Analisi della relazione antigenica tra i virus utilizzando un saggio di microneutralizzazione basato su immagini

Aggiungere terreni e antisieri trattati con enzimi diluiti in serie su monostrati di cellule di mammifero, impedendo il legame con virus aspecifici.

Aggiungere una sospensione del virus dell'influenza. Gli anticorpi antisieri, specifici per le proteine virali, si legano, neutralizzano i virus e impediscono l'ingresso cellulare.

Una bassa concentrazione di anticorpi neutralizzanti o anticorpi non neutralizzanti consente un legame inefficace dell'antigene virale, consentendo l'adesione del virus ai recettori cellulari.

Elimina i supporti. Applicare un terreno contenente cellulosa, formando un rivestimento semisolido.

Il virus utilizza il macchinario della cellula ospite per formare particelle virali e causare la lisi cellulare.

La sovrapposizione limita il movimento del virus, facilitando l'infezione localizzata e creando buchi nei monostrati cellulari.

Rimuovere la sovrapposizione. Fissare e permeabilizzare le cellule.

Lavare con tampone. Aggiungere anticorpi che legano gli antigeni virali all'interno delle cellule permeabilizzate.

Pipetta di anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano che si legano agli anticorpi primari.

Introdurre substrati di perossidasi e perossido di idrogeno, ottenendo un prodotto blu.

Pozzetti di immagine per quantificare le popolazioni cellulari infettate da virus rispetto alle diluizioni di antisiero.

Identificare le diluizioni degli antisieri che indicano una riduzione specificata in una popolazione cellulare infetta per determinare i titoli di neutralizzazione.

Per effettuare la neutralizzazione del virus, preparare il monostrato cellulare con due o tre giorni di anticipo, quindi aggiungere 50 microlitri di VGM a ciascun pozzetto della piastra. Utilizzare le colonne 11 e 12 rispettivamente per il controllo dei virus e il controllo delle cellule. Aggiungere aliquote da 50 microlitri di una diluizione 1 su 20 dell'enzima che distrugge il recettore o del siero trattato con RDE alla prima riga delle colonne da 1 a 10.

Eseguire due diluizioni seriali trasferendo 50 microlitri dalla fila A alla fila H e scartando 50 microlitri dalla fila H. Quindi, aggiungere 50 microlitri di diluente a ciascun pozzetto della colonna di controllo cellulare. Aggiungere 50 microlitri di virus a ciascun pozzetto della piastra, ad eccezione della colonna di controllo cellulare. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due o tre ore. Quindi, rimuovere l'inoculo e aggiungere la sovrapposizione a ciascun pozzetto. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius indisturbata. Quindi, fissare e colorare le piastre.

Per quantificare la neutralizzazione, posizionare una piastra a pozzetti nell'area di scansione di uno scanner piano. Scansiona la piastra ed esegui il software di lettura delle piastre a pozzetti per calcolare i titoli virali richiesti.