Name: Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte senza integrazione da cellule mononucleari di sangue periferico umano utilizzando vettori episomiali. Questo metodo efficiente produce migliaia di colonie da 1 mL di sangue.

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Questo lavoro è stato supportato dal Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015CB964902, 2013CB966902 e 2012CB966601), dalla National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 e 81421002), dalla Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015) e dal Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

Tutti i campioni PB umani sono stati ottenuti da donatori adulti anonimi senza informazioni di identificazione disponibili da Tianjin Blood Center con l&#39;approvazione del comitato etico di ricerca locale. 1. Endo-libera plasmidi Preparazione <ol><li> Utilizzare un kit commerciale plasmidi Purificazione Maxi per estrarre i vettori episomiale da E. coli secondo il protocollo del produttore. Per il passo finale, sostituire tampone TE con acqua sterile priva di endotossine per sciogliere il pellet di DNA. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un commerciale UV / Vis spettrofotometro. La concentrazione è di solito superiore a 1 mg / mL, con A260 / A280 e A260 rapporti / A230 superiori, rispettivamente, 1,8 e 2,0,. </li></ol> 2. Culture Media <ol><li> Preparare medio eritroide: ematopoietiche cellule staminali di espansione medio integrato con 100 ng / mL staminali umane Cell Factor (SCF), 10 ng / mL interleuchina-3 (IL3), 2 U / mL Eritropoietina (EPO), 20 ng / mL di insulina Growth Factor-1 (IGF1), 1 micron desametasone e 0,2 mm 1-thioglycerol. Filtro sterilizzare con un filtro siringa da 0,22 micron. medio eritroide può essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese. </li><li> Preparare media iPSC: terreno DMEM / F12 (Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture Dulbecco F-12) integrato con 1x L-glutammina, 1x penicillina / streptomicina, 1x non essenziali soluzione aminoacidi, 50 ng / mL Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2 ), supplemento 1x insulino-transferrina-selenite (ITS), e 50 mg / mL di acido ascorbico. Filtro sterilizzare con un filtro siringa da 0,22 micron. medio iPSC può essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese. </li><li> Preparare MEF media: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM; alta di glucosio) integrata con 1x penicillina / streptomicina e 10% siero fetale bovino (FBS). Filtro sterilizzare con un filtro siringa da 0,22 micron. medio MEF può essere conservato a 4 ° C fino a un mese o appena aggiungere 1x L-glutammina prima dell&#39;uso. </li><li> Pmedio repare COPSI crioconservazione (2x): Sciogliere 5 g di D-trealosio in 30 mL di acqua sterile in un bagno d&#39;acqua 37 ° C. Portare la temperatura a 4 ° C e quindi aggiungere 10 ml di FBS e 10 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Filtro sterilizzare con un filtro siringa da 0,22 micron. Conservare a 4 ° C per un massimo di 3 mesi 24. </li></ol> 3. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PB MNC) <ol><li> Unire 10 ml di campione PB fresco e 10 mL di tampone PBS in un tubo da 50 ml e mescolare bene. Portare PBS per RT o 37 ° C prima dell&#39;uso. NOTA: circa 1 - 3 x 10 6 multinazionali (freschi o crioconservati) può essere ottenuto da 1 ml di PB. Dopo 6 d della cultura, si aspettano di avere 0,5 - 1 x 10 6 cellule totali a causa della morte di cellule mature durante la coltura. Circa 1 x 10 7 cellule possono essere ottenute da 10 mL di PB fresco. </li><li> Aggiungere 10 mL Ficoll al fondo della provetta utilizzando una siringa da 10 ml collegata ad un lungo ago. Questo proprocesso dovrebbe essere fatto lentamente per garantire che lo strato Ficoll non si mescola con il PB. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 30 minuti a una bassa velocità di accelerazione e decelerazione. Dopo la centrifugazione, le multinazionali PB sono nello strato bianco (buffy coat) che si trova tra il plasma PB e il Ficoll. </li><li> Lentamente aspirato ~ 10 mL PB plasma senza disturbare lo strato di buffy coat. raccogliere accuratamente lo strato bianco utilizzando un puntale 1 ml a un nuovo tubo da 50 ml. Il volume totale di cellule raccolte dallo strato bianco sarà fra i 3 - 6 mL. </li><li> Aggiungere PBS per portare il volume totale di 30 ml e mescolare bene con una pipetta 10 ml. Centrifugare a 400 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare in 20 ml di terreno di coltura (IE Iscove Modified medio di Dulbecco, IMDM) e mescolare bene. Centrifugare a 400 xg per 10 minuti per rimuovere la maggior parte delle piastrine. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 - 2 ml IMDM. Le cellule possono essere usate fo la cultura immediato, o congelati-down per un uso successivo. Per crioconservazione, aggiungere una quantità equivalente di mezzo di crioconservazione. cellule aliquota in cryovials (0,5 - 1 ml per fiala) e cryovials trasferimento ad un -80 ° C freezer immediatamente. MNC PB possono essere conservati in -80 ° C freezer per diverse settimane o trasferiti ad un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. NOTA: Per scongelare le cellule congelate, anche se il nostro mezzo di crioconservazione può sostenere la vitalità delle cellule, il numero di cellulare può diminuire a causa di morte delle cellule durante il processo di scongelamento. Si raccomanda di 1 - 10 x 10 7 cellule saranno congelati in ogni fiala. </li></ol> 4. L&#39;espansione delle multinazionali PB in eritroide Media <ol><li> Preparare 5 ml IMDM media in un tubo da 15 ml. scongelare rapidamente le multinazionali PB congelati in un bagno d&#39;acqua C 37 ° e poi trasferirli al tubo con il mezzo IMDM. NOTA: La lunghezza del tempo in bagno d&#39;acqua dipende dal volume delle cellule crioconservati e l&#39;u esageratamentesed. Di solito, la cella congelati si scongelano in 1 min. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 - 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in media eritroide. Aggiungere 10 ml soluzione Trypan Blue di sospensione cellulare 10 ml e mescolare bene. Trypan blu colora le cellule morte entro 1 - 3 min. Contare le cellule sotto il microscopio con un emocitometro. </li><li> PTM Culture PB in una coltura non-tessuto (non-TC) trattati 6 pozzetti con 2 ml di mezzo per pozzetto, ad una densità cellulare di ~ 5 x 10 6 cellule / ml, a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore umidificato. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzo fresco eritroide direttamente a ciascun pozzetto senza cambiare il mezzo a D 3 e 5. </li><li> A D 6, raccogliere le multinazionali PB per nucleofection. </li></ol> 5. PB MNC Nucleofection e riprogrammazione <ol><li> Un giorno prima nucleofection, pre-coat TC-trattata 6 pozzetti con 0,1% di gelatina a 37 ° C per 20 min. Scongelare inattivato murino embrionale Fibroesplosione (MEF), le cellule di alimentazione in un bagno d&#39;acqua C 37 ° e subito trasferirli in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di terreno MEF. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Rimuovere la gelatina dal 6 pozzetti, risospendere il pellet di cellule in medium MEF, e trasferirli gelatina pretrattata 6 pozzetti. In ogni pozzetto, semi di 2 - 4 x 10 5 inattivati cellule MEF sospese in 2 ml di mezzo MEF. </li><li> Coltivare le cellule di alimentazione MEF a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. </li><li> Il giorno della nucleofection, aspirare il terreno MEF e sostituirlo con 1 medium eritroide mL. Pre-equilibrare la piastra di coltura per 10 - 30 min a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. </li><li> Aggiungere 2 mg PEV-OCT4-2A-SOX2, 1 mg PEV-MYC, 1 mg PEV-Klf4, e 0,5 mg PEV-BCL-XL in una provetta da 1,5 ml Eppendorf sterili. Riscaldare il tubo a 50 ° C per 5 min a prevenire la contaminazione, e si raffreddano a RT. Aggiungere57 microlitri nucleofection buffer e 13 microlitri supplemento. </li><li> Harvest 2 x 10 6 coltivate multinazionali PB in una provetta da 5 ml per centrifugazione a 200 xg per 7 minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungere il plasmide e nucleofection mix buffer per il pellet. Mescolare bene muovendo il tubo con il dito. NOTA: A partire da 2 x 10 5 cellule può essere utilizzato per nucleofection, ma un rendimento riprogrammazione inferiore dovrebbe essere previsto pure. </li><li> Trasferire il DNA e sospensione cellulare alla cuvetta fornito nel kit e tappare la cuvetta. Selezionare il programma U-008 sul dispositivo nucleofection. Inserire la cuvetta nel supporto e premere OK per applicare il programma U-008. </li><li> Prendere la cuvetta dal supporto, aggiungere 0,5 - media eritroide 1 ml di pre-riscaldato in ogni provetta, e le cellule di trasferimento alla piastra MEF pre-equilibrata immediatamente. Grazie all&#39;elevata efficienza riprogrammazione e variazione donatore, semina diverso numero di cellule che vanno da 1-10 x 10 5 cellule per bene è fortemente incoraggiata. </li><li> Trasferire la lastra ad una camera di ipossia, e lavare la camera con un gas misto costituito da 92% N 2, 5% CO 2 e 3% O 2 per 1 - 2 min ad una velocità di 20 L / min. Dopo la sigillatura della camera, coltura le cellule a 37 ° C. </li><li> A D 2 post-nucleofection, aggiungere 2 ml di mezzo iPSC direttamente a ciascun bene. </li><li> A D 4 post-nucleofection, rimuovere 3 ml di terreno e aggiungere 2 ml di media iPSC fresco. A D 4 post-nucleofection, la maggior parte delle cellule vive avranno attaccato allo strato alimentatore. </li><li> Dopo 6 D post-nucleofection, cambiare il medium ogni 2 d lasciando 500 microlitri speso medio e l&#39;aggiunta di 2 ml di media E8 fresco integrato con 0,25 mm di sodio butirrato fino a D 14 - 18. NOTA: Altre cellule di alimentazione possono essere aggiunti nei pozzetti di coltura ogni volta osservando che le cellule di alimentazione sono stati staccati. Dopo lo scongelamento MEF (vedi 5.1 e 5.2), risospendere il pellet cellulare in un piccolo volume di terreno E8 (cioè ~ 0.2 ml per un pozzetto di un 6-pozzetti) e quindi aggiungere MEF nei pozzetti di coltura. Circa 2% FBS può essere aggiunto per aumentare l&#39;adesione cellulare. In alternativa, medio MEF condizionata può essere usata, ma è più laboriosa. </li></ol> 6. Ampliamento della iPSCs NOTA: Nella maggior parte dei casi, un gran numero di colonie IPSC appaiono in D 8 - 10 dopo nucleofection. Dopo 14 D, grandi colonie IPSC sono di solito pronti per la raccolta. <ol><li> Prima di scegliere le colonie, aggiungere 500 microlitri di media E8 integrato con inibitore ROCK, Y27632 (10 micron), in un pozzetto di un alimentatore o di Matrigel rivestito 24-pozzetti. Utilizzare un 10 o 20 microlitri pipetta di graffiare e scegliere colonie sotto il microscopio. Trasferire i pezzi di ogni colonia ai pozzetti contenenti il ​​terreno di coltura. NOTA: La concentrazione di Matrigel differisce da un lotto all&#39;altro. Di solito, usiamo diluizione 1: 100 di Matrigel. <ol><li> Al fine di evitare la contaminazione incrociata, sceglierecolonie che sono grandi e ben separati dagli altri. IPSCs Culture a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. NOTA: Dovrebbe essere notare che la popolazione iPSC può essere policlonale a causa della migrazione cellulare quando ci sono decine o centinaia di colonie in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. </li></ol></li><li> Non cambiare mezzo per la prima 2 d. Inibitore ROCK può promuovere la sopravvivenza delle piccole colonie 25. </li><li> Da D 2 in poi, cambiare media ogni giorno, eliminando medio speso e l&#39;aggiunta di medie E8 500 microlitri fresca in ogni pozzetto. </li><li> Circa 1 settimana più tardi, quando le colonie sono abbastanza grandi, rimuovere il terreno e trattare le cellule con 300 soluzione distacco cellulare microlitri (0,5 mM EDTA in PBS) a 37 ° C per 1 - 3 min. Rimuovere la soluzione di distacco delle cellule e aggiungere medie E8 contenente inibitore ROCK (10 micron) di sospendere iPSCs. Non abbattere le colonie in cellule singole, che possono portare alla morte delle cellule eccessivo. I grumi di cellule con 5-50 cellules sono adatti per iPSC passaggio. </li><li> Trasferimento 50 - 100% della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una 12 o 6 pozzetti che è stato prerivestito con alimentatori o Matrigel. </li><li> Per la cultura a lungo termine in piastre Matrigel rivestite (vedi nota in 6.1), cambiare il mezzo di ogni giorno. Quando la confluenza cella raggiunge 40 - 60%, trattare le cellule con 1 soluzione distacco cellulare mL (0,5 mM EDTA in PBS) a 37 ° C per ~ 3 min. Quando le colonie cominciano a rannicchiarsi, rimuovere la soluzione di distacco delle cellule e aggiungere E8 mezzo contenente inibitore ROCK (10 micron) di sospendere i iPSCs. cellule Passaggio con un fattore di divisione di 4 - 8. l&#39;inibitore ROCK deve essere aggiunto quando passaging cellule per aumentare la sopravvivenza, e rimossi 1 d tardi per evitare la differenziazione. </li><li> Per congelare-down iPSCs, il trattamento di cellule con una soluzione di distacco delle cellule a 37 ° C per 3-5 minuti secondo il protocollo del produttore. Quando le colonie IPSC iniziano a rannicchiarsi, aspirare il tampone e aggiungere 0,5-1 ml E8 media. </li> &lt;li&gt; Aggiungere un volume equivalente di mezzo crioconservazione alla sospensione cellulare e mescolare bene. Congelato iPSCs può essere conservato in un congelatore C -80 ° per diverse settimane o in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 7. La selezione di iPSCs senza residuo episomiale Plasmidi <ol><li> Dopo il passaggio 5, iPSCs raccolto ed estrarre DNA genomico. NOTA: Di solito dopo 5 passaggi della cultura, plasmidi episomiale residui sono rilevabili. Così, quasi tutte le colonie IPSC a passaggi sopra 5 (cioè di passaggio 10) mancano plasmidi episomiale residue. </li><li> Utilizzare DNA genomico da untransfected multinazionali PB come controllo negativo. Aggiungere 1,6 pg PEV-OCT4-2A-SOX2 plasmide in 1 mg DNA controllo negativo per imitare le cellule con una sola copia del PEV plasmide per cellula. </li><li> Aggiungere 9 ml di acqua PCR-grade di cui 100 ng di DNA genomico e 1 ml primer specifici (10 micron ciascuno di avanti e primer reverse) in 10 microlitri ad alta fedeltà PCR Master Mix. Normalizzare l&#39;amount del DNA da parte GAPDH. Utilizzare i seguenti primer per PCR: EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT, EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG, WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT, WPRE-R GTTGCGTCAGCAAACACAGT, GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC, GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC. </li><li> Incubare la miscela di reazione a 98 ° C per 60 s; seguita da 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s, e 72 ° C per 30 s. Dopo 30 cicli; estendere la reazione a 72 ° C per 5 min. </li><li> Carico 5 microlitri prodotti di PCR in ciascun pozzetto di un gel di agarosio all&#39;1%. Eseguire il gel per 20 - 30 min a 100 V. Scegliere i cloni IPSC con fasce non rilevabili per EBNA1 e WPRE per ulteriori cultura e l&#39;analisi a valle. </li></ol> 8. Citometria a Flusso <ol><li> Harvest iPSCs di trattarli con Accutase a 37 ° C per 3-5 minuti per ottenere una sospensione singola cella. Aggiungere 1 ml PE-coniugato anti-TRA-1-60 o eFluor 570-coniugato anti-SSEA4 o anticorpo isotipico 100 l di sospensione cellulare (1 - 5 x 10 5 cellule) In 5 mL. Incubare le provette in un luogo buio a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Dopo la colorazione per 20 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 2 ml di PBS e centrifugare a 400 xg per 5 min. Risospendere le cellule in 300 microlitri di PBS per Cell Fluorescence-attivato ordinamento (FACS) analisi utilizzando un analizzatore di citometria a flusso delle cellule. 23,26 </li></ol> 9. confocale Imaging <ol><li> iPSCs seme nella camera di diapositive Matrigel rivestite. </li><li> Dopo 3 - 4 d della cultura, rimuovere il mezzo di crescita e fissare con 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente per 30 min. Lavare le cellule due volte con PBS. Nota: PFA è tossico e nocivo. </li><li> Trattare le cellule con 0,1% Triton X-100 in PBS (PBS-T) a temperatura ambiente per 30 min. Lavare le cellule due volte con PBS. </li><li> Bloccare le cellule con un tampone di bloccaggio (siero di capra 5% in PBS, V: V) a temperatura ambiente per 1 h. </li><li> Durante la fase di blocco, diluire l&#39;anticorpo primario (100x) in tampone di bloccaggio. NOTA: Le informazioni anticorpi è elencato nella tabella dei materiali / attrezzature. </li><li> Incubare le cellule con l&#39;anticorpo diluito a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare due volte con PBS-T per 15 minuti, seguito da due volte con PBS per 15 min. </li><li> Incubare le cellule con un anticorpo secondario fluoroforo coniugato diluito a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS-T per 15 minuti, seguito da due volte con PBS per 15 min. </li><li> Macchia il nucleo con DAPI (1 mg / ml) in PBS a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS per 15 min. </li><li> Catturare immagini con un microscopio confocale. 23,27 </li></ol> 10. Teratoma Assay Harvest 1 x 10 6 iPSCs con la soluzione di distacco delle cellule (0,5 mm EDTA in PBS) e risospendere le cellule in 200 microlitri DMEM / F12 diluito (1: 1) Matrigel. <ol><li> Per via sottocutanea iniettare le cellule nella coscia posteriore di topi immunodeficienti NOD / SCID. </li><li> Alle 8 - 12 settimana dopo l&#39;iniezione IPSC, sezionare e correggere teratomi in formalina al 10%. 28 </li><li> Dopo microsectioning ecolorazione con ematossilina e eosina (H &amp; E), analizzare i campioni. 29 </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi concorrenti o conflittuali da rivelare.

L&#39;acquisizione di campioni di sangue da donatori sani o pazienti è conveniente e non invasivo, che lo rende una fonte di cellule interessante per la ricerca di base e clinica di terapia cellulare. Qui abbiamo descritto un protocollo per altamente efficiente generazione di iPSCs privo di integrazione da campioni di sangue periferico. Questo approccio riproducibile e accessibile dovrebbe beneficiare il campo IPSC. Abbiamo riportato che ci sono due fattori critici responsabili altamente eff...

Dopo forzata espressione di diversi fattori di trascrizione (Cioè OCT4, SOX2, MYC e Klf4), cellule somatiche possono essere riprogrammate a cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che detengono una grande promessa per applicazioni in medicina rigenerativa e terapia di sostituzione cellulare 1-3. Fino ad oggi, diversi metodi sono stati sviluppati per aumentare il tasso di successo della riprogrammazione 4-7. Vettori virali indotta riprogrammazione è ampiamente utilizzato per la generazione efficiente di iPSCs, perché l&#39;integrazione virale porta ad un alto livello, espressione stabile dei fattori di riprogrammazione. Tuttavia, l&#39;integrazione permanente del DNA del vettore nel genoma della cellula può indurre mutagenesi inserzionale 5. Inoltre, insufficiente inattivazione dei fattori di riprogrammazione può disturbare iPSCs differenziazione 8. Come tale, l&#39;uso di iPSCs senza integrazione dei fattori di riprogrammazione è indispensabile, in particolare per l&#39;uso in applicazioni di terapia cellulare. <p class="jove_content"&gt; Episomiale Vettori (EV) sono ampiamente utilizzati nella generazione di iPSCs senza integrazione. L&#39;EV più comunemente usato è un plasmide contenente due elementi, origine di replicazione virale (oriP) e EB antigene nucleare 1 (EBNA1), del virus di Epstein-Barr 9 (EB). L&#39;elemento oriP promuove la replicazione del plasmide in cellule di mammifero, mentre l&#39;elemento EBNA1 Tethers plasmide DNA oriP contenente il DNA cromosomico che consente la compartimentazione del episoma durante la divisione della cellula ospite. In confronto ad altri approcci privi di integrazione, tra cui Sendai Virus (SV) e RNA trasfezione, i veicoli elettrici in possesso di molteplici vantaggi 5,6,10. Come il DNA plasmide, i veicoli elettrici possono essere facilmente realizzati e modificati in casa, che li rende estremamente conveniente. Inoltre, riprogrammando con EV è un processo meno alta intensità di lavoro da un unico trasfezione con veicoli elettrici è sufficiente per la generazione di IPSC, che sono necessarie per la riprogrammazione di successo diversi trasfezioni RNA. Dfibroblasti ermal sono stati utilizzati in molti studi di riprogrammazione. Tuttavia, la biopsia della pelle non è solo un processo invasivo e doloroso, ma anche in termini di tempo per l&#39;espansione delle cellule a quantità sufficienti per la riprogrammazione. Di maggiore preoccupazione, le cellule della pelle di donatori adulti sono stati spesso esposti a radiazioni UV-lungo termine, che può portare a mutazioni associate a tumori, limitando così le domande di iPSCs derivate da fibroblasti cutanei 11,12. Recentemente, è stato riportato che le normali cellule della pelle umana si accumulano mutazioni somatiche e molteplici geni del cancro, tra cui la maggior parte dei fattori chiave della cutanee carcinomi a cellule squamose, sono sotto forte selezione positiva 13. In contrasto con i fibroblasti della pelle, sangue periferico (PB), le cellule sono una fonte di cellule preferibili per la riprogrammazione perché 1) le cellule del sangue possono essere facilmente ottenute attraverso un processo minimamente invasiva, 2), le cellule del sangue periferico sono la progenie di cellule staminali ematopoieticheresidente nel midollo osseo, quindi protetto dalle radiazioni nocive. cellule mononucleate del sangue periferico (PB MNC) possono essere raccolti in un&#39;ora dallo strato buffy coat a seguito di una semplice centrifugazione in gradiente utilizzando Ficoll-Hypaque (1.077 g / mL). Le multinazionali PB ottenuti sono composti da linfociti, monociti e un paio di cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) 14. Sebbene linfociti T umani sono uno dei principali tipi di cellule in PB, maturo cellule T contengono riarrangiamenti del recettore delle cellule T (TCR) geni e mancano di un genoma intatto limitando così il loro potenziale per applicazioni 15,16. Tuttavia, il ringiovanimento delle cellule T attraverso generazione iPSC può avere potenziali applicazioni in chimerico Antigen Receptor (CAR) Terapia cellule T 17-19. In confronto, HPC hanno un genoma intatto e sono facilmente riprogrammabile. Anche se solo 0,01-0,1% in cellule circolazione periferica sono HPC, queste cellule possono essere espanse ex vivo in media eritroide che favorisce la proliferazione di erythrcellule progenitrici OID 14. Nel nostro studio precedente, abbiamo usato il fattore BCL-XL in aggiunta ai fattori di Yamanaka (OCT4, SOX2, MYC e Klf4), che ha provocato un aumento di 10 volte in PB riprogrammazione efficienza 20. BCL-XL, noto anche come BCL2L1, è un potente inibitore di morte cellulare, inibendo l&#39;attivazione delle caspasi 21,22. Ma, BCL-XL può anche svolgere un ruolo importante nel mantenimento della pluripotenza 21,22. Recentemente, abbiamo ulteriormente ottimizzato il nostro sistema EV riprogrammazione esprimendo separatamente MYC e Klf4 con due vettori, che porta a un aumento di circa 100x in efficienza riprogrammazione 23. Utilizzando questo metodo, l&#39;efficienza riprogrammazione, definito dal numero di colonie diviso per numero iniziale di cellule a transfezione, è di 0,2 - 0,5% da donatori sani. Come segue, si descrive la procedura sperimentale dettagliato per la generazione di iPSCs senza integrazione da PB.

<table><tbody><tr><td>Terreno di espansione delle cellule staminali ematopoietiche</td><td>Sigma</td><td>S0192</td><td>Negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fattore di cellule staminali umane (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Conservare a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Interleuchina-3 (IL-3)</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-03</td><td>Conservare a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Eritropoietina (EPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>Conservare a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dell'insulina-1 (IGF-1)</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td>Conservare a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Conservare a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>1-tioglicerolo (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>Conservare a -20 o -80 C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>Gibco</td><td>112660-012</td><td>Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>L-glutammina (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Conservare a -20 C</td></tr><tr><td>Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Conservare a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio (ITS, 100x)</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td>Conservare a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td>Conservare a -20 C</td></tr><tr><td>DMEM (glucosio alto) medio</td><td>Thermo</td><td>SH30243.01B</td><td>Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SV30087.01</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare, SIGMA</td><td>17-5442-02</td><td>Negozio presso RT</td></tr><tr><td>Trealosio</td><td>Sigma</td><td>T9531</td><td>Negozio presso 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Negozio presso RT, proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Endofree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Negozio presso RT</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>Negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Kit di nucleofecazione cellulare CD34+ umano</td><td>Lonza</td><td>VPA-1003</td><td>Conservare a RT, il tampone di nucleofecazione e l'integratore devono essere conservati a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>B5887</td><td>Conservare a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>ROCK inibitore - Y27632</td><td>STEMGENT</td><td>04-0012-10</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Essential 8 medio basale (E8)</td><td>Gibco</td><td>A15169-01</td><td>Negozio a 4 &deg; C, l'integratore deve essere conservato a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354277</td><td>Negozio a -20 o -80 &deg; C</td></tr><tr><td>2x EasyTaq PCR SuperMix (+colorante)</td><td>TransGen Biotech</td><td>AS111</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Soluzione per il distacco delle cellule</td><td>STEMGENT</td><td>01-0006</td><td>Conservare a -20 &deg; C, Accutase come soluzione di distacco cellulare per ottenere una sospensione a cellula singola</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>Conservare a 4 o -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Nanog AF488</td><td>BD</td><td>560791</td><td>Negozio a 4 gradi C, anticorpo primario utilizzato per l'immunofluorescenza, diluire 1/100 quando utilizzato</td></tr><tr><td>Anti-OCT4</td><td>abcam</td><td>ab19857</td><td>Conservare a 4 gradi C, anticorpo primario utilizzato per l'immunofluorescenza, diluire 1/100 quando utilizzato</td></tr><tr><td>AF488 asino anti-topo</td><td>IgG Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Conservare a 4 gradi; C, anticorpo secondario utilizzato per l'immunofluorescenza,&nbsp; diluire 1/500 quando usato</td></tr><tr><td>PE anticorpo umano TRA-1-60-R</td><td>Biolegend</td><td>330610</td><td>Conservare a 4 gradi C, anticorpo utilizzato per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>eFluor 570-coniugato anti-SSEA4</td><td>eBioscience</td><td>41-8843</td><td>Conservare a 4 gradi; C, anticorpo utilizzato per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anticorpo isotipo</td><td>eBioscience</td><td>11-4011</td><td>Conservare a 4 &deg; C, anticorpo utilizzato per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>Kit di rilevamento della fosfatasi alcalina</td><td>SiDanSai</td><td>1102-100</td><td>Conservare a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA genomico</td><td>TIANGEN</td><td>DP304-02</td><td>Conservare presso RT</td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Conservare presso RT</td></tr><tr><td>Citometria a flusso Analizzatore cellulare</td><td>BD</td><td>LSRII</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante (SDC)</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>per imaging confocale</td></tr><tr><td>Dispositivo di nucleofeczione</td><td>Lonza</td><td>Nucleofector 2b</td><td>per la nucleofeczione di PB MNC</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4010</td><td>GE</td><td></td><td>per scattare foto della colorazione AP in blocco</td></tr></tbody></table>

generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano utilizzando episomiale vettori

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) molto promettenti per la modellazione della malattia e terapie rigenerative. Abbiamo precedentemente riportato l&#39;uso di episomiale Vettori (EV) per generare iPSCs senza integrazione da cellule mononucleate del sangue periferico (PB MNC). I vettori episomiale utilizzati sono plasmidi di DNA incorporati con oriP e EBNA1 elementi dal virus di Epstein-Barr (EB), che permettono per la replica e lungo termine retainment di plasmidi in cellule di mammifero, rispettivamente. Con ulteriore ottimizzazione, migliaia di colonie IPSC possono essere ottenuti da 1 mL di sangue periferico. Due fattori critici per ottenere l&#39;efficienza alta riprogrammazione sono: 1) l&#39;uso di una 2A &quot;auto-scissione&quot; peptide per collegare OCT4 e SOX2, ottenendo così espressione equimolare dei due fattori; 2) l&#39;uso di due vettori per esprimere MYC e Klf4 singolarmente. Qui si descrive un protocollo step-by-step per la generazione di IP libero-integrazioneSC da adulti campioni di sangue periferico. I iPSCs generati sono privi di integrazione come plasmidi episomiale residui sono rilevabili dopo cinque passaggi. Sebbene l&#39;efficienza riprogrammazione è paragonabile a quella di Sendai Virus (SV) vettori, plasmidi EV sono notevolmente più economico rispetto ai vettori disponibili in commercio SV. Questo sistema EV riprogrammazione accessibile rappresenta un potenziale per le applicazioni cliniche in medicina rigenerativa e fornisce un approccio per la riprogrammazione diretta delle multinazionali PB alle cellule senza integrazione mesenchimali staminali, cellule staminali neurali, ecc.

Usando questo protocollo, si possono ottenere centinaia di colonie da 1 x 10 5 nucleofected PB multinazionali (Figure 1A e 1B). L&#39;efficienza riprogrammazione è circa 0,2 - 0,5% e le colonie esprimono marcatori pluripotenza (Figure 1C e 1D). iPSCs generati utilizzando il protocollo descritto sono privi di integrazione e hanno la capacità di formare teratoma comporre i 3 strati germinali (figure 1E</...

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule iPS da cellule mononucleate del sangue periferico umano adulto utilizzando vettori episomiali non integranti. Questo protocollo può aiutare i ricercatori nel campo delle cellule staminali che desiderano produrre cellule iPS per il monitoraggio delle malattie, lo screening di farmaci e la medicina rigenerativa. Il nostro protocollo di riprogrammazione è molto semplice, ma altamente efficiente.Seguendo questa procedura, è possibile padroneggiare facilmente la tecnica del riprogrammamento delle cellule ematiche. La qualità del plasma è fondamentale per un riprogrammamento efficace. La presenza di contaminanti può ridurre l'efficienza del riprogrammamento; pertanto, si consiglia di utilizzare kit Endofree per la purificazione di plasmidi episomiali.Le cellule iPS sono più fragili rispetto ad altre cellule. Preparare le cellule per più di un intervento durante il passaggio genico può indurre una massiccia morte cellulare, in particolare nei primi passaggi. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i mezzi di coltura necessari secondo il manoscritto allegato.Quindi combinare 10 mL di campione di PB fresco e dieci mL di tampone PBS in un tubo da 50 mL e mescolare accuratamente. Portare il PBS a temperatura ambiente o a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Successivamente, aggiungere 10 mL di ficoll sul fondo del tubo.Questo processo deve essere eseguito lentamente per assicurare che lo strato di ficoll non si mescoli con il PB. Centrifugare la miscela a 400 x g per 30 minuti con accelerazione e decelerazione ridotte. Dopo la centrifugazione, le MNC del PB si trovano nello strato bianco posizionato tra il plasma del PB e il ficoll. Aspirare lentamente 10 mL di plasma del PB senza disturbare lo strato bianco di ficoll.Quindi raccogliere con attenzione lo strato bianco in un nuovo tubo da 50 mL. Il volume totale delle cellule raccolte dallo strato bianco dovrebbe essere di circa tre-sei mL. Successivamente, aggiungere PBS per portare il volume totale a 30 mL e mescolare accuratamente.Quindi centrifugare il campione a 400 x g per dieci minuti. Trascorsi dieci minuti, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di mezzo di coltura. Mescolare accuratamente e centrifugare il campione a 400 x g per cinque minuti per rimuovere la maggior parte delle piastrine.Successivamente, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in uno-due mL di IMDM. Le cellule possono essere utilizzate per la coltura immediata o congelate per un uso successivo. Per la criopreservazione, aggiungere una quantità uguale di mezzo criopreservante.Aliquotare le cellule in provette criogeniche e trasferirle immediatamente in un congelatore a -80 gradi Celsius. In questo procedimento, preparare 5 mL di mezzo IMDM in una provetta da 15 mL. Scongelare rapidamente i PB MNC congelati in un bagno termico a 37 gradi Celsius prima di trasferirli nella provetta contenente il mezzo IMDM.Centrifugare il campione a 400 x g per cinque-dieci minuti. Successivamente, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo eritroide. Quindi, contare le cellule al microscopio utilizzando un emocitometro.Successivamente, coltivare le PB MNC in una piastra a sei pozzetti non trattata per colture cellulari, aggiungendo due mL di mezzo per pozzetto, a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata con 5% di anidride carbonica. Al giorno tre e al giorno cinque, aggiungere un mL di mezzo eritroide fresco direttamente in ciascun pozzetto senza sostituire il mezzo. Al giorno sei, raccogliere le PB MNC per la nucleofezione.Un giorno prima della nucleofezione, rivestire in anticipo la piastra da coltura cellulare a sei pozzetti con gelatina allo 0,1% a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Scongelare le cellule feeder MEF inattivate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e trasferirle immediatamente in un tubo da 15 mL contenente cinque mL di mezzo MEF. Successivamente, centrifugare a 400 x g per cinque minuti ed eliminare il soprannatante.Quindi rimuovere la gelatina dalla piastra a sei pozzetti e risospendere il pellet cellulare nel mezzo MEF. Successivamente, seminare le cellule MEF inattivate in due mL di mezzo MEF in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti pretrattata con gelatina e coltivarle a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5%. Nel giorno della nucleofezione, aspirare il mezzo MEF e sostituirlo con un mL di mezzo eritroide.Quindi pre-equilibrare la piastra di coltura per 10-30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5%. Aggiungere due microgrammi di PEV OCT4 a Sox2, un microgrammo di PEV MYC, un microgrammo di PEV KLF4 e 0,5 microgrammi di PEV Bcl-XL in un tubo sterile da 1,5 mL. Riscaldare il tubo a 50 gradi Celsius per cinque minuti per prevenire contaminazioni e quindi raffreddarlo fino alla temperatura ambiente.Successivamente, aggiungere 57 microlitri di tampone per nucleofezione e 13 microlitri di tampone supplementare al campione. Raccogliere due volte dieci alla sesta PBMNC coltivate in un tubo da 5 mL mediante centrifugazione a 200 x g per sette minuti. Successivamente, rimuovere il soprannatante e aggiungere al pellet cellulare la miscela di plasmide e tampone per nucleofezione.Quindi, mescolare accuratamente agitando leggermente il tubo con un dito. Successivamente, trasferire il DNA in sospensione cellulare nella cuvetta fornita con il kit e chiudere la cuvetta con il coperchio. Selezionare il programma U-008 sul dispositivo di nucleofezione.Successivamente, inserire la cuvetta nel supporto e premere OK. Dopodiché, rimuovere la cuvetta dal supporto. Aggiungere 0,5-1 mL di mezzo eritroide preriscaldato a ogni cuvetta e trasferire immediatamente le cellule nella piastra MEF pre-equilibrata. Per alcuni campioni, è possibile ottenere migliaia di colonie da un mililitro di sangue.Se si desidera isolare una singola colonia per ulteriori colture, potrebbe essere necessario seminare un pozzetto aggiuntivo con soltanto 1 milione di cellule. Poco prima di posizionare la camera da ipossia nell'incubatrice, agitare delicatamente la camera diverse volte per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule nei pozzetti di coltura. Successivamente, trasferire la piastra in una camera da ipossia.Sciacquare la camera con un gas misto per uno o due minuti a una velocità di 20 litri al minuto. Successivamente, sigillare la camera e coltivare il campione a 37 gradi Celsius. Al secondo giorno dopo la nucleofezione, aggiungere due mL di mezzo per iPSC direttamente in ogni pozzetto.Al quarto giorno dopo la nucleofezione, rimuovere tre mL di mezzo e aggiungere due mL di mezzo fresco per iPSC. A questo stadio, la maggior parte delle cellule vive si è già attaccata allo strato di cellule di supporto. Dopo il sesto giorno dalla nucleofezione, cambiare il mezzo ogni due giorni lasciando 500 microlitri di mezzo usato e aggiungendo due mL di mezzo E8 fresco integrato con 0,25 millimoli di butirrato di sodio fino ai giorni 14-18.Qui è mostrato uno schema del protocollo per la riprogrammazione delle cellule del sangue periferico. Questa immagine mostra l'AP in una boccia, e questa mostra una tipica colonia di iPSC simile a ESC al giorno 14 dopo la nucleofezione dei MNC del sangue periferico. Di seguito sono riportati diagrammi rappresentativi di FACS di iPSC al quinto passaggio che esprimono TRA-1-60 o SSEA4.Di seguito sono riportate le immagini rappresentative ottenute mediante microscopia confocale di colonie di iPSC che esprimono NANOG e OCT4. Le immagini mostrano la colorazione H&E di un teratoma, composto da tutti e tre i foglietti germinativi. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del metodo per generare cellule iPS prive di integrazioni a partire da cellule mononucleate del sangue periferico umano.Una volta acquisita la padronanza, è possibile generare grandi quantità di cellule iPS in tre settimane, con un impegno pratico inferiore a tre ore. Abbiamo sviluppato un semplice sistema basato su vettori episomiali per la riprogrammazione efficiente delle cellule del sangue. Riteniamo che questo sistema economico possa essere facilmente adottato, in particolare nei laboratori di piccole dimensioni con risorse limitate.Non dimenticare che lavorare con sangue umano e plasmi può essere pericoloso, e devono essere adottate precauzioni come indossare guanti e camici da laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.

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