Imaging del calcio delle attività dei neuroni enterici e della glia in un plesso mienterico del colon di topo

Prendiamo una camera di imaging contenente tessuto del plesso mienterico del colon immobilizzato di topo, che ospita plessi gangliari composti da reti di neuroni enterici e cellule gliali.

Queste cellule sono marcate con un indicatore di calcio che emette fluorescenza al legame con il calcio.

Quindi, posizionare la camera su un tavolino per microscopio a fluorescenza. Perfondere la camera con un tampone preriscaldato contenente inibitori per sopprimere le contrazioni muscolari durante l'imaging.

Utilizzando un microscopio, identifica le regioni gangliari sane che mostrano una fluorescenza uniforme.

Acquisisci immagini fluorescenti per misurare l'attività basale, fornendo un riferimento per i livelli intracellulari di calcio.

Perfondere il tessuto con un agonista del recettore per attivare i recettori neuronali, che innesca l'afflusso intracellulare di calcio e un aumento dell'intensità della fluorescenza.

L'attivazione neuronale stimola indirettamente le cellule gliali circostanti, portando all'afflusso di calcio e al conseguente aumento della fluorescenza.

Acquisisci immagini fluorescenti time-lapse per misurare le variazioni dell'intensità della fluorescenza, che indicano la dinamica del calcio e l'attività di segnalazione sia nei neuroni che nelle cellule gliali rispetto ai livelli basali.

Durante l'incubazione, creare un tampone di Kreb modificato secondo le istruzioni nella parte scritta del protocollo e aggiungere 3 micromolari di nicardipina e 1 micromolare di scopolamina per inibire le contrazioni muscolari durante l'imaging di calcio 2 plus alle dissezioni dell'intera montatura. Posizionare la camera di registrazione sotto il microscopio a fluorescenza e, utilizzando un sistema di perfusione a flusso gravitazionale con più serbatoi di siringhe riscaldati, stabilire una velocità di perfusione continua da 2 a 3 millilitri al minuto di 37 gradi Celsius del tampone di Kreb. Assicurarsi di evitare la formazione di bolle d'aria sia nella linea di aspirazione collegata a un sifone. Metti a fuoco il plesso desiderato con l'illuminazione a campo chiaro. Evitare di sovraesporre il tessuto, che potrebbe portare al fotosbiancamento.

Esaminare il carico di fluorofori all'interno dei gangli e selezionare i gangli sani per l'imaging. I gangli danneggiati malsani mostreranno autofluorescenza o morfologia puntata e non dovrebbero essere utilizzati per l'imaging. Una volta selezionato un ganglia, deviare il percorso della luce verso la telecamera e ottenere un'immagine dal vivo con il software di acquisizione delle immagini. Assicurarsi che il ganglio sia a fuoco e impostare la velocità di acquisizione dell'immagine e i tempi di esposizione.

Le velocità e i tempi di acquisizione delle immagini variano a seconda degli eventi che gli investigatori desiderano registrare. Per la maggior parte degli esperimenti, le immagini vengono tradizionalmente acquisite a una velocità compresa tra 0,5 e 1 hertz per le cellule gliali e fino a 2-10 Hertz per i neuroni, perché i transienti gliali del calcio non sono rapidi come i neuroni transitori del calcio.

Avviare la registrazione e stabilire l'attività fisiologica di base del ganglio scelto in assenza di stimoli sperimentali per 30 secondi. Quindi applicare i farmaci preriscaldati di interesse, come gli agonisti e gli antagonisti dei recettori, utilizzando il sistema di perfusione a flusso gravitazionale a una velocità di 2-3 millilitri al minuto secondo un protocollo ottimizzato per il farmaco. Interrompi la registrazione e visualizza il filmato time lapse dell'esperimento.

Seleziona attentamente le regioni di interesse, o ROI, utilizzando l'apposito software di analisi delle immagini.

Infine, utilizzare un software di imaging appropriato per normalizzare e confrontare l'intensità della fluorescenza delle regioni di interesse con il valore di base iniziale. Le variazioni della fluorescenza normalizzata sono direttamente proporzionali alle variazioni del calcio.