Valutazione dell'efficacia di un composto di test antivirale attraverso un test di inattivazione virale

Assumere provette con un virus dell'epatite C ricombinante o una sospensione di HCV contenente RNA che codifica per un reporter di luciferasi secreta.

Aggiungere un composto per il test antivirale e un solvente alle provette per il test e al controllo negativo.

I composti in esame si legano alle glicoproteine dell'HCV, inattivando il virus.

Dopo l'incubazione, diluire le miscele per evitare interazioni composto-cellula nelle fasi successive.

Aggiungere queste miscele diluite su monostrati di epatoma che supportano la replicazione dell'HCV. Incubare.

L'HCV inattivato dal composto non può legarsi a specifici recettori della superficie cellulare, mentre le glicoproteine attive dell'HCV si legano a questi recettori, facilitando l'adesione cellulare.

Rimuovere gli HCV non adsorbiti. Lavare con tampone e aggiungere il terreno. Incubare per un periodo prolungato.

L'HCV legato viene internalizzato, rilasciando RNA virale e portando alla sintesi di proteine virali e luciferasi, secrete dalla cellula.

Raccogli i surnatanti della coltura contenenti luciferasi. Centrifugare e aggiungere un substrato di luciferasi ai surnatanti.

La luciferasi ossida il substrato, emettendo luce.

Una luminescenza più elevata nel pozzetto di controllo rispetto al test indica l'inattivazione virale da parte del composto.

Per iniziare il test di inattivazione virale, in primo luogo, piastra 1 volte 10 al quarto cellulare per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte per il fissaggio. Per l'infezione, preparare il virus dell'epatite C con tag Gaussia luciferasi reporter o le particelle HCV, come indicato nel protocollo di testo.

In una provetta sterile, mescolare 100 microlitri di CHLA o PUG 100 micromolari con 100 microlitri di 10 alla quarta unità di formazione del fuoco o FFU di HCV. Per un controllo positivo, mescolare l'HCV con l'eparina a una concentrazione finale di 1.000 microgrammi per millilitro. Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore.

Dopo tre ore, diluire la miscela di composti virali 50 volte con 9,8 millilitri di terreno basale a temperatura ambiente. Quindi, preparare una nuova miscela di composti virali e diluire immediatamente questa miscela in terreno basale per il campione di incubazione a zero ore. Dopo aver rimosso il terreno di incubazione dalle cellule, aggiungere 100 microlitri di soluzione virale diluita per pozzetto in triplicato.

La soluzione ora contiene 10 al secondo FFU per pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire l'infezione virale delle cellule. Dopo l'incubazione, rimuovere la sospensione virale dai pozzetti e lavare delicatamente le cellule con 200 microlitri di PBS due volte.

Incubare le cellule in 100 microlitri di terreno basale per 72 ore per la replicazione virale e il rilascio di luciferasi reporter nel surnatante. Quindi, raccogliere i surnatanti dalle colture in microprovette e centrifugare a 17.000 volte g per 5 minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Mescolare 20 microlitri di ciascun surnatante con 50 microlitri di reagente per il dosaggio della luciferasi Gaussia e misurare la luminescenza dell'attività del reporter della luciferasi in un luminometro.