Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

Lo scopo di questa procedura è isolare la proteina pione solubile e insolubile o PRP tutti i legamenti nel cervello umano normale. Ciò si ottiene omogeneizzando prima il tessuto cerebrale umano e isolando le frazioni. Successivamente viene eseguita la sedimentazione a velocità nel saccarosio, i gradienti a gradini.

Quindi viene eseguita la cromatografia ad esclusione dimensionale. Infine, il PRP viene catturato con la proteina del gene cinque o G cinque P.In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'isolamento di PRP o legamenti solubili e insolubili dal cervello umano normale attraverso l'ultracentrifugazione in saccarosio, gradienti di gradini, dimensioni, cromatografia di esclusione e cattura di PRP con G cinque P.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sulle pre malattie, tra cui crea ulteriori malattie dello sciacallo, encefalopatia del pontone BO e malattie da deperimento clinico. Inoltre, possono fornire informazioni sull'isolamento di proteine solubili e insolubili, non solo per le malattie ioniche, ma anche per altre malattie come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson.

In generale, gli individui che non conoscono questi metodi avranno difficoltà perché tutte le fasi sperimentali sono importanti, che richiedono un'attenzione extra. La dimostrazione video di questo messaggio è fondamentale in quanto il SEC Fi è la grandezza della profondità e l'acquisizione PRP con G cinque P, questi passaggi sono difficili da nominare e potrebbero essere equi senza un'operazione più precisa. Per preparare un omogeneizzato cerebrale iniziare aggiungendo 100 microlitri di tampone di lisi a 100 milligrammi di tessuto cerebrale congelato utilizzando un pestello motorizzato, omogeneizzare il tessuto sul ghiaccio, congelarlo su ghiaccio secco per cinque minuti e omogeneizzarlo di nuovo.

Preparare un omogeneizzato cerebrale totale al 20% o al 10% aggiungendo rispettivamente 300 o 800 microlitri di tampone di lisi. Utilizzando una centrifuga da banco, centrifugare l'omogeneizzato a 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere l'SNA in una centrifuga a rotore S SW 55 la frazione S one a 35.000 giri/min per un'ora a quattro gradi Celsius.

Trasferire il supinato in una provetta pulita Resus. Sospendere il pellet insolubile del detergente nel tampone di lisi per preparare i campioni per il western blot. Incubare le frazioni S due e P due con 50 microgrammi per millilitro di proteinasi K per un'ora a 37 gradi Celsius.

Terminare la digestione aggiungendo cinque millimolari di PMSF e SDS tampone per campioni. Far bollire i campioni per 10 minuti e chiamarli a temperatura ambiente per cinque minuti Per eseguire la sedimentazione a velocità, iniziare incubando 450 microlitri di 20%S una frazione con un volume uguale di 2%Sarco X acqua su ghiaccio per 30 minuti in provette da centrifuga da cinque millilitri. Aggiungere 0,5 millilitri ciascuno di 60, 30, 25, 20 15 e 10% di saccarosio caricare 0,4 millilitri dell'incubatrice S one sulla parte superiore del 10-60% di saccarosio.

I gradienti a gradini centrifugano in un rotore SW 55 a 48.000 giri/min per un'ora a quattro gradi Celsius dalla parte superiore del tubo. Raccogli 12 frazioni uguali da 283 microlitri ciascuna. Utilizzare 20 microlitri da ciascuna frazione e un volume uguale di tampone campione SDS.

Per preparare campioni di gel della pagina SDS. Far bollire i campioni per 10 minuti, quindi chiamarli per quattro minuti. Centrifugare i campioni a 1000 G per un minuto.

Quindi vorticali prima di caricarli su un gel prefabbricato di esclusione dimensionale. La cromatografia viene utilizzata per determinare lo stato oligomerico delle molecole di PRP. Iniziare caricando volumi di campione da 200 microlitri di sette singoli marcatori di massa molecolare su una colonna uno per 30 di perle SUEx 200 HR.

Utilizzare il volume eluciano del destrano blu come volume vuoto. Calcola i volumi eluciani di picco di VE dal cromatogramma e dalle ritenzioni frazionarie. Calcola KAV il coefficiente di partizione usando l'equazione KAV uguale a V meno V zero su VT meno V zero.

Per generare una curva di calibrazione. Tracciare il KAV degli standard proteici rispetto al peso molecolare logaritmico degli standard. Successivamente, applicare 200 microlitri di S one sulla colonna a una portata di 0,25 millilitri al minuto.

Lavare la colonna con tampone di lisi 1%cile e utilizzando un collettore di frazioni eluire frazioni di 0,25 millilitri. Incubare 125 microlitri da ciascuna frazione con 500 microlitri di metanolo pre-raffreddato a meno 20 gradi Celsius per due ore. Centrifugare i campioni a 13.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Reese, piegare il pellet in 20 microlitri di tampone campione SDS far bollire per 10 minuti. Chiamare a temperatura ambiente e risolvere su gel di poliacrilammide al 15%. Utilizzare la curva standard per estrapolare i pesi molecolari delle varie specie di PRP recuperate per coniugare la molecola G five P alle sfere magnetiche.

Incubare 100 microgrammi di G cinque P con 350 microlitri di perle magnetiche attivate toci in un millilitro di PBS a 37 gradi Celsius per 20 ore. Utilizzare un magnete esterno per attirare le perle G five P sulla parete laterale delle provette Eppendorf e rimuovere la soluzione. Lavare le perline tre volte con un millilitro di PBS 0,1%BSA per bloccare il legame non specifico.

Incubare le perle coniugate G cinque P in un millilitro di tris 0,2 molo, HCL pH 7,4 contenente lo 0,1% di BSA per cinque ore a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le perline tre volte. Togliere l'ultimo lavaggio e aggiungere un millilitro di PBS per isolare il PRP, incubare 100 microlitri di S uno o P due con 60 microlitri di perle coniugate G cinque B in un millilitro di tampone legante a rotazione costante per tre ore a temperatura ambiente.

Posizionare il tubo sul magnete. Rimuovere la soluzione e lavare le perle tre volte con un tampone di lavaggio. Rimuovere il lavaggio finale e aggiungere il tampone campione SDS.

Scaldare le perline a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Caricare i campioni su gel prefabbricati al 15% e farli funzionare a 150 volt per circa 80, 80 minuti. Trasferire le proteine in PVDF a 70 volt per due ore dopo aver bloccato le membrane nel latte al 5% in TBST.

Incubarli per due ore a temperatura ambiente con gli anticorpi PRP. Tre F, quattro, uno, E, quattro, anti N o anti C dopo l'incubazione con anticorpi secondari coniugati HRP, incubano la membrana e la soluzione di chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore ed espongono il film come si vede qui, rispetto ai campioni sporadici di malattia di jaakko con valvola CRUT o CJD. Una piccola quantità di PRP cellulare insolubile è stata rilevata nella frazione P 2 da cervelli normali.

Tuttavia, la maggior parte è stata recuperata nella frazione S due. Il PRP insolubile rappresenta circa il 5-25% del PRP totale, comprese le analisi delle specie troncate a tutta lunghezza e all'estremità terminale utilizzando la sedimentazione a gradiente di saccarosio hanno rivelato che mentre la maggior parte del PRPC da cervelli non CJD è stato recuperato nelle frazioni superiori, tre piccole quantità di PRP sono state rilevate anche nelle frazioni inferiori nove 11 che normalmente contengono grandi aggregati. Una varietà di specie patogene di PRP o PRP SC, che vanno dai monomeri.

I legamenti più piccoli e gli aggregati più grandi sono stati isolati mediante filtrazione su gel nel cervello con la malattia di yakup della valvola CRUT. Sorprendentemente, una piccola quantità di aggregati più grandi con una scia molecolare superiore a 2000 kilodalton è stata rilevata anche in frazioni insolubili di cervelli normali. Inoltre, dimeri e tetrameri di PRPC non sono stati rilevati solo nelle frazioni insolubili, ma anche nelle frazioni insolubili.

Dopo il trattamento con PK e P NGA. Il PRP catturato da G 5 P è stato rilevato con l'anticorpo E 4 contro PRP 97 1 0 5 3. I frammenti del nucleo resistenti alla PK denominati asterisco PRP 20, asterisco PRP 19 e asterisco PRP sette sono stati rilevati migrare rispettivamente a 20 Dawson killer, 19 kilodalton e sette kilodalton.

Tuttavia, non è stato rilevato alcun PRP quando l'anticorpo E quattro è stato preincubato con un peptide sintetico che ha una sequenza identica all'epitopo E quattro, indicando che le bande rilevate da un E quattro sono frammenti di PRP. L'anticorpo anti C ha rilevato due diversi frammenti di PRP che migrano a circa 18 kilodalton e circa 12-13 kilodalton. Oltre al metodo PRP ETE 20 Once.

Questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il PRP poligamo solubile e insolubile nel cervello umano inferiore dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca sul destino di prima di esplorare le informazioni di conferma PIP nel cervello.