Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule iPS da cellule mononucleate di sangue periferico umano adulto utilizzando vettori episomiali non integranti. Questo protocollo può aiutare gli scienziati nel campo delle cellule staminali che desiderano generare cellule iPS per il monitoraggio delle malattie, lo screening dei farmaci e la radiomedicina regolare. Il nostro protocollo di riprogrammazione è molto semplice, ma altamente efficiente.

Seguendo questa procedura, si può facilmente padroneggiare la tecnica di riprogrammazione delle cellule del sangue. La qualità del plasma è altrettanto importante per il successo della riprogrammazione. I contaminanti possono ridurre l'efficienza della riprogrammazione, pertanto si consiglia di utilizzare i kit Endofree per purificare i plasmidi episomiali.

Le cellule iPS sono più fragili di altre cellule. La preparazione di cellule per più di un gene durante il passaggio del gene può indurre massicce morti cellulari, in particolare nei primi passaggi. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i terreni di coltura necessari secondo il manoscritto allegato.

Quindi combinare 10 mL di campione PB fresco e dieci mL di tampone PBS in una provetta da 50 mL e mescolare bene. Portare il PBS a temperatura ambiente o a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Quindi, aggiungere 10 ml di ficoll sul fondo della provetta.

Questo processo deve essere eseguito lentamente per garantire che lo strato di ficoll non si mescoli con il PB. Centrifugare la miscela a 400 x g per 30 minuti con bassa accelerazione e decelerazione. Dopo la centrifugazione, le MNC di PB si trovano nello strato bianco situato tra il plasma di PB e la ficoll. Aspirare lentamente 10 mL di plasma PB senza disturbare lo strato di ficoll di potenziamento.

Quindi raccogliere con cura lo strato bianco in una nuova provetta da 50 mL. Il volume totale delle cellule raccolte dallo strato bianco dovrebbe essere compreso tra tre e sei ml. Successivamente, aggiungere PBS per portare il volume totale a 30 ml e mescolare bene.

Quindi centrifugare il campione a 400 x g per dieci minuti. Dopo dieci minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di terreno di coltura. Mescolare bene e centrifugare il campione a 400 x g per cinque minuti per rimuovere la maggior parte delle piastrine.

Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in uno o due mL di IMDM. Le cellule possono essere utilizzate per la coltura immediata o congelate per un uso successivo. Per la crioconservazione, aggiungere una quantità uguale di terreno di crioconservazione.

Aliquotare le cellule in crioviali e trasferirle immediatamente in un congelatore a 80 gradi Celsius. In questa procedura, preparare cinque mL di terreno IMDM in una provetta da 15 mL. Scongelare rapidamente le PB MNC congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius prima di trasferirle nel tubo con il mezzo IMDM.

Centrifugare il campione a 400 x g per cinque-dieci minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo eritroide. Quindi contare le cellule al microscopio utilizzando un emocitometro.

Successivamente, le MNC PB di coltura in una coltura non tissutale hanno trattato una piastra a sei pozzetti con due mL di terreno per pozzetto a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Il terzo e il quinto giorno, aggiungere un mL di terreno eritroide fresco direttamente in ciascun pozzetto senza cambiare il terreno. Il sesto giorno, raccogli le MNC PB per la nucleofezione.

Un giorno prima della nucleofezione, prerivestire la coltura tissutale trattata con una piastra a sei pozzetti con gelatina allo 0,1% a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Scongelare le cellule di alimentazione MEF inattivate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e trasferirle immediatamente in una provetta da 15 mL contenente cinque mL di terreno MEF. Successivamente, centrifugarli a 400 x g per cinque minuti e rimuovere il surnatante.

Quindi rimuovere la gelatina dalla piastra a sei pozzetti e risospendere il pellet di cella in mezzo MEF. Successivamente, seminare le cellule MEF inattivate in due mL di terreno MEF in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti pretrattata con gelatina e coltivarle a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Il giorno della nucleofezione, aspirare il terreno MEF e sostituirlo con un mL di terreno eritroide.

Quindi pre-equilibrare la piastra di coltura per 10-30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5%. Aggiungere due microgrammi di PEV OCT4 a Sox2, un microgrammo di PEV MYC, un microgrammo di PEV KLF4 e 0,5 microgrammi di PEV Bcl-XL in una provetta sterile da 1,5 mL. Riscaldare il tubo a 50 gradi Celsius per cinque minuti per evitare contaminazioni, quindi raffreddarlo a temperatura ambiente.

Successivamente, aggiungere al campione 57 microlitri di tampone per nucleofecazione e 13 microlitri di tampone per integratori. Raccogliere due volte, da dieci a sesta PBMNC in coltura in una provetta da cinque mL mediante centrifugazione a 200 x g per sette minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante e aggiungere la miscela di plasmidi e tampone nucleofecazione al pellet cellulare.

Quindi mescolare bene muovendo il tubo con un dito. Quindi, trasferire il DNA in sospensione cellulare nella cuvetta fornita dal kit e tappare la cuvetta. Selezionare il programma U-008 sul dispositivo di nucleonucleazione.

Successivamente, inserire la cuvetta nel supporto e premere OK. Successivamente, estrarre la cuvetta dal supporto. Aggiungere 0,5-1 mL di terreno eritroide preriscaldato a ciascuna cuvetta e trasferire immediatamente le cellule sulla piastra MEF pre-bilanciata. Per alcuni campioni, si possono ottenere migliaia di colonie da un mil di sangue.

Se si desidera scegliere una singola colonia per un'ulteriore coltura, potrebbe essere necessario seminare un pozzetto in più con solo 1 milione di cellule. Subito prima di posizionare la camera di ipossia nell'incubatore, scuotere delicatamente la camera più volte per creare una distribuzione uniforme delle cellule nei pozzetti di coltura. Quindi trasferire la piastra in una camera di ipossia.

Lavare la camera con una miscela di gas per uno o due minuti a una velocità di 20 litri al minuto. Successivamente, sigillare la camera e coltivare il campione a 37 gradi Celsius. Il secondo giorno dopo la nucleofezione, aggiungere due mL di terreno iPSC direttamente in ciascun pozzetto.

Il quarto giorno dopo la nucleofezione, rimuovere tre mL di terreno e aggiungere due mL di terreno iPSC fresco. In questa fase, la maggior parte delle cellule vive si è attaccata allo strato di alimentazione. Dopo il sesto giorno dopo la nucleofezione, cambiare il terreno ogni due giorni lasciando 500 microlitri di terreno esaurito e aggiungendo due ml di terreno E8 fresco integrato con 0,25 millimolari di butirrato di sodio fino ai giorni 14-18.

Qui è mostrato uno schema del protocollo per la riprogrammazione delle cellule del sangue periferico. Questa immagine mostra l'AP in piedi nella ciotola, e questa mostra una tipica colonia di iPSC simile all'ESC il giorno 14 dopo la nucleofeczione delle MNC PB. Ecco i diagrammi FACS rappresentativi delle iPSC al passaggio cinque che esprimono TRA-1-60 o SSEA4.

Ecco le immagini confocali rappresentative delle colonie di iPSC che esprimono NANOG e OCT4. Le immagini qui mostrano la colorazione H&E del terratoma, comprendente tutti e tre gli strati germinali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare cellule iPS libere da integrazione da cellule mononucleate del sangue periferico umano.

Una volta padroneggiato, si possono generare grandi quantità di cellule iPS in tre settimane, quindi il tempo a disposizione sarà inferiore a tre ore. Abbiamo sviluppato un semplice sistema di vettori episomiali per un'efficiente riprogrammazione delle cellule del sangue. Riteniamo che questo sistema conveniente possa essere facilmente adottato, in particolare nei piccoli laboratori con risorse limitate.

Non dimenticare che lavorare con sangue e plasma umano può essere pericoloso e devono essere prese precauzioni come indossare guanti e camici da laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.