Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule endoteliali linfatiche ad alta purezza che rivestono i vasi linfatici di malformazioni linfatiche umane e prepuzi, utilizzando il sorting cellulare attivato da fluorescenza. Questo viene realizzato innanzitutto digerendo enzimaticamente un campione di tessuto del paziente. Nel secondo passaggio, la sospensione di cellule singole viene coltivata per arricchire il numero di cellule endoteliali linfatiche.

Nel campione, le cellule vengono quindi marcate con anticorpi specifici per i marcatori di superficie cellulare di interesse e separate mediante citometria a flusso a fluorescenza multivariata. Infine, le cellule endoteliali linfatiche provenienti da malformazioni linfatiche del prepuzio possono essere espanse in coltura cellulare per ulteriori analisi a valle.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che il sorting cellulare attivato da fluorescenza fornisce cellule con una purezza superiore al 99%, evitando i problemi associati alla perdita di cellule endoteliali linfatiche dovuta alla sovracrescita da parte di cellule contaminanti. Iniziare pesando un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo, integrato con una soluzione antibiotica e antimicotica. Successivamente, trasferire il campione di malformazione linfatica o di quattro pelli nel tubo e pesare nuovamente il tubo per determinare il peso del tessuto.

Successivamente, all'interno di una cappa di sicurezza di classe due, utilizzare pinze sterili per trasferire il tessuto e il mezzo in una piastra per colture cellulari da 100 millimetri usando forbici sterili. Infine, tritare il tessuto in pezzi di un millimetro cubo. Quindi trasferire i pezzi in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo fresco con antibiotico e antimicotico.

Ruotare il tubo alcune volte per risospendere il tessuto, quindi centrifugare il campione. Dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere un millilitro di soluzione di digestione preriscaldata per ogni 100 milligrammi di tessuto tritato e incubare il tessuto in un incubatore a 37 gradi Celsius con agitazione costante a 200 giri al minuto per un arricchimento efficace delle cellule endoteliali linfatiche. È fondamentale riconoscere quando le cellule sono state sufficientemente esposte alla reazione con collagenasi e dys space, in modo che sopravvivano all'isolamento.

Questo si ottiene mediante un attento monitoraggio del processo di digestione del tessuto e interrompendo la reazione quando la maggior parte del tessuto è stata digerita in frammenti fini. Al termine dell'incubazione, verificare che quasi tutto il tessuto sia stato digerito in piccoli frammenti e filtrare la sospensione tissutale attraverso un setaccio da 70 micron in un tubo sterile da 50 millilitri. Utilizzare ora lo stantuffo di una siringa da tre millilitri con pistone in gomma per macinare il tessuto rimanente fino a quando non si osservano solo piccole tracce di matrice extracellulare.

Quindi lavare il filtro cellulare con un volume di mezzo per cellule endoteliali equivalente al volume del mezzo enzimatico dissociante e centrifugare per raccogliere le cellule. Sospendere il pellet in un volume fino a 20 millilitri di mezzo per cellule endoteliali, in base alle dimensioni del campione. Dopo il conteggio, seminare 2 × 10⁶ cellule in una fiasca da 150 cm² pre-ricoperta con fibronectina, in un volume finale di 20 millilitri di mezzo per cellule endoteliali, per una coltura notturna.

La mattina successiva, rimuovere le cellule non legate con tre risciacqui di PBS integrato con soluzione antibiotica e antimicotica. Successivamente, per espandere il numero di cellule endoteliali linfatiche, aggiungere mezzo fresco per cellule endoteliali alle cellule e incubare la coltura per cinque-sette giorni fino a quando la coltura raggiunge circa l'80% di confluenza. Per colorare le cellule da selezionare mediante citometria a flusso multicolore attivata da fluorescenza.

Prima di tutto, rimuovere il terreno cellulare e lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi aggiungere sette millilitri di soluzione di distacco dopo un'incubazione di cinque a sette minuti a 37 gradi Celsius. Raccogliere le cellule dissociate, inattivare gli enzimi con tre volumi di terreno per cellule endoteliali e trasferire la sospensione cellulare in un tubo sterile.

Centrifugare le cellule tre volte, lavando il pellet in cinque millilitri di PBS per le seconda e terza centrifugazione dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS fresco e contare il numero di cellule vitali mediante esclusione del blu di trian. Dopo il conteggio cellulare.

Trasferire asetticamente le cellule in provette per la colorazione in citometria a flusso e centrifugare le cellule per bloccare il legame non specifico. Risospendere le cellule in F-B-S-P-B-S al 5% e incubare sul ghiaccio per 20 minuti. Dopo il blocco, centrifugare le cellule, rimuovere il soprannatante e risospendere.

Sospendere il pellet in un cocktail di anticorpi CD34, CD31 potanin e recettore VEGF tre. Dopo 20 minuti sul ghiaccio, lavare le cellule tre volte in due millilitri di F-B-S-P-B-S per rimuovere qualsiasi anticorpo non legato e risospendere. Sospendere il pellet in 300 microlitri di ioduro di propidio in soluzione F-B-S-P-B-S sul ghiaccio.

Infine, separare le cellule endoteliali linfatiche umane purificate mediante un apparato di citometria a flusso a parametri multipli. Successivamente, centrifugare le cellule separate e sospendere i pellet nel mezzo appropriato per la semina in coltura cellulare. Qui vengono mostrati vasi linfatici umani normali e vasi con malformazione linfatica marcata con anticorpo contro pot deplane; si noti la marcata dilatazione e la notevole variabilità della dimensione del lume all'interno dei vasi con malformazione linfatica umana.

In effetti, la maggior parte dei malformazioni linfatiche contiene sia piccole strutture cistiche anormali, o microcistiche, sia grandi strutture cistiche anormali, o macrocistiche, dopo la digestione iniziale del tessuto e 24 ore di coltura nei campioni non frazionati. Dopo il sorting e ulteriori 24 ore di coltura cellulare, possono essere osservate colonie cellulari endoteliali distinte, oltre a cellule simili a fibroblasti e cellule muscolari lisce. Tuttavia, le cellule positive per CD34, con bassa espressione di CD31, positive per il recettore VEGF di tipo tre, positive per podoplanina, si attaccano al contenitore di coltura ed esibiscono la tipica morfologia a selciato osservata in queste immagini.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare con elevata purezza la cellula endoteliale linfatica che riveste le malformazioni linfatiche umane e i vasi linfatici completi della pelle, utilizzando il sorting cellulare attivato da fluorescenza. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani primari può essere pericoloso poiché potrebbero contenere agenti infettivi dannosi per la salute umana. Precauzioni standard, come indossare guanti, protezioni per gli occhi e camice da laboratorio, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.