come spiegato al punto 4.1- 4.3. NOTA: Questi volumi sono tarati per 24 pozzetti, ma possono essere modificati per adattarsi a qualsiasi superficie di vetro funzionalizzati attraverso test euristico. Una titolazione rappresentante anticorpo è mostrato in Figura 1. </li><li> Contare le cellule utilizzando l&#39;emocitometro e quindi centrifugare la soluzione di cellule in una provetta conica a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ricostituire cellule di 1 milione di cellule per ml, utilizzando i calcoli descritti nel supplemento. </li><li> Dividere il 1 mcellule ilioni per ml di soluzione in sei diverse soluzioni di 500 ml in diverse provette da centrifuga per l&#39;anticorpo (Ab) soluzioni. <ol><li> Diluire la soluzione di anticorpi stock da 10 mg / ml, 1 mg / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Creare i controlli utilizzando 100 ml di Stain tampone (PBS + 1% di sodio azide + 1% BSA), e 500 microlitri di cellule per il controllo senza Ab in esso. Per il controllo in bianco (No Ab e non le cellule), utilizzano una soluzione di 300 l di PBS. NOTA: ATTENZIONE: La sodio azide è estremamente tossici, esplosivi, e l&#39;estrema cura deve essere presa quando lo si utilizza. Si prega di consultare la scheda di sicurezza (SDS) e utilizzare l&#39;equipaggiamento di sicurezza appropriato. </li></ol></li><li> Combinare e incubare le soluzioni Ab con le soluzioni di cellule del mixer end-over-end a 4 ° C per 30 min. Sciacquare i funzionalizzati 24 pozzetti con HBSS tre volte. Risciacquare la superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo. Tenere il pi grecopipetta ad un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. </li><li> Aliquota 125 ml di ogni soluzione campione nelle APTES appropriati, DSB, e SAV funzionalizzati bene. Incubare a 4 ° C o su ghiaccio per 45 min sulla superficie del vetro. Risciacquare la superficie con HBSS tre volte per rimuovere le cellule non specificamente collegati. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Non sciacquare la riga inferiore, come quelli sono i controlli. </li><li> Aggiungere 150 ml di HBSS ad ogni lavato bene, mettere i 24 piastre e su ghiaccio, e quindi utilizzare un lettore di piastre per misurare la fluorescenza delle cellule GFP (eccitazione 485 nm / emissione 528 nm). </li></ol> 6. cellulare Ottimizzazione: Titolazione cellulare <ol><li> Sollevare le cellule di cui al punti 4.1 -4.3. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Spin giù cellulare in modoluzione in tubo conico a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ricostituire le cellule a 1 milione di cellule per ml. NOTA: Ulteriori informazioni sull&#39;uso del emocitometro può essere trovato nel supplemento. </li><li> Pipettare 1,6 ml della soluzione di cellule per lo stock di 1,6 milioni di cellule e mettere in un tubo conico. Pipetta 800 ml di cellule dalla soluzione di cellule per lo stock di 800.000 cellule e mettere in un tubo conico. Pipettare 80 microlitri dal magazzino delle cellule per lo stock di 80.000 cellule e mettere in un tubo conico. Dispensare 8 microlitri dal magazzino cella per 8.000 cellule magazzino e posto in un tubo conico. NOTA: Le concentrazioni sono date per 8 misure pozzetti, replicare, se necessario. Un esempio di output piastra è illustrata nella Figura 2. </li><li> Prendere le soluzioni quattro Stock e spin in una centrifuga a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere tutte le soluzioni azionari in 400 ml di HBSS. </li><li> Aggiungere 1,6 microlitri di 100 anticorpi ng / ml per lo stock 1,6 milioni di cellule, 0,8 μl allo stock 800.000 cellule, e 0,5 ml a tutti gli altri stock. Incubare l&#39;anticorpo per 30 minuti nel mixer end-over-end per 30 minuti a 4 ° C. Lavare la superficie di vetro funzionalizzato con HBSS tre volte. NOTA: La piastra ben funzionalizzati 8 è consigliato per la microscopia quantificazione, mentre il 24 pozzetti funzionalizzato è raccomandato per lettore di piastre quantificazione. concentrazione dell&#39;anticorpo per 8.000 cellule azione non è stata ridotta per consentire il fattore limitante della superficie cattura di non essere la mancanza di anticorpi in soluzione, ma piuttosto le proprietà cattura della superficie. </li><li> Applicare 150 ml di soluzioni campione in ciascun pozzetto. Applicare lo stock 1,6 milioni cella alla prima colonna di pozzi a sinistra. Applicare lo stock 800.000 cella alla seconda colonna da sinistra. Applicare lo stock di 80.000 cellule per la terza colonna da sinistra. Infine applicare lo stock di 8.000 cellule per l&#39;ultima colonna. Incubare per 45 minuti a 4 ° C su shaker. NOTA: Il 1,6 milionicella stock serve come la più alta concentrazione da testare, ed è il doppio della quantità di cellule che viene tipicamente utilizzato in esperimenti di separazione cellulare (600.000 cellule per pozzetto) Lo stock 800.000 cellule serve come controllo per l&#39;esperimento come è tipico concentrazione cellulare che viene utilizzato in esperimenti di separazione cellulare (3.000.000 cellule per pozzetto). Lo stock di 80.000 cellule serve come una diluizione di dieci volte per verificare le concentrazioni più basse per la cattura cellulare (30.000 cellule per pozzetto). Lo stock 8.000 cellule serve come una diluizione cento volte da utilizzare come un test per verificare il limite inferiore della separazione cellulare (3.000 cellule per pozzetto). </li><li> Risciacquare con HBSS tre volte. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l&#39;angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Raccogliere tutti i lavaggi. </li><li> Immagine le cellule su un microscopio a fluorescenza, se si utilizza 8 piastre e, scattare foto di ogni survolto, e applicare 150 microlitri biotina per ogni superficie per un&#39;ora a 4 ° C su shaker. Dopo un&#39;ora, risciacquare pozzetti rilascio biotina con HBSS 3 volte come prima. Raccogliere tutti i lavaggi da pozzi per il conteggio con l&#39;emocitometro e l&#39;immagine dei pozzi di rilascio. </li><li> Applicare 150 ml di 20 mM soluzione biotina in eccesso nei relativi pozzetti di rilascio di biotina per 1 ora, se si utilizza 24 tavole bene, e poi sciacquare quei pozzetti 3 volte con HBSS. Quantificare 24 pozzetti utilizzando un lettore di piastre. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule da tutti i lavaggi e raccolti. </li></ol> Analisi 7. Immagine Nota: Si raccomanda Il pacchetto software FIJI (http://fiji.sc/Fiji) per l&#39;analisi delle immagini. Inizialmente, le immagini sono state convertite in scala di grigi in, e quindi la luminosità / contrasto è stato modificato per portare fuori le cellule. <ol><li> Caricare l&#39;immagine, e convertire in scala di grigi facendo clic sulla scheda immagine poi scorrendo verso il basso per &quot;Tipo&quot; e quindi facendo clic4; 8 bit &quot;. </li><li> Aumentare il contrasto dell&#39;immagine facendo clic sulla scheda immagine e poi scorrendo a &quot;Regola&quot;. Clicca su &quot;Luminosità e Contrasto&quot;, e quindi utilizzare le barre di scorrimento per rendere le cellule spiccano. Se si utilizza immagini di fluorescenza, invertire le immagini per rendere le cellule più definiti. </li><li> Caricare un plugin su ImageJ chiamato ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) per analizzare le immagini. </li><li> Aprire ITCN. Quando viene visualizzata una finestra di dialogo che richiede all&#39;utente con diversi parametri per valutare la dimensione della cella, impostare la larghezza minima della cella di interesse prima. Selezionare l&#39;opzione &quot;Rileva scuri Peaks&quot; se l&#39;immagine è a fluorescenza e le cellule sono oscurati. </li><li> Impostare il valore soglia a 2 inizialmente, e poi premere il pulsante &quot;Count&quot;. Una nuova versione contato dell&#39;immagine apparirà con puntini rossi che delineano in cui le cellule sono state contate. </li><li> Regolare il parametro di soglia e la larghezza per ottenere dati cellulare più precise defining le dimensioni di una &quot;cella&quot;. Nota: Il numero di cellule contate sarà in una finestra di dialogo sulla destra. Modifica dei parametri daranno diverso numero di cellule contate. </li><li> Continuare a scorrere attraverso i parametri di soglia e larghezza fino a raggiungere una buona stima del numero di cellule. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Miglioramenti nelle tecniche di isolamento delle cellule promuove studi scientifici nelle relazioni struttura-funzione in neuroscienze 18, staminali programmazione delle cellule in biologia rigenerativa, e la segnalazione angiogenico in biologia vascolare 19. Infatti, colture primarie 20 (ad esempio, HUVEC) in biologia vascolare avviene principalmente attraverso l&#39;uso di tecniche di isolamento cellulare. Isolamento delle cellule è stata recentemente utilizzata anche per il f...

Da banco approcci separazione cella corrente (ad esempio, la fluorescenza delle cellule attivate di smistamento 1, cattura laser micro-dissezione 2, immuno-magnetico tallone di separazione 1) può richiedere diverse ore di preparazione e smistamento. Questi grandi scale temporali possono influenzare i livelli di risposta e di espressione fisiologici, con conseguente analisi che non sono rappresentativi della risposta fisiologica 3. I sistemi sono necessari che possono rapidamente ed efficacemente isolare specifici tipi cellulari senza interrompere recettore livelli di superficie cellulare per migliorare l&#39;isolamento delle cellule e arricchimento per applicazioni biomediche. Pertanto, il razionale per il nostro approccio è quello di sviluppare un approccio dolce per l&#39;isolamento delle cellule. Il &quot;lab on a chip&quot; concetto offre la promessa di ordini di grandezza più veloce di isolamento cellulare (ore-to-minuti), e coinvolge più frequentemente catturare cellule su una superficie e rilasciare cellule o conte intracellularenti attraverso fisico 4,5 o metodi chimici 6. Anche se questi approcci offrono alcuni vantaggi, quali l&#39;identificazione dell&#39;espressione proteica 7,8, individuando espressione di RNA 9-11, o addirittura fornire cellule per coltura in vitro 12,13, molte di queste tecniche non può essere tradotto per la diagnostica, come recettore delle cellule profilatura a causa ai loro ambienti non fisiologici. Agenti di sollevamento enzimatici come la collagenasi può colpire anche queste quantità del recettore 14,15, cioè le tecniche di quantificazione recettore delle cellule che utilizzano questi agenti di sollevamento non genererà dati fisiologici precisi. Lisi cellulare impedisce differenziazione tra i recettori di superficie nativi e quelli precedentemente internalizzato 16. Questo protocollo descrive un approccio rapido e delicato per l&#39;isolamento delle cellule.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil) trietossisilano (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>Utilizzato per produrre la soluzione APTES al 2%</td></tr><tr><td>Detergente al plasma Pico</td><td>Diener</td><td>Modello 1</td><td>Pulisce le superfici e consente l'incollaggio di PDMS al vetro</td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>Utilizzato come meccanismo di rilascio nella superficie di cattura cellulare.</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>British Drug Houses (BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>Dissolve il DSB in soluzione</td></tr><tr><td>1-Etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC)</td><td>Termo-scientifico</td><td>5g: 22980 25g: 22981</td><td>Attiva gli acidi carbossilici e consente il legame delle proteine alla superficie del vetro.</td></tr><tr><td>vetrino di coltura a 8 pozzetti non rivestito</td><td>BD Falcon</td><td>Confezione da 24: 354118 Confezione da 96: 354108</td><td>Utilizzato in esperimenti cellulari con microscopio a fluorescenza Zeiss, come gli esperimenti iniziali di cattura e quantificazione del rilascio</td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>Utilizzato in esperimenti cellulari con lettore di piastre, come gli esperimenti di anticorpi e titolazione cellulare</td></tr><tr><td>Mercaptoetanolo</td><td>Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>Utilizzato per estinguere la reazione tra EDC e DSB</td></tr><tr><td>Acido 4-morfolinoetsolfonico idrato (MES idrato 99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>Utilizzato per produrre tampone MES 0,1 M da utilizzare nella reazione EDC</td></tr><tr><td>Forno di precisione</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-475-153</td><td>Utilizzato nella polimerizzazione dello strato PDMS e APTES.</td></tr><tr><td>Agitatore Titramax 1000</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>Utilizzato per garantire una distribuzione uniforme di APTES sulle superfici.</td></tr><tr><td>1x Streptavidina 5 mg [e7105-5mg]</td><td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>Proteina legante la biotina. Può causare irritazione.</td></tr><tr><td>Piatto in vetro da 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>Utilizzato negli studi HUVEC e nei futuri studi di profilazione.</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 14 cm con coperchio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>Utilizzata per contenere i campioni in fase di funzionalizzazione e trasportarli.</td></tr><tr><td>Cellule MCF7-GFP</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>Conservato in azoto liquido</td></tr><tr><td>RAW264.7 macrofagi di topo</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>Regalatoci dal laboratorio Smith dell'Università dell'Illinois. Conservato in azoto liquido.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>Conservato in 100 ml a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modificato Eagle medium</td><td>Cell Media Facility presso la School of Chemical Sciences presso UIUC</td><td>50003PC</td><td>Fornitore: Corning</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Cell Media Facility presso la School of Chemical Sciences presso UIUC</td><td>25-025-CI</td><td>Già aggiunto in DMEM dalla struttura. Fornitore: Corning.</td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>Piccolo 23 cm 50 confezione</td></tr><tr><td>Soluzione di dissociazione cellulare</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>Utilizzato per sollevare le cellule in modo non enzimatico per l'uso in esperimenti cellulari</td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>Utilizzato per contare le cellule per la quantificazione delle soluzioni cellulari e l'efficacia della cattura e del rilascio.</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>Utilizzato per rilasciare cellule dalla superficie.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Creato da Ricetta</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per mantenere in vita le cellule in sospensione e per lavare le superfici di legame non specifico. Adattato dai protocolli di Cold Spring Harbor: Nel 500&nbsp; ml, utilizzare 4&nbsp; g NaCl, 0,2&nbsp; g KCl, 0,0402&nbsp; g Na2PO4&#8226; 7H2O, 0,03&nbsp; g KH2PO4 e 0,5&nbsp; g di glucosio. Aggiungi acqua deionizzata per arrivare a&nbsp; 500 ml, filtrare e conservare in frigorifero.</td></tr><tr><td>Anticorpo HLA-ABC</td><td>Anticorpo BioLegend</td><td>311402</td><td>utilizzato per catturare le cellule MCF7gfp</td></tr><tr><td>Anticorpo hIgG</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>Anticorpo utilizzato per catturare le cellule MCF7gfp</td></tr><tr><td>Cellule GFP MCF7</td> Linea di cancro al seno luminale <td>AKR-211</td> di <td>Cell Biolabs</td><td>che è stata trasfettata con proteina fluorescente verde.</td></tr><tr><td>Coniche Assortite</td><td>Termo-Scientifiche</td><td>15mL: 12-565-268</td><td>50/15 ml Coniche in plastica per la conservazione di soluzioni e aliquote.</td></tr><tr><td>Rotatori per mini-provette (miscelatore end over end)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Utilizzato per incubare anticorpi e miscelare altre soluzioni cellulari al fine di miscelare</td></tr><tr><td>Axiovert 200M (microscopio a fluorescenza)</td><td>Zeiss</td><td>N/A Microscopio</td><td>a florescenza invertita Zeiss Axiovert 200 M.</td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione Zeba</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>Utilizzate per purificare gli anticorpi appena biotinilati dopo l'uso del Kit di Biotinilazione. Istruzioni fornite su:</td></tr><tr><td>http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf EZ Link Sulfo NHS Kit di biotinilazione a basso peso</td><td>Termo-Scientifico</td><td></td><td>Utilizzato per biotinilare gli anticorpi per consentirne l'integrazione con la superficie di cattura</td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX Lettore multimodale</td><td>Utilizzato per misurare quantitativamente l'intensità della fluorescenza negli esperimenti di titolazione.</td></tr></tbody></table>

un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite glass funzionalizzazione superficiale

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Uno dei fattori limitanti all'adozione e al progresso della medicina personalizzata è l'incapacità di sviluppare strumenti diagnostici per sondare le sfumature individuali nell'espressione da paziente a paziente. Le attuali metodologie che cercano di separare le cellule per riempire questa nicchia provocano l'interruzione dell'espressione fisiologica, rendendo la tecnica di separazione inutile come strumento diagnostico. In questo protocollo, descriviamo la funzionalizzazione e l'ottimizzazione di una superficie per la cattura e il rilascio cellulare. Questa superficie funzionalizzata integra anticorpi biotinilati con una superficie di vetro funzionalizzata con un aminosilano (APTES), destiobiotina e streptavidina. Il rilascio cellulare è facilitato dall'introduzione di biotina, che consente la raccolta e la purificazione delle cellule catturate dalla superficie. Questo rilascio avviene attraverso il targeting della porzione secondaria destiobiotina, che si traduce in un paradigma di rilascio molto più delicato. Questa riduzione dei reagenti aggressivi e delle forze di taglio riduce i cambiamenti nell'espressione cellulare. La superficie funzionalizzata cattura fino all'80% delle cellule in una singola miscela cellulare e ha dimostrato una cattura del 50% in una miscela a doppia cella. Vengono studiate le applicazioni di questa tecnologia agli xenotrapianti e agli studi di separazione del cancro. Vengono descritte anche le tecniche di quantificazione per la verifica delle superfici, come il lettore di piastre e le analisi ImageJ.

Usando questo protocollo mostriamo cattura cellule (Figura 3A) e il rilascio di cellule (Figura 3C) di cellule MCF7GFP nonché controlli cellule vive (Figura 4). Abbiamo quantificato la cattura cella come 60% ​​e 80% sono stati rilasciati (Figura 3C). Quando abbiamo esteso questo approccio ad una miscela di RAW 264.7 macrofagi e cellule MCF7GFP, il 50% dei macrofagi RAW sono stati catturati (Fig. 3D) e l&...

Questo protocollo descrive la funzionalizzazione della superficie personalizzabile del sistema destiobiotina, streptavidina e APTES al fine di isolare specifici tipi di cellule di interesse. Inoltre, questo manoscritto copre le applicazioni, l'ottimizzazione e la verifica di questo processo.

Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

L'obiettivo generale di questo processo di funzionalizzazione della superficie in vetro è consentire il catturamento delicato e il rilascio di cellule di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'angiogenesi tumorale, permettendo lo screening di biomarcatori cellulari che indicano resistenza ai farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è completamente personalizzabile, per praticamente qualsiasi tipo cellulare di interesse.Purché esista un anticorpo specifico per il tipo cellulare, la superficie può essere adattata per il suo isolamento. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'angiogenesi tumorale, può essere applicato anche ad altre malattie, poiché campioni purificati sono necessari per lo sviluppo di regimi terapeutici più personalizzati. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo cercando di sviluppare un meccanismo di rilascio reversibile per l'isolamento delle cellule, sfruttando l'interazione tra destreptobiotina e la famiglia dell'avidina.Dopo aver pulito una superficie di vetro in una macchina a plasma di ossigeno per cinque minuti seguendo il protocollo indicato nel testo, preparare 2,5 millilitri di soluzione al 2% di 3-Aminopropil trietossisilano, o soluzione APTES, mescolando 50 microlitri di APTES e 2,45 millilitri di etanolo in un tubo conico. Pipettare la soluzione APTES sulle superfici di vetro, quindi coprire le superfici e posizionarle su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per 50 minuti al fine di distribuire uniformemente lo strato di APTES. Nel frattempo, preriscaldare il forno a 55 gradi Celsius per le piastre a otto e 24 pozzetti, oppure a 90 gradi Celsius per le capsule di vetro.Dopo aver rimosso le piastre dall'agitatore, utilizzare etanolo per risciacquare le superfici di vetro seguendo il protocollo descritto nel testo. Asciugare le superfici con gas azoto al 100%. Quindi posizionare le piastre a otto e a 24 pozzetti in forno per due ore, oppure le capsule di vetro in forno per un'ora.Successivamente, preparare 2,5 millilitri di d-Desthiobiotina, o soluzione DSB, mescolando 1,5 milligrammi per millilitro di DSB in 37,5 microlitri di DMSO, e aggiungendo 5 milligrammi per millilitro di EDC a 2.462,5 microlitri di tampone MES 0,1 M, pH 6. Quindi combinare le due soluzioni. Dopo 15 minuti, aggiungere un microlitro di BME per bloccare la reazione tra DSB ed EDC.Rimuovere le superfici di vetro funzionalizzate con APTES calde dal forno e lasciarle raffreddare per cinque-dieci minuti. Aggiungere tampone MES sulle superfici di vetro per risciacquarle, tenendo la pipetta a un angolo di 70 gradi in modo che la punta non sia puntata direttamente sulla superficie. Quindi espellere e aspirare il tampone da un punto fisso, come ad esempio l'angolo del pozzetto.Quindi, utilizzare il tampone MES per risciacquare altre due volte. Applicare la soluzione DSB sulle superfici di vetro. Trasferirle su un tovagliolo di carta umido all'interno di una piastra di Petri, coprire la piastra e incubare in frigorifero per 18-24 ore.Dopo l'incubazione a quattro gradi Celsius, utilizzare il PBS per risciacquare ogni superficie di vetro tre volte, come dimostrato precedentemente in questo video. Successivamente, diluire la soluzione madre di Streptavidina, o SAV, a 0,4 milligrammi per millilitro ed applicarla uniformemente sulle superfici di vetro in modo da formare uno strato sottile. Dopo aver incubato il vetro per 18-24 ore, utilizzare 150 microlitri di PBS per risciacquare ogni superficie tre volte.Quindi inumidire un tovagliolo di carta con acqua deionizzata e posizionarlo in piano in una piastra di Petri da 14 centimetri intorno alle piastre per mantenere l'umidità nei pozzetti. Coprire la piastra di Petri con le superfici di vetro e collocarla in un frigorifero di livello di sicurezza biologica 1 a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Per eseguire il catturamento cellulare, aspirare il mezzo dai flaconi T175 contenenti cellule.Quindi risciacquare le cellule con PBS ed aspirare il tampone. Aggiungere 10 millilitri di un agente di distacco non enzimatico, come la Soluzione di Dissociazione Cellulare, al flacone. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per sei minuti.Dopo sei minuti, aggiungere 10 millilitri di HBSS freddo per diluire l'agente di distacco. Quindi prelevare 20 microlitri delle cellule e utilizzare un emocitometro per contarle. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g, a quattro gradi Celsius, per cinque minuti.E utilizzare HBSS per risospendere le cellule a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per millilitro. Pipettare su e giù per risospendere completamente le cellule in soluzione e ridurre l'aggregazione cellulare, che potrebbe compromettere il legame degli anticorpi. Successivamente, dividere la sospensione cellulare in soluzioni separate di controllo e sperimentali.Aggiungere gli anticorpi biotinilati alle rispettive soluzioni cellulari e incubare su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzare 150 microlitri di HBSS per lavare il vetro funzionalizzato in piastre a otto pozzetti per tre volte, come dimostrato in precedenza nel video. Aggiungere la soluzione cellulare nei pozzetti e incubare sul ghiaccio su un agitatore per 45 minuti.Nel frattempo, preparare una soluzione di biotina 20 millimolare in HBSS sterile. Successivamente, al termine dell'incubazione, risciacquare delicatamente con 150 microlitri di HBSS la soluzione cellulare dal vetro. Dopo aver ripetuto il risciacquo altre due volte, aggiungere 150 microlitri della soluzione di biotina in ciascun pozzetto di rilascio corrispondente e incubare per 20 minuti per consentire lo svolgimento della reazione.Raccogliere le cellule legate in modo non specifico utilizzando HBSS per lavare le cellule. Successivamente, procedere all'analisi e all'acquisizione delle immagini di fluorescenza seguendo il protocollo descritto nel testo. Includere immagini di cellule vive in un matraccio come controllo.In questo esperimento, le cellule MCF7GFP sono state esposte alla superficie funzionalizzata. Il 60% delle cellule &egrave; stato catturato utilizzando l'anticorpo HLA-ABC. Dopo l'esposizione a 20 millimoli di biotina, l'80% delle cellule catturate &egrave; stato rilasciato.Come mostrato qui, quando le cellule MCF7GFP sono state mescolate con le cellule RAW 264.7, il 50% dei macrofagi RAW &egrave; stato catturato e l'aggiunta di 20 micromolar biotina ha successivamente rilasciato l'80% delle cellule RAW catturate. Questa figura illustra che i macrofagi RAW del controllo positivo non mostrano attivit&agrave; fluorescente. Tuttavia, le cellule MCF7GFP del controllo negativo risultano positive per la fluorescenza GFP.Poiché un eccesso di anticorpo può ridurre il catturamento delle cellule, la concentrazione di anticorpo è stata ottimizzata mediante titolazione da zero a 10.000 nanogrammi per millilitro di anticorpo HLA. I risultati hanno mostrato che la concentrazione ideale di anticorpo era compresa tra 100 e 1.000 nanogrammi per millilitro. Inoltre, esperimenti di ottimizzazione cellulare hanno determinato che la concentrazione ideale di cellule catturabili è compresa tra 1 × 10⁵ e 1 × 10⁶ cellule, poiché quantità inferiori a questo valore sono al di sotto del livello di fondo.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni, con meno di sei ore di tempo sperimentale, escluse le incubazioni notturne. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di raccogliere i lavaggi cellulari durante gli esperimenti, poiché possono fornire informazioni essenziali sull'efficacia della superficie. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la citometria a flusso possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sui livelli di espressione dei recettori che le cellule di interesse potrebbero avere.Dopo il suo sviluppo, la funzionalizzazione delle superfici ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei biomateriali per esplorare l'integrazione biocompatibile di materiali, come ad esempio impianti in pazienti affetti da diverse malattie o traumi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come funzionalizzare le superfici del vetro per catturare e rilasciare cellule di interesse, consentendo analisi successive. Non dimenticare che lavorare con cellule vive in presenza di azoturo di sodio può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come un'adeguata formazione, l'uso di dispositivi di protezione individuale (DPI) e lo smaltimento corretto devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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