Visualizzazione e mappatura dei percorsi neuronali in una fetta di cervello dell'amigdala

Nel cervello del topo, l'amigdala contiene neuroni che formano connessioni sinaptiche con la corteccia prefrontale mediale, o neuroni mPFC.

Prendiamo una fetta di cervello dell'amigdala in cui i neuroni mPFC esprimono un canale sensibile alla luce, la rodopsina, fusa con una proteina fluorescente.

Posiziona la fetta in una camera di registrazione e visualizzala al microscopio a fluorescenza per localizzare i neuroni mPFC.

Passa a una vista in campo chiaro e introduci una pipetta per cerotti contenente una soluzione interna.

Applicare una pressione positiva per far avanzare la pipetta verso un neurone dell'amigdala.

Al contatto neuronale, si forma una fossetta.

Applicare l'aspirazione per formare una tenuta ermetica.

Continuare l'aspirazione per rompere la membrana, stabilendo il contatto con l'interno della cellula.

Illuminare la fetta per attivare il canale neuronale mPFC, la rodopsina, innescando l'afflusso di ioni positivi, la generazione di potenziale d'azione e il rilascio di neurotrasmettitori.

I neurotrasmettitori si legano ai recettori dei neuroni dell'amigdala postsinaptica, causando l'afflusso di ioni e la generazione di corrente.

Registra la corrente neuronale postsinaptica per analizzare la connettività mPFC-amigdala.

Per preparare il microscopio a patch per l'attivazione optogenetica di fibre e cellule, centrare il diodo a emissione di luce montato, o LED, sul percorso di erogazione della luce. Utilizzare un misuratore di potenza per misurare l'intensità della luce LED sul piano focale posteriore e all'uscita di ciascun obiettivo a una lunghezza d'onda di 470 nanometri. Utilizza un foglio di calcolo per calcolare l'intensità della luce in milliwatt per millimetro quadrato e crea una curva di calibrazione per ciascun obiettivo.

Quindi, recuperare una fetta acuta di amigdala dalla camera di interfaccia e posizionarla nella camera di fetta montata sul microscopio. Posizionare la fetta in modo che la superficie della fetta rivolta verso l'alto nella camera di interfaccia sia rivolta verso l'alto anche nella camera di registrazione. Perfondere la fetta con ACSF fresco e ossigenato a una velocità di 1-2 millilitri al minuto. La temperatura dovrebbe essere di circa 31 gradi Celsius. Accendere la lampada fluorescente e selezionare i set di filtri appropriati per la specifica proteina fluorescente espressa. Usa l'obiettivo 5x per ottenere una panoramica.

Quindi, aprire o limitare l'apertura nel percorso luminoso del microscopio, se necessario per l'esperimento. Per ottenere una registrazione patch, riempire una pipetta patch con la soluzione interna e montarla nel portaelettrodo. Applicare una pressione positiva sulla pipetta per cerotti e abbassarla lentamente nella soluzione del bagno. Quindi, sotto controllo visivo, utilizzare il micromanipolatore per abbassare la pipetta del cerotto nella fetta. Avvicinarsi al neurone di interesse con la pipetta per cerotti dal lato e dall'alto.

Rilasciare la pressione positiva quando la pipetta raggiunge la superficie della cella, come indicato da una fossetta visibile sulla superficie della cellula. Applicare una pressione negativa per ottenere un gigaseal. Applicare un'ulteriore aspirazione per rompere il cerotto di membrana e ottenere la registrazione dell'intera cellula. Successivamente, stimolare le fibre marcate con il LED collegato attivando la canalrodopsina con luce a lunghezza d'onda di 470 nanometri mentre si registrano le risposte elettriche dalla cellula.

Per la stimolazione sinaptica, utilizzare le uscite digitali del software di acquisizione dati per attivare il LED. Regolare manualmente l'intensità della stimolazione LED. Ripetere la stimolazione con un'apertura aperta o ristretta, se necessario per la successiva cellula registrata o in presenza di sostanze in esame specifiche.