Name: Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Impara a isolare oligomeri di PrP solubili e insolubili dal cervello umano normale mediante omogenizzazione, sedimentazione in gradiente di saccarosio, cromatografia e cattura con G5P. Questo metodo avanza la ricerca sulle malattie neurodegenerative.

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Il autori sono grati al cervello umano e spinale Resource Center del fluido (Los Angeles, CA) per la fornitura di campioni di cervello normale. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, la Fondazione CJD, Alliance biosicurezza, così come il Centro Universitario on Aging e la salute, con il sostegno della Fondazione McGregor e Fondo discrezionale del Presidente (Case Western Reserve University) .

1. Preparazione di omogenato cerebrale e detergente-solubili (S2) e-insolubile (P2) Frazioni <ol><li> Prendere 100 mg di tessuto congelato cervello umano e aggiungere 100 microlitri tampone di lisi (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4). </li><li> Omogeneizzare il ghiaccio con pestello azionato da un motore cordless, congelare in ghiaccio secco per 5 minuti e omogeneizzare nuovamente con pestello guidata da mani e poi dal motore, e aggiungere 300 ml o 800 microlitri tampone di lisi (questo è o il 20 % o 10% omogenato cerebrale totale, rispettivamente). </li><li> Centrifugare il 20% o il 10% omogenato cerebrale totale a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C per raccogliere il supernatante (S1) utilizzando una centrifuga da banco. </li><li> Ultracentrifuga 10% S1 a 35.000 rpm (100.000 xg) in un rotore SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) per 1 ora a 4 ° C. Trasferire i supernatanti (S2) che contengono il detersivo frazione solubile in una provetta pulita. Risospendere i pellet che contengono detergente-insolubilifrazione (P2) in 100 microlitri o 200 microlitri del tampone di lisi per fare 10 - o 5-fold preparato concentrato. </li><li> Per PK-digestione, incubare il campione con le stesse quantità di PK a 50 pg / ml a 37 ° C per 1 ora per entrambe le frazioni S2 e P2. Aggiungere fluoruro fenilmetilsulfonil alla concentrazione finale di 5 mM e volumi uguali di tampone campione SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-mercaptoetanolo, 10% glicerolo, 50 mM Tris, pH 6,8) per terminare la digestione PK. Bollire i campioni per 10 minuti e raffreddarli alla temperatura ambiente per 5 min. Sono pronti per Western blotting. </li></ol> 2. Sedimentazione Velocità in Gradienti Passo saccarosio <ol><li> Incubare S1 450 ul 20% con un volume uguale del 2% sarcosile in H 2 O per 30 min in ghiaccio. </li><li> Aggiungere 0,5 ml ciascuna di 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, e 10% di saccarosio in una provetta con un Beckman massima capacità di 5 ml. </li><li> Caricare 0,4 ml di S1 ​​sulla cima del gradiente di saccarosio 10-60% passo. </li><li> Centrifugare a 48.000 giri (200.000 xg, SW55 rotore) per 1 ora, a 4 ° C. </li><li> Raccogliere 283 microlitri ciascuna frazione dalla parte superiore del tubo e ottenere 12 frazioni in totale. </li><li> Prelevare 20 ml di ogni frazione in una nuova provetta Eppendorf, aggiungere 20 microlitri di buffer del campione, e far bollire per 10 minuti. </li><li> Campioni fresco per 4 min in cappuccio, centrifugare a 1000 xg per 1 min e vortice di loro. Caricare i campioni su un pre-cast gel. </li></ol> 3. Size Exclusion Chromatography <ol><li> Utilizzare Superdex 200 biglie HR (Pharmacia, Uppsala, Svezia) in una colonna di 30 x 1 cm a determinare lo stato oligomerico di molecole PrP. </li><li> Sette marcatori molecolari di massa (Sigma, St. Louis, MI) tra cui Destrano blu (2.000 kDa), tireoglobulina (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amilasi (200 kDa), l&#39;alcol deidrogenasi (150 kDa), albumina ( 66 kDa) e dell&#39;anidrasi carbonica (29 kDa) vengono caricati in modo indipendente alle concentrazioni raccomandate da Sigma in 200 volumi di campione pl. </li><li> Il volume di eluizione di blu DEXTran viene utilizzato per determinare il volume di vuoto (V 0 = 8,45 ml) e il volume totale (V t = 24 ml) viene fornito dall&#39;operazione prodotto. I volumi di eluizione di picco (V e) sono calcolati dal cromatogramma e ritenzioni frazionari. K av, il coefficiente di partizione (definire il comportamento del campione), viene calcolato usando l&#39;equazione: K av = (V e - V 0) / (t V - V 0). La curva di calibrazione è determinata tracciando la av K delle norme contro la proteina MW log del standard 8. </li><li> Il peso molecolare (MW) delle specie diverse PrP recuperati in diverse frazioni FPLC è valutato in base ad una curva di calibrazione generata con il gel filtrazione di standard diversi. </li><li> Iniettare 200 S1 pl in tampone di lisi contenente 1% sarcosile nella colonna per ciascuna corsa. </li><li> La cromatografia viene effettuata in un sistema FPLC (GE Healthcare) ad una portata di 0,25 ml / min e la fraziones da 0,25 ml ciascuno sono raccolte usando un collettore di frazioni (Amersham Biosciences, RediFrac). </li><li> Incubare 0,125 ml ciascuna frazione con 0,5 ml di metanolo pre-raffreddata a -20 ° C per 2 h. </li><li> Centrifugare i campioni a 13.000 xg per 30 min a 4 ° C in microcentrifuga. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 20 microlitri tampone campione SDS come detto sopra, bollire per 10 minuti, raffreddare a temperatura ambiente, caricarli su un pre-cast gel. </li></ol> 4. Cattura di PrP da G5p <ol><li> La molecola G5p (100 mg) (gentilmente fornito da Drs. Geoff Kneale e John McGeehan presso l&#39;Università di Portsmouth, Regno Unito) è coniugato a 7 x 10 8 tosile attivato sfere magnetiche incubando 100 G5p mg e 350 perle G5p ul in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C per 20 ore. Attrarre G5p-perle al fianco di tubi Eppendorf da esterno forza magnetica e quindi rimuovere tutta la soluzione. Lavare le perline con 1 ml di PBS contenente0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) per tre volte. </li><li> Incubare le G5p-coniugati perline in 1 ml di 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 contenente 0,1% BSA a 37 ° C per 5 ore per bloccare il legame non specifico e quindi lavare le perline con 1 ml di PBS contenente BSA 0,1% per tre volte come indicato sopra. Rimuovere la soluzione e aggiungere 1 ml di PBS nelle perline. Le perle G5p preparati sono stabili per almeno 3 mesi a 4 ° C. </li><li> La cattura di PrP da G5p viene effettuato incubando 100 ul frazioni S1 o P2 con 60 pl perline G5p coniugate (10 mcg di proteine ​​/ 6 x 10 7 perline) in 1 ml di tampone di legame (3% Tween-20, NP-3% 40 in PBS, pH 7,5). </li><li> Dopo incubazione con rotazione costante per 3 ore a temperatura ambiente, le PrP contenenti perline G5p sono attratti fianco di provette Eppendorf da esterno forza magnetica, consentendo una facile rimozione di tutte le molecole non legate nella soluzione. </li><li> Dopo tre lavaggi in tampone di lavaggio (2% Tween-20 e 2% NP-40 in PBS, pH 70,5), perle G5p sono raccolti e riscaldata a 95 ° C per 5 minuti nel tampone campione SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glicerolo, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8). </li><li> Dopo aver raffreddato i campioni per 5 minuti a temperatura ambiente, i campioni vengono centrifugati a 1000 xg per 5 min a temperatura ambiente. I surnatanti sono pronti per Western blotting. </li></ol> 5. Western Blotting <ol><li> Caricare i campioni bollito nel tampone campione SDS sul 15% Tris-HCl Criterio prefabbricati gel (Bio-Rad) a 150 V per ~ 80 min. </li><li> Le proteine ​​su gel sono trasferiti PVDF per 2 ore a 70V. </li><li> Dopo aver bloccato le membrane in 5% di latte in soluzione salina tamponata Tris contenente 0,01% Tween-20 (TBS-T), le membrane sono incubate per 2 ore a temperatura ambiente con anticorpo 3F4 primari monoclonali o policlonali (1:40.000), 1E4 (1 : 1.000), anti-N 8 (1:6,000), o anti-C 8 (1:6,000) per sondare la molecola PrP. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con HRP-coniugato pecora anti-topo IgG a1:3000, o asino anti-IgG di coniglio a 1:3000 le bande PrP sono visualizzati su pellicola Kodak con ECL Plus, in conformità con il protocollo del produttore. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Rispetto ai campioni sporadiche CJD, una piccola quantità di IPRP C è stato rilevato nella frazione P2 in cervelli normali, anche se la maggior parte di PrP C è stato recuperato nella frazione S2 (figura 1). Come indicato in precedenza 8, conti IPRP circa il 5-25% della PrP totale compresa full-length e specie N-terminale troncati. Analisi con passo sedimentazione gradiente di saccarosio ha rivelato che mentre la maggior parte di PrP C da non-CJD cervello è stato recuperato nelle frazioni migliori 1-3, piccole quantità di PrP sono state rilevate anche nelle frazioni inferiori 9-11 che normalmente contengono grandi aggregati 8 (Figura 2). Una varietà di specie di PrP Sc suonòING da monomeri, oligomeri a piccoli aggregati più grandi sono stati isolati per filtrazione su gel nel cervello di Creutzfeldt-Jakob (Figura 3A). Tuttavia, una piccola quantità di aggregati più grandi con peso molecolare superiore a 2000 kDa è stata rilevata in frazioni insolubili di cervelli normali (Figura 3C). Inoltre, dimeri e tetrameri PrP C non sono stati rilevati solo in frazioni insolubili ma anche in frazioni solubili (Figura 3B e 3C). Dopo il trattamento PK e PNGase, la PrP catturato da G5p è stato rilevato con l&#39;anticorpo 1E4 contro PrP97-105 8. Tre PK-resistenti frammenti nucleo definito PrP * 20, * 19 PrP, e PrP * 7 sono stati rilevati, la migrazione a ~ 20 kDa, 19 kDa e ~ ~ 7 kDa, rispettivamente (figura 4, pannello di sinistra). Tuttavia, non è stata rilevata PrP quando l&#39;anticorpo 1E4 è stato pre-incubate con un peptide sintetico che ha una sequenza identiCal per il 1E4 epitopo (Figura 4, pannello centrale), che indica che le bande rilevati da 1E4 sono frammenti di PrP. Inoltre, l&#39;anticorpo anti-C rivelato due frammenti PrP differenti migrano a ~ 18 kDa (PrP * 18) e ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), oltre a PrP * 20 (figura 4, pannello di destra). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> Figura 1. Rilevazione di IPRP C e IPRP Sc. Dopo il trattamento con PNGase F a 1/10 del volume totale di reazione a 37 ° C per 1 ora per rimuovere glicani dalla proteina a tutta lunghezza o N-terminale troncata specie PrP nelle frazioni solubili e insolubili (S2 e P2) isolato da ultracentrifugazione in campioni cerebrali di controllo normale (CTL) e la MCJ sporadica (MCJ) sono stati rilevati con 3F4 contro PrP106-112 (pannello di sinistra), anti-N contro PrP23-40 (pannello centrale), e anti-C contro PrP220-231 (pannello di destra). In campioni CTL, una piccola quantità di PrP viene rilevato in P2, mentre una grande quantità è presente in S2. In contrasto, più PrP viene rilevato in P2 che in S2 in campioni sCJD. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> Figura 2. Sedimentazione di PrP in gradienti di saccarosio passo. PrP in frazioni individuali da 1 a 11 di S1 ​​cerebrali non CJD campione è stato rilevato mediante Western blotting con 3F4. Sebbene la maggior parte di PrP C è stato rilevato in frazioni migliori 1-3, piccole quantità di PrP sono stati osservati anche in frazioni inferiori 9-11. Inoltre, il disegno a strisce di PrP dall&#39;alto e dal basso è diverso: PrP recuperati nelle frazioni migliori dominante ha una banda superiore mentre PrP recuperati nelle frazioni di fondo ha una banda inferiore dominante. A PK-trattati PrP Sc è stato caricato come un controllo sul lato destro del blot. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Rilevazione di solubili e insolubili PrP C oligomeri. Solubili e insolubili C PrP da cervelli umani normali sono stati separati mediante ultracentrifugazione e quindi sottoposta a gel filtrazione, rispettivamente. Le dimensioni molecolari delle frazioni individuali sono stati misurati eseguendo un gruppo di marcatori di massa molecolare. (A) PrP Sc specie da campioni di cervello sCJD. Due popolazioni di specie di PrP sono stati rilevati: frazioni gel filtrazione 49-65 contengono monomeri e gli oligomeri di piccole dimensioni, mentre le frazioni 27-33 contengono aggregati di grandi dimensioni. Le specie di PrP C frazione solubile (S2) (B) e la frazione insolubile (P2) (C) dei controlli normali sono stati rilevati. PRP è stato sondato con l&#39;anticorpo 3F4. Dimeri (frazione 55) e tetrameri frazione (51) di PrP sono stati rilevati in P2 non solo, ma anche in S2 di sampl cervello normalees (B e C). Grandi aggregati sono stati rilevati solo in P2 di campioni normali (C). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> Figura 4. Individuazione di vari PK-resistenti frammenti IPRP in G5p arricchiti di preparati di cervelli umani normali. Campioni arricchiti da G5p stati trattati con PK e F PNGase prima Western blotting tastatura con 1E4 (pannello sinistro), 1E4 pre-incubate con un peptide sintetico che aveva una sequenza identica al epitopo 1E4 (pannello centrale), e anti-C ( pannello di destra). 1E4 rilevato tre PK-resistenti frammenti PrP chiamato PrP * 20, * 19 PrP, e PrP * 7 (pannello sinistro). Dopo il blocco dei 1E4 con il peptide, non res PrP sono stati rilevati (pannello centrale), che indica che le bande rilevate con 1E4 sono frammenti di PrP. Anti-C ha rivelato due aggiunta PK-resistenti frammenti di PrP chiamata PrP * 18 e PrP-CTF12 /13, oltre a 20 * PrP.

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions.+Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li>
<li>Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li>
<li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li>
<li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li>
<li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+%28SAF%29+has+the+same+size%2C+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+%28PrP%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li>
<li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li>
<li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+prions+lying+in+wait%3A+a+two-hit+model+of+prion%2Famyloid+formation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li>
<li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li>
<li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variably+protease-sensitive+prionopathy%3A+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li>
<li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li>
<li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZou%2C+WQ+%22Methods+in+Molecular+Biology-Neurogenetics%3A+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols</a>. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).</li>
<li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La combinazione di approcci riportati qui isola costantemente aggregati insolubili PrP C e oligomeri solubili PrP C dal cervello umano normale. Ultracentrifugazione a 100.000 xg per un&#39;ora è un metodo classico che è stato ampiamente utilizzato per la separazione del insolubile PrP Sc dal solubile PrP C 14. Mentre è efficiente, una delle precauzioni per evitare la contaminazione è durante tirando il supernatante (S2) dopo centrifugazione. Dato che il profilo di gel IPRP <su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Fluoruro fenilmetilsulfonil </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM di 2-propanolo </td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml in H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuga LE-80K, rotore SW55 </td><td> Beckman Coulter </td><td> Codice 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR perline </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC sistema </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Marcatori di peso molecolare </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Varia </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 grani magnetici </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo 3F4 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo 1E4 </td><td> Cella Scienze </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Pronti gel 15% Tris-HCl pre-cast gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di oligomeri prp solubili e insolubili nel cervello umano normale

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

L&#39;evento centrale nella patogenesi delle malattie da prioni comporta una conversione del host-encoded cellulare della proteina prionica PrP C nella sua isoforma patogenicità PrP Sc 1. PrP C è solubile in detergenti e sensibile alla proteinasi K (PK)-digestione, mentre PrPSc forma detergente-insolubili aggregati ed è parzialmente resistente alla PK 2-6. La conversione di PrP C a PrP Sc è noto per coinvolgere una transizione conformazionale di α-elica di β-sheet strutture della proteina. Tuttavia, il percorso in vivo è ancora poco conosciuta. Un tentativo endogena PrP Sc, intermedia * PrP o &quot;prione silenziosa&quot;, deve ancora essere identificato nel cervello non infetti 7. Usando una combinazione di approcci biochimici e biofisici, abbiamo identificato insolubili PrP aggregati C (designato IPRP C) da non infettati cervello dei mammiferi e in coltura neuronalecellule 8, 9. Qui si descrivono le modalità dettagliate di questi metodi, tra cui ultracentrifugazione in tampone detergente, passo sedimentazione gradiente di saccarosio, cromatografia di esclusione sterica arricchimento IPRP dal gene 5 proteine ​​(G5p) che si legano specificamente a forme di PrP strutturalmente alterati 10 e PK-trattamento. La combinazione di questi approcci isolati non solo insolubile PrP Sc e PrP aggregati C ma anche oligomeri solubili PrP C dal cervello umano normale. Dato che i protocolli qui descritti sono stati utilizzati per isolare sia PrP Sc da cervelli infetti e IPRP C da cervelli sani, ci offrono l&#39;opportunità di confrontare le differenze nelle caratteristiche fisico-chimiche, neurotossicità, e la loro infettività tra le due isoforme. Tale studio migliorerà notevolmente la nostra comprensione dei patogeni infettivi proteici. La fisiologia e la fisiopatologia della IPRP C non sono chiari al momento. In particolare, in un recente identified malattia prionica umana chiamata variabile sensibile alle proteasi prionopathy, abbiamo trovato un nuovo PrPSc che condivide il comportamento immunoreattivo e frammentazione con IPRP C 11, 12. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che IPRP C è la specie principale che interagisce con la proteina amiloide-β nella malattia di Alzheimer 13. Nello stesso studio, questi metodi sono stati usati per isolare aggregati di Abeta e oligomeri nella malattia di Alzheimer 13, suggerendo loro applicazione non prioni aggregati proteici coinvolti in altre patologie neurodegenerative.

Una nuova specie di proteina prionica cellulare (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) È stato recentemente identificato in cervelli umani non infetti utilizzando i metodi qui descritti. Questi metodi possono essere usati per isolare specie diverse PrP, mentre alcuni di essi sono anche utili per isolare altri aggregati di proteine ​​mal ripiegate dal cervello umano.

Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

L'evento centrale nella patogenesi delle malattie da prioni comporta la conversione della proteina prionica cellulare PrPC, codificata dall'ospite, nella sua isoforma patogena...

Lo scopo di questa procedura è isolare la frazione proteica solubile e insolubile di pion o PRP da tutti i legamenti nel cervello umano normale. Questo viene ottenuto prima omogeneizzando il tessuto cerebrale umano e isolando le frazioni. Successivamente, viene eseguita una sedimentazione per velocità in gradienti a gradini di saccarosio.Successivamente viene effettuata una cromatografia a esclusione molecolare. Infine, il PRP viene isolato mediante la proteina genica cinque o G cinque P. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'isolamento di PRP o legamenti solubili e insolubili dal cervello umano normale attraverso ultracentrifugazione in gradienti discontinui di saccarosio, cromatografia a esclusione molecolare e cattura del PRP con G cinque P. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sulle malattie da prioni, tra cui la malattia di Creutzfeldt-Jakob, l'encefalopatia spongiforme bovina e le malattie da cachessia clinica. Inoltre, può fornire informazioni sull'isolamento di proteine ogas solubili e insolubili, non solo per le malattie da prioni, ma anche per altre patologie come la malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson

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Questo video mostra il protocollo per isolare le fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale di topo utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità e la digestione di proteine non amiloidi.

Isolamento delle fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale

Questo video spiega il processo di isolamento e arricchimento di aggregati proteici insolubili come detergenti da tessuto cerebrale umano congelato post mortem. Illustra i passaggi chiave, tra cui l'omogeneizzazione, il trattamento con detergenti, la sonicazione e l'ultracentrifugazione per separare e purificare gli aggregati insolubili. La fase finale prevede la solubilizzazione degli aggregati in tampone ureico per ulteriori analisi.

Isolamento di aggregati proteici insolubili con detergenti da tessuto cerebrale umano post-mortem

Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine ​​da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di alfa-sinucleina (α-syn) sempre più insolubile/aggregata da tessuto cerebrale umano post-mortem. Attraverso l'utilizzo di tamponi con forza detergente crescente e tecniche di ultracentrifugazione ad alta velocità, è possibile esaminare le proprietà variabili dell'aggregazione α-syn in tessuti malati e non malati.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per isolare le proteine ​​appartenenti a diversi compartimenti sinaptici.

Frazione di membrana del cervello: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica

Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

Un metodo è descritto per il frazionamento delle specie solubili e insolubili huntingtina mutata dalla coltura delle cellule e del cervello del mouse. Il metodo descritto è utile per la caratterizzazione e la quantificazione del flusso di proteina huntingtina ed aids nell'analizzare omeostasi della proteina nella patogenesi della malattia e in presenza di...

Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.

Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto

Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l'identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.

Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Impara a isolare oligomeri di PrP solubili e insolubili dal cervello umano normale mediante omogenizzazione, sedimentazione in gradiente di saccarosio, cromatografia e cattura con G5P. Questo metodo avanza la ricerca sulle malattie neurodegenerative.

Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

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