Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule endoteliali linfatiche di elevata purezza che rivestono i vasi linfatici delle malformazioni linfatiche umane e dei prepuzi utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Ciò si ottiene prima digerendo enzimaticamente un campione di tessuto del paziente. Nella seconda fase, la sospensione unicellulare viene coltivata per arricchire il numero di cellule endoteliali linfatiche.

Nell'esempio. Le cellule vengono quindi marcate con anticorpi contro i marcatori di superficie cellulare di interesse e ordinate utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza multiparametrica. Infine, il prepuzio e la malformazione linfatica, le cellule endoteliali linfatiche possono essere espanse in coltura cellulare per ulteriori analisi a valle.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza produce cellule di purezza superiore al 99%, evitando i problemi associati alla perdita di cellule endoteliali linfatiche a causa della crescita eccessiva dovuta alla contaminazione delle cellule. Inizia pesando una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di terreno, integrata con una soluzione antibiotica antimicotica. Quindi trasferire la malformazione linfatica o quattro campioni di pelle nella provetta e pesare nuovamente la provetta per determinare il peso del tessuto.

Successivamente, in una cappa di biosicurezza di classe due, utilizzare una pinza sterile per trasferire il tessuto e il terreno in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri utilizzando forbici sterili. Infine, tritare il fazzoletto in pezzi di un millimetro cubo. Quindi trasferire i pezzi in una provetta da 50 millilitri con 10 millilitri di antibiotico antimicotico fresco. Medio.

Agitare la provetta alcune volte per risospendere il tessuto e poi far girare il campione. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere un millilitro di soluzione digestiva preriscaldata per 100 milligrammi di tessuto tritato e incubare il tessuto in un incubatore a 37 gradi Celsius con agitazione costante a 200 giri/min Per un arricchimento riuscito delle cellule endoteliali linfatiche. È fondamentale riconoscere quando le cellule sono state sufficientemente esposte alla reazione della collagenasi e dello spazio dis, in modo da sopravvivere all'isolamento.

Ciò si ottiene attraverso un attento monitoraggio del processo di digestione dei tessuti e l'arresto della reazione quando la maggior parte dei tessuti è stata digerita in frammenti fini. Al termine dell'incubazione, verificare che quasi tutto il tessuto sia stato digerito in piccoli frammenti e filtrare l'impasto tissutale attraverso un colino da 70 micron in una provetta sterile da 50 millilitri. Ora usa un pistone della siringa da tre millilitri con stantuffo di gomma per macinare il tessuto rimanente fino a quando non si osservano solo piccole tracce di matrice extracellulare.

Quindi lavare il colino cellulare con un volume di terreno cellulare endoteliale equivalente al volume del mezzo enzimatico dissociante e far girare le cellule reus. Sospendi il pellet in un massimo di 20 millilitri di terreno cellulare endoteliale, a seconda delle dimensioni del campione. Quindi, dopo aver contato i semi, due volte 10 alle sei cellule in un pallone da 150 centimetri quadrati precodificato con fibronectina in un volume finale di 20 millilitri di terreno cellulare endoteliale per la coltura notturna.

La mattina successiva, lavare via le cellule non legate con tre risciacqui di PBS integrato con una soluzione antibiotica antimicotica. Quindi, per espandere il numero di cellule endoteliali linfatiche, aggiungere un terreno di coltura endoteliale fresco alle cellule e incubare la coltura per cinque-sette giorni fino a quando la coltura non è confluente per circa l'80%. Per colorare le cellule per lo smistamento mediante smistamento cellulare attivato a fluorescenza multiparametrica.

Per prima cosa, rimuovere il terreno cellulare, lavare le cellule tre volte in PBS. Quindi aggiungere sette millilitri di soluzione di distacco dopo cinque-sette minuti di incubazione a 37 gradi Celsius. Raccogliere le cellule dissociate, inattivare gli enzimi con tre volumi di terreno cellulare endoteliale e trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile.

Centrifugare le celle tre volte lavando il pellet in cinque millilitri di PBS per la seconda e la terza centrifuga dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS fresco e contare il numero di cellule vitali per esclusione del trian blue. Dopo il conteggio delle cellule.

Trasferire asetticamente le cellule in provette di colorazione per citometria a flusso e far girare le cellule per bloccare il legame non specifico. Risospendere le cellule in 5% F-B-S-P-B-S e incubare su ghiaccio per 20 minuti. Dopo aver bloccato la centrifuga, le cellule rimuovono il surnatante e risorgono.

Sospendi il pellet nel cocktail di anticorpi CD 34, potanina CD 31 e recettore VEGF tre. Dopo 20 minuti in ghiaccio, lavare le cellule tre volte in due millilitri di F-B-S-P-B-S per rimuovere eventuali anticorpi non legati e risus. Sospendi il pellet in 300 microlitri di ioduro di propidio in soluzione F-B-S-P-B-S su ghiaccio.

Infine, selezionare le cellule endoteliali linfatiche umane purificate su uno strumento di selezione cellulare attivato da fluorescenza multiparametrica. Quindi centrifugare le cellule selezionate e sospendere nuovamente i pellet nel terreno appropriato per la semina della coltura cellulare. Qui, i vasi linfatici e di malformazione linfatica umani normali marcati con anticorpi contro il deplane del vaso sono mostrati notare la marcata dilatazione e la notevole variazione delle dimensioni del lume all'interno dei vasi di malformazione linfatica umana.

Infatti, la maggior parte delle malformazioni linfatiche contiene sia strutture cistiche anormali piccole o microcistiche che grandi o macrocistiche dopo la digestione iniziale dei tessuti e 24 ore di coltura nei campioni non frazionati. Colonie di cellule endoteliali distinte possono essere osservate oltre alle cellule simili ai fibroblasti e alle cellule muscolari lisce dopo lo smistamento e altre 24 ore in coltura cellulare. Tuttavia, il CD 34, il recettore VEGF positivo CD 31 basso, tre cellule positive del piano podo e positive si attaccano al contenitore di coltura e mostrano la tipica morfologia del ciottolo osservata in queste immagini.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare con elevata purezza la cellula endoteliale linfatica che riveste la malformazione linfatica umana e i vasi linfatici della pelle intera utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani primari può essere pericoloso in quanto può contenere agenti infettivi dannosi per la salute umana. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre le precauzioni standard come indossare guanti, occhiali protettivi e camice da laboratorio.