Caratterizzazione degli sferoidi del tumore neuroendocrino dell'intestino tenue mediante immunofluorescenza

Prendi gli sferoidi del tumore neuroendocrino dell'intestino tenue in una provetta.

Aggiungi una soluzione fissativa per preservare le cellule.

Per lavare, centrifugare e sostituire il fissativo con il tampone.

Centrifuga e scarta il surnatante per rimuovere qualsiasi fissativo rimasto.

Aggiungi un tampone contenente un detergente e un agente bloccante per permeabilizzare le membrane cellulari e prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Lavare con tampone per rimuovere il detersivo in eccesso e l'agente bloccante.

Incubare con anticorpi primari, che si legano alla proteina bersaglio specifica per la cellula neuroendocrina.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungi anticorpi secondari marcati con fluoroforo che si legano agli anticorpi primari.

Risciacqua con un tampone per rimuovere gli anticorpi in eccesso.

Aggiungi un mezzo di montaggio contenente un colorante per macchiare il nucleo.

Trasferisci gli sferoidi su un vetrino e montali con un vetrino coprioggetti.

Usa un microscopio a fluorescenza per visualizzare le cellule neuroendocrine dello sferoide che esprimono proteine specifiche.

Correggi gli organoidi aggiungendo 500 microlitri di paraformaldeide e incubandoli per 15 minuti. Dopo l'incubazione, lavare la coltura due volte con 1 millilitro di PBS. Aggiungere 500 microlitri di PBS con il 3% di BSA e lo 0,1% di Triton X-100 per permeabilizzare la coltura. Incubare la provetta per cinque minuti, quindi lavare gli organoidi tre volte con 1 millilitro di PBS e il 3% di BSA.

Quindi, incuba la coltura con anticorpi primari per un'ora, quindi ripeti i lavaggi con PBS e BSA. Incubare con gli anticorpi secondari e ripetere i lavaggi, assicurandosi di aspirare e scartare tutto il surnatante.

Per visualizzare gli sferoidi, aggiungi 5 microlitri di terreno di montaggio contenente DAPI, e usa una pipetta P20 per trasferire 5 microlitri di sferoidi su un vetrino. Sigillare il vetrino con un vetrino coprioggetto e creare l'immagine con un microscopio a fluorescenza utilizzando gli obiettivi 10, 20 e 40 volte.