Cosa sono le fette di polmone tagliate con precisione?

Le fette di polmone tagliate con precisione sono sezioni sottili di tessuto polmonare utilizzate per studi sperimentali per valutare le risposte cellulari.

Come viene utilizzato l'LDH come marcatore per la citotossicità?

LDH viene rilasciato nel surnatante quando le membrane cellulari sono danneggiate, rendendolo un marcatore affidabile per la citotossicità.

Quale ruolo hanno i tensioattivi in questo studio?

I tensioattivi distruggono il bilayer lipidico delle cellule, portando a danni alla membrana e al rilascio di LDH.

Qual è l'importanza di misurare l'assorbanza a diverse lunghezze d'onda?

La misurazione dell'assorbanza a 492 nm e la sottrazione del riferimento a 630 nm permettono una quantificazione accurata dell'attività LDH.

Questo metodo può essere applicato ad altri tipi di tessuti?

Sì, la metodologia può potenzialmente essere adattata per valutare la citotossicità in altri tipi di tessuti.

Quali implicazioni hanno i risultati per la salute polmonare?

I risultati forniscono informazioni su come i tensioattivi possono influenzare la vitalità delle cellule polmonari, il che è importante per comprendere le malattie polmonari.

Valutazione della citotossicità e dell'integrità della membrana in fette polmonari tramite il saggio della lattato deidrogenasi

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

0 views • 2:58 min • July 8th, 2025

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Inizia con fette di polmone umano tagliate con precisione, PCLS, trattate con agenti citotossici come molecole di tensioattivo in una piastra multipozzetto.

Il tensioattivo si inserisce nel doppio strato lipidico della cellula, facendo interagire le code idrofobiche del tensioattivo con il nucleo idrofobico del doppio strato lipidico.

Di conseguenza, la disposizione ordinata delle molecole lipidiche viene disturbata, portando alla formazione di una micella.

Ciò compromette l'integrità della membrana, causando la fuoriuscita di contenuti intracellulari tra cui la lattato deidrogenasi o LDH, un indicatore comune di danno alla membrana cellulare.

Raccogli il surnatante contenente l'LDH rilasciato.

Aggiungere il cocktail di reazione del saggio LDH contenente substrato di lattato, NAD+, diaforasi e sale di tetrazolio e incubare.

LDH ossida il lattato a piruvato, con contemporanea riduzione del coenzima NAD+ a NADH.

La diaforasi utilizza il NADH per ridurre il sale del tetrazolio in formazan, un prodotto colorato.

La citotossicità indotta da tensioattivi può essere misurata dall'attività di LDH indicata dalla produzione di formazano.

Dopo aver incubato il PCLS con o senza agenti di test, trasferire 50 microlitri di surnatante e i duplicati in una nuova piastra a 96 pozzetti. Questo genera duplicati da ogni pozzetto trattato di una piastra a 24 pozzetti.

Immediatamente prima del saggio, preparare una master-mix della soluzione di lavoro del reagente LDH mescolando accuratamente 125 microlitri di soluzione catalizzatrice con 6,25 millilitri di soluzione colorante per una piastra a 96 pozzetti. Quindi, pipettare 50 microlitri della soluzione di lavoro master-mix in ciascun pozzetto che contiene già 50 microlitri di surnatante e incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, misurare l'assorbimento di ciascun pozzetto a 492 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre e sottrarre il riferimento di assorbimento a 630 nanometri da quello a 492 nanometri.