Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

Lo scopo di questa procedura è isolare la proteina pion solubile e insolubile o PRP da tutti i legamenti nel cervello umano normale. Questo viene ottenuto prima omogeneizzando il tessuto cerebrale umano e isolando le frazioni. Successivamente, viene eseguita una sedimentazione a velocità in gradienti a gradini di saccarosio.

Successivamente viene effettuata una cromatografia a esclusione molecolare. Infine, il PRP viene isolato mediante la proteina genica cinque o G cinque P. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'isolamento di PRP o legamenti solubili e insolubili dal cervello umano normale attraverso ultracentrifugazione su gradienti discontinui di saccarosio, cromatografia a esclusione molecolare e cattura del PRP con G cinque P. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sulle malattie da prioni, tra cui la malattia di Creutzfeldt-Jakob, l'encefalopatia spongiforme bovina e le malattie da cachessia clinica. Inoltre, può fornire informazioni sull'isolamento di proteine ogas solubili e insolubili, non solo per le malattie da prioni, ma anche per altre patologie come la malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson.

Generalmente, le persone alle prime armi con questi metodi incontreranno difficoltà poiché tutti i passaggi sperimentali sono importanti e richiedono particolare attenzione. La dimostrazione video di questa procedura è fondamentale, poiché la SEC Fi presenta una notevole profondità e il recupero del PRP con G cinque P risulta complesso da descrivere ed è possibile che non risulti chiaro senza un'operazione più precisa. Per preparare un omogenato cerebrale, iniziare aggiungendo 100 microlitri di buffer di lisi a 100 milligrammi di tessuto cerebrale congelato utilizzando un pestello motorizzato, omogeneizzare il tessuto sul ghiaccio, congelarlo per cinque minuti sul ghiaccio secco e quindi omogeneizzarlo nuovamente.

Preparare un omogenato totale di cervello al 20% o al 10% aggiungendo rispettivamente 300 o 800 microlitri di buffer di lisi. Utilizzando una centrifuga da banco, centrifugare l'omogenato a 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere la frazione SNA in una centrifuga con rotore S SW 55 e centrifugare la frazione S a 35.000 giri al minuto per un'ora a quattro gradi Celsius.

Trasferire il sopernatante in una provetta pulita per la risospensione. Sospendere il pellet insolubile nel detergente nel buffer di lisi per preparare i campioni per il western blot. Incubare le frazioni S2 e P2 con 50 microgrammi per millilitro di proteinasi K per un'ora a 37 gradi Celsius.

Terminare la digestione aggiungendo PMSF a 5 millimolari e buffer campione SDS. Far bollire i campioni per 10 minuti e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per cinque minuti. Per eseguire la sedimentazione di velocità, iniziare incubando 450 microlitri della frazione 20%S uno con un volume uguale di acqua 2%Sarco X su ghiaccio per 30 minuti in provette da centrifuga da cinque millilitri. Aggiungere 0,5 millilitri ciascuno di saccarosio al 60, 30, 25, 20, 15 e 10%, quindi caricare 0,4 millilitri del S uno incubato sulla parte superiore del gradiente di saccarosio dal 10 al 60%.

Centrifugare con gradiente a gradini in un rotore SW 55 a 48.000 giri al minuto per un'ora a quattro gradi Celsius a partire dalla sommità del tubo. Raccogliere 12 frazioni uguali da 283 microlitri ciascuna. Utilizzare 20 microlitri da ogni frazione e un volume uguale di tampone campione SDS.

Per preparare i campioni per gel SDS-PAGE. Far bollire i campioni per 10 minuti, quindi raffreddarli per quattro minuti. Centrifugare i campioni a 1000 ×g per un minuto.

Quindi vorticare prima di caricarli su un gel preformato per esclusione dimensionale. La cromatografia viene utilizzata per determinare lo stato oligomerico delle molecole di PRP. Iniziare caricando volumi di campione di 200 microlitri di sette marcatori individuali di massa molecolare su una colonna di dimensioni 1 per 30 contenente perle SUEx 200 HR.

Utilizzare il volume eluente del dextrano blu come volume di esclusione. Calcolare i volumi eluenti di picco di VE dal cromatogramma e dalle ritenzioni frazionarie. Calcolare il coefficiente di partizione KAV utilizzando l'equazione KAV uguale a V meno V zero fratto VT meno V zero.

Per generare una curva di calibrazione, riportare il KAV degli standard proteici in funzione del logaritmo del peso molecolare degli standard. Successivamente, applicare 200 microlitri di S uno alla colonna a una velocità di flusso di 0,25 millilitri al minuto.

Lavare la colonna con 1% di tampone di lisi e, utilizzando un raccoglitore di frazioni, eluire frazioni da 0,25 millilitri. Incubare 125 microlitri di ogni frazione con 500 microlitri di metanolo pre-raffreddato a meno 20 gradi Celsius per due ore. Centrifugare i campioni a 13.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Reese, risospendere il pellet in 20 microlitri di tampone campione SDS e bollire per 10 minuti. Portare a temperatura ambiente e risolvere su gel di poliacrilammide al 15%. Utilizzare la curva standard per estrapolare i pesi molecolari delle diverse specie di PRP recuperate per coniugare la molecola G cinque P alle perle magnetiche.

Incubare 100 microgrammi di G cinque P con 350 microlitri di perle magnetiche attivate con toci in un millilitro di PBS a 37 gradi Celsius per 20 ore. Utilizzare un magnete esterno per attirare le perle di G cinque P alla parete laterale delle provette eppendorf e rimuovere la soluzione. Lavare le perle tre volte con un millilitro di PBS 0,1% BSA per bloccare il legame non specifico.

Incubare le perline coniugate con G cinque P in un millilitro di tris 0,2 molare, HCl pH 7,4 contenente lo 0,1% di BSA per cinque ore a 37 gradi Celsius. Successivamente lavare le perline tre volte. Rimuovere l'ultimo lavaggio e aggiungere un millilitro di PBS per isolare PRP; incubare 100 microlitri di S uno o P due con 60 microlitri di perline coniugate con G cinque B in un millilitro di buffer di legame sotto rotazione costante per tre ore a temperatura ambiente.

Posizionare il tubo sul magnete. Rimuovere la soluzione e lavare le perle tre volte con tampone di lavaggio. Rimuovere l'ultimo lavaggio e aggiungere il tampone campione SDS.

Riscaldare le perle a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Caricare i campioni su gel preformati al 15% ed eseguire a 150 volt per circa 80, 80 minuti. Trasferire le proteine su PVDF a 70 volt per due ore dopo aver bloccato le membrane in latte al 5% in TBST.

Incubarli per due ore a temperatura ambiente con gli anticorpi PRP. Tre F quattro uno E quattro anti N o anti C, dopo l'incubazione con anticorpi secondari coniugati con HRP, incubare la membrana e la soluzione chemiluminescente seguendo le istruzioni del produttore ed esporre la pellicola come mostrato qui. Rispetto ai campioni sporadici di malattia da valvola CRUT jaakko o CJD, è stata rilevata una piccola quantità di PRP cellulare insolubile nella frazione P due proveniente da cervelli normali.

Tuttavia, la maggior parte è stata recuperata nella frazione S2. Il PRP insolubile costituisce circa dal 5 al 25% del PRP totale, inclusi gli analiti di specie a lunghezza intera e troncate a livello terminale. Analisi effettuate mediante sedimentazione su gradiente discontinuo di saccarosio hanno rivelato che, mentre la maggior parte del PRPC proveniente da cervelli non affetti da CJD era recuperata nelle frazioni superiori, piccole quantità di PRP sono state inoltre rilevate nelle frazioni inferiori (9-11), che normalmente contengono aggregati di grandi dimensioni. Una varietà di specie patogeniche di PRP o PRPSc, che vanno da monomeri.

Legamenti più piccoli e aggregati più grandi sono stati isolati mediante filtrazione su gel nel cervello con malattia da valvola CRUT yakup. Sorprendentemente, una piccola quantità di aggregati più grandi con un peso molecolare superiore a 2000 chilodalton è stata riscontrata anche nelle frazioni insolubili di cervelli normali. Inoltre, dimeri e tetrameri della PRPC non sono stati rilevati soltanto nelle frazioni insolubili, ma anche in frazioni insolubili.

Dopo il trattamento con PK e P NGAs. Il PRP catturato da G cinque P è stato rilevato con l'anticorpo uno E quattro diretto contro PRP 97 1 0 5 3. Frammenti del core resistenti alla PK, denominati PRP asterisco 20, PRP asterisco 19 e PRP asterisco sette, sono stati rilevati in migrazione rispettivamente a 20 kilodalton, 19 kilodalton e 7 kilodalton.

Tuttavia, nessun PRP è stato rilevato quando l'anticorpo one E four è stato preincubato con un peptide sintetico che presenta una sequenza identica all'epitopo one E four, indicando che le bande rilevate dall'anticorpo one E four sono frammenti di PRP. L'anticorpo anti C ha rilevato due frammenti diversi di PRP che migrano rispettivamente a circa 18 chilodalton e a circa 12-13 chilodalton. Oltre al PRP, metodo ETE 20 Once.

Questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se viene effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la PRP poligama solubile e insolubile nel cervello umano inferiore dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca sul destino della PRP prima di esplorare informazioni sulla sua conferma nel cervello.