Trasformazione e cercarie In vitro La coltivazione di Schistosoma mansoni Schistosomules

L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare il CRC e infettivo in shisom. Ciò si ottiene raccogliendo prima il CRC infettivo dalla lumaca ospite. Il CRC infettivo viene concentrato e poi trasformato in shisom non infettivo utilizzando un ago a doppio taglio.

Infine, gli shisom vengono concentrati e raccolti in una piastra di coltura e incubati in RPMI a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Con questo metodo si può ottenere un olio trasformato con contaminazione della coda FUCIALE o ciale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto una procedura di trasformazione può essere difficile da apprendere e potenzialmente pericolosa.

Le cica sono infettive e ad alta concentrazione e isolamento di richiede una manipolazione delicata e precisa per procedere in modo sicuro ed efficace A dimostrare la loro procedura sarà John, un assistente di ricerca nel mio laboratorio. Riempi a metà un becher pulito da 500 millilitri con acqua distillata a temperatura ambiente utilizzando una normale rete da pesca per acquario e una pinza. Trasferire le lumache infette nel bicchiere.

Posiziona il becher su una vaschetta di emergenza da otto a 12 pollici sotto una fonte di luce a incandescenza e lascialo lì per una o due ore. L'esposizione alla luce intensa provoca l'uscita del CRC dall'ospite lumaca. Per rimuovere le lumache, assicurati di prendere ulteriori precauzioni di sicurezza per evitare qualsiasi contatto con l'acqua infettiva, che contiene CRC che può penetrare direttamente nella pelle umana.

Rimuovere le lumache, quindi rimettere la soluzione sotto una fonte di luce per circa 15 minuti per consentire ai rifiuti di particolato di affondare sul fondo del pallone. Una volta che i rifiuti si sono depositati. Utilizzare una pipetta per trasferire il circ in un pallone di erlenmeyer pulito, evitando i detriti sul fondo del becher.

Posizionare la fiaschetta sul ghiaccio con un angolo di 45 gradi. Incubare la soluzione al buio per 45-60 minuti per consentire al CRC di depositarsi in un angolo. Una volta che i parassiti si sono depositati, utilizzare una pipetta da 50 millilitri per rimuovere la maggior parte del laccio e gettarlo con cura.

In un becher contenente il 10% di candeggina o il 70% di etanolo, agitare delicatamente il pallone di erlenmeyer per risospendere i parassiti. Quindi utilizzare una pipetta per trasferire il campione in provette coniche sterili da 50 millilitri. Metti le provette sul ghiaccio e incubale al buio ancora una volta per 20 minuti per consentire al CRC di depositarsi.

Una volta che i parassiti si sono depositati, utilizzare una pipetta per scartare la maggior parte dei surnatanti, lasciando da cinque a 10 millilitri di liquido in ogni tubo. Quindi, inserire una siringa con un ago emulsionante per blocco esche a doppia estremità calibro 22. Aspirare lentamente la soluzione contenente il parassita da ciascun tubo nella siringa.

Fare attenzione a non gocciolare la miscela infettiva nella cappa. Ruotare con cautela la siringa in modo che l'ago sia rivolto verso l'alto e collegare una seconda siringa all'estremità libera dell'ago. Passare la miscela avanti e indietro tra le due siringhe circa 20 volte per trasformare il crc.

Quindi posizionare le siringhe verticalmente in modo che quella vuota sia sopra. Rimuovere con cura la siringa superiore e disinfettarla con etanolo al 70%. Depositare i parassiti goccia a goccia in una capsula di cristallizzazione in Pyrex pulita e ad alta parete.

Quindi disinfettare l'ago e la siringa in etanolo al 70%. Quindi, posiziona il piatto su uno sfondo bianco per aiutare a visualizzare i parassiti e aggiungi il preriscaldamento a 37 gradi Celsius. Completa l'RPMI in modo che il fondo della capsula in Pyrex sia completamente coperto.

Agitare delicatamente per raccogliere lo shisom al centro utilizzando un contagocce sterile. Raccogli un po' di shisom concentrato e trasferisci i parassiti in una piastra di coltura cellulare fresca a 12 pozzetti. Ripeti l'operazione, risciacqua il passaggio fino a quando non rimangono più parassiti.

Una volta che i parassiti sono stati trasferiti, riempire ogni pozzetto circa a metà con RPMI caldo per verificare la presenza di shisom. Visualizza la lastra utilizzando un microscopio a luce invertita. A questo punto, la maggior parte dei parassiti dovrebbe essersi trasformata in shisom, che può essere distinto dal CRC E perché sono meno modali e mancano della caratteristica coda ciale.

Può essere presente anche un piccolo numero di code di CRC ciali intatte e recise o altri detriti. Lo shta può quindi essere coltivato e mantenuto in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un massimo di sei settimane con cambi di terreno settimanali. Non dimenticare che lavorare con l'aria infettiva può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come il doppio strato di protezioni per le maniche dei guanti e l'uso corretto delle strutture e dei cappucci a rischio biologico.