Name: Trasformazione e cercarie In vitro La coltivazione di Schistosoma mansoni Schistosomules (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Impara a coltivare schistosomula di Schistosoma mansoni trasformando le cercarie infettive raccolte da Biomphalaria glabrata. Questo metodo consente di studiare la biologia del parassita in sicurezza per la ricerca sulla schistosomiasi.

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Questo progetto è stato finanziato dalla Case Western Reserve fondi di avvio Università fornite E. Jolly. Lumache infette sono stati forniti dal Centro Risorse schistosoma, NIAID-NIH (NIAID Contratto N. HHSN272201000009I). Ringraziamo anche Chris King e Ronald Blanton per il supporto nel garantire infetti lumache schistosoma e per utili discussioni.

Misure di sicurezza: Cercarie schistosoma può direttamente penetrare la pelle senza la necessità di un taglio o pori, e causare la schistosomiasi cronica. S. mansoni è un livello di biosicurezza 2 organismo, quindi un equipaggiamento di protezione individuale e le misure di sicurezza adeguate devono essere seguite quando si lavora con Cercaire infettive. La maggior parte delle attrezzature necessarie per crescere e trasformare schistosomi è standard, con poche eccezioni chiave indicato nella tabella alla fine del protocollo. Tutti i lavori cercarie dovrebbe essere fatto in una stanza isolata. Schistosomules dovrebbe essere colta in una sterile, cappuccio approvato biosicurezza. Due strati di nitrile o guanti di lattice dovrebbero essere indossati, così come un camice, un paio di scarpe impermeabili, pantaloni senza buchi o strappi, e protettori manica impermeabile all'acqua per i polsi e le braccia. In caso di sversamento accidentale, spruzzare immediatamente l'area contaminata con etanolo al 70% o 10% di candeggina, strofinando vigorosamente se sulla vostra persona. Questo sarà sufficiente per disabilitare il parassita, ma ogni eventuale infezione devono essere segnalati e presi sul serio. Anche se non sono congenitamente schistosomules infettive, le linee guida istituzionali variano, e dovrebbe essere consultato per determinare se BSL2 precauzioni sono necessarie durante le fasi della vita non infettive. Disinfettare tutte le superfici che vengono a contatto con sostanze potenzialmente infettivi dopo l'esperimento viene eseguito e gettare rifiuti in un contenitore approvato rischio biologico. NOTA: Copertina cassonetti ospitare lumaca 1 a 2 giorni prima del distacco e proteggere dalla luce 1. La raccolta cercarie dall'host lumaca <ol><li> Riempire un ambiente pulito, coppa 500mL circolazione dei detergenti a metà pieno di acqua distillata equilibrati a temperatura ambiente. Se si lavora con le lumache host infetto con miracidi in date diverse, utilizzare un bicchiere separato per ogni data di infezione (Questo è particolarmente importante se le lumache saranno riutilizzati per futuri esperimenti). La dimensione del bicchiere può anche essere più piccolo a seconda della esperienza dell'utente. </li><li> Raccogliere gli host infetti lumaca che si desidera versare e accuratamente depositarli nel bicchiere con un pesce d'acquario standard di rete e pinze uso generale, se necessario. </li><li> Bicchiere posto su un vassoio d'emergenza versare circa 8 a 12 pollici sotto una lampada a incandescenza. Lasciate riposare per 1-2 ore sotto la luce. Cercarie uscire l'host lumaca quando esposto alla luce. </li><li> Con attenzione filtrare lumache dalla miscela cercarie. Prendere misure di sicurezza supplementari, come miscela altamente contagiosa. Ricorda, cercarie possono direttamente penetrare la pelle umana! </li><li> Sostituire mischia fonte di luce per circa 15 minuti, consentendo ad ogni questione rifiuti particelle di stabilirsi. </li><li> Trasferimento cercarie in un beuta pulita utilizzando una pipetta, evitando i detriti sul fondo del bicchiere. Porre il pallone a circa 45 ° su ghiaccio al buio per 45 - 60 minuti, permettendo cercarie di stabilirsi in un angolo. </li><li> Utilizzare una pipetta 50 ml di togliere 75 al 90% del supernatante e depositarlo in un bicchiere contenente candeggina al 10% o 70% di etanolo, facendo attenzione a non lasciare che le gocce d'acqua che contiene a goccia cercarie dalla pipetta. </li><li> Agitare la beuta contenente cercarie delicatamente per risospendere le cercarie in soluzione. Utilizzare una pipetta per trasferire il campione al sterile 50 ml provette coniche. Posizionare i tubi di nuovo sul ghiaccio per 20 minuti al buio. Cercarie si depositerà verso il fondo della provetta al buio. </li></ol> 2. Trasformazione manuale di cercarie di schistosomules Prima di iniziare: Fare RPMI 1640 completo (RPMI, 5% siero fetale bovino, 1X Pen / Strep) e calda a 37 ° C. (E 'fondamentale che il siero fetale bovino utilizzato è stato inattivato tramite incubazione a 56 ° C per 1 ora come schistosomi possono essere sensibili a complemento). <ol><li> In una cappa di rischio biologico, rimuovere il surnatante fino a 5 a 10 ml di soluzione in ogni 50 ml con una pipetta o un dispositivo vuoto. </li><li> Collegare un AWG 22 double-ended, luer lok emulsionare l'ago di una siringa di dimensioni appropriate. </li><li> Lentamente disegnare impasto nella siringa. Raccogliere cercarie da tutte le provette da 50 ml in una siringa. Essere attenti di gocciolamento. </li><li> Con attenzione volta siringa sopra tale che l'estremità ago separato è in alto. Allegare un altro siringa a questa parte dell'ago emulsionante. </li><li> Passare la miscela attraverso l'ago per un totale di 40 volte (20 volte avanti e indietro) per trasformare le cercarie. </li><li> Posizionare le siringhe verticalmente in modo tale che la miscela è contenuta nella siringa in basso e in alto la siringa è vuota. Rimuovere la siringa superiore e disinfettare in etanolo al 70%. </li><li> Deposito goccia a goccia miscela in un ambiente pulito ad alta parete 100 millimetri x 50 millimetri piatto pirex o un piatto cristallizzazione. Disinfettare di aghi e siringhe in etanolo al 70%. </li><li> Aggiungi 37 ° C RPMI 1640 completo dei media in modo che ilparte inferiore della scatola di Petri è completamente coperto, come se versando un piatto di brodo Luria. </li><li> Agitare delicatamente per raccogliere schistosomules al centro della scatola di Petri. Evitare gli schizzi. Nota: Può essere utile per spegnere la luce cappa per questa fase di visualizzare in modo più adeguato la schistosomules al centro. </li><li> Immediatamente deposito schistosomules concentrata in un nuovo 12-pozzetti di coltura cellulare e con un contagocce sterile. </li><li> Ripetere 2.9 e 2.10 fino schistosomules non sono più presenti nel centro del piatto (circa 10 volte). Deposito ogni successiva raccolta in un pozzo fresco. </li><li> Riempire ogni bene fino a metà corsa (~ 1,5 ml) con i media preriscaldata RPMI completo. </li><li> Visualizzare su un microscopio invertito per verificare la presenza di schistosomules e assenza di cercarie. </li><li> Crescere il schistosomules in un incubatore CO 2 set a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: In attesa di trasferimento schistosomules trasformato in terreni di coltura, la visualizzazione sotto una rovesciata luminoso microscopio a campo (vedere la tabella attrezzature per un esempio) dovrebbe produrre una immagine simile alla figura 1, in cui solo schistosomules trasformato sono presenti nel pozzo. Potenziali contaminanti potrebbero includere cercarie intatta, code mozzate cercarie, o altri residui. Se non microscopio invertito è disponibile, un microscopio standard e persino un campo di applicazione dissezione sarà sufficiente visualizzare la schistosomules. Si noti che questa procedura non sempre trasformare il 100% delle cercarie. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Schistosomulum Trasformato <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Cercariae e Tails Severed

<ol><li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li>
<li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis+and+water+resources+development%3A+systematic+review%2C+meta-analysis%2C+and+estimates+of+people+at+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li>
<li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Int%22%5BJournal%5D)">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li>
<li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection%3A+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li>
<li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae%3A+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li>
<li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+within+host+tissues%3A+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li>
<li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li>
<li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+cercarial+responses+to+irradiance+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li>
<li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula%2C+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li>
<li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li>
<li>Yoshino, T. P. &amp, Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li>
<li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li>
<li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li>
<li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Diversi potenziali problemi potrebbero insorgere durante la procedura di trasformazione, tuttavia, questo protocollo è stato progettato per evitare la maggior parte di questi problemi. Un potenziale pericolo è l&#39;intasamento dell&#39;ago emulsionante, che nasce di solito a causa di detriti lasciati dalla raccolta al punto 1.3. Assicuratevi di lasciare tutto il particolato di stabilirsi a passo 1,5 e di trasferire le cercarie attenzione al punto da 1,6 a evitare questo problema. Inoltre, come descritto in precedenza, lavorando all&#39;interno di una cappa di sicurezza biologica, l&#39;uso di dispositivi di protezione individuale (anche visiere) e di evitare una pressione eccessiva sulla siringhe è consigliabile. Staccata code cercarie possono essere visualizzati nei media, che è indicativo della scarsa separazione durante la fase 2.9. Le code mostra uno spasmo, come movimento e hanno una forma distinta (vedi Figura 2), e questa convenzione sono facilmente distinguibili dal schistosomules. La coda può essere rimosso lavando il schistosomules in eccesso di RPMI completo che permette la schistosomules di stabilirsi. Le code rimarranno galleggianti e possono essere aspirate fuori. Se cercarie intatti sono presenti nei media, la trasformazione in fase 2.5 non è stato eseguito correttamente. L&#39;immagine di un cercarie intatto è raffigurato in Figura 3b di riferimento. Se si verifica questo problema, assicurarsi che l&#39;ago emulsionante utilizzato è delle dimensioni appropriate. Inoltre, il numero di volte in cui viene passato il composto cercarie attraverso l&#39;ago può essere aumentata, anche se 40 volte è in genere molto più che sufficiente per raggiungere il 100% di taglio delle code cercarie. Trasformazione di cercarie in schistosomules è stato descritto nel 1974 da Colley e Wikel (13). Da allora, la preparazione di schistosomules è stato fatto utilizzando la strategia di taglio con un ago e la siringa come descritto in questo protocollo, o utilizzando un approccio vortex e separati con gradienti di Percoll (14, 15) o vorticoso, come dimostrato in questo documento. Queste due tecniche per la preparazione schistosomules sono ben descritti da Fred Lewis (16) e ulteriori informazioni per la coltura di ulteriori schistosomules per la crescita a lungo termine si possono trovare presso il Centro Risorse NIAID schistosoma ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;ago emulsionante </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Media 1X (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) inattivato con il calore </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Piatto cristallizzando (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> Pinzetta General Purpose </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco Acquario netto artemia </td><td> Petco </td><td> Codice: 1190954 </td></tr></tbody></table>

trasformazione e cercarie in vitro la coltivazione di schistosoma mansoni schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Parassiti schistosoma sono gli agenti causali della schistosomiasi, una malattia cronica debilitante che colpisce oltre 200 milioni di persone nel mondo e al secondo posto alla malaria tra le malattie parassitarie, in termini di salute pubblica e impatto socio-economico (1-4). Schistosoma sono vermi parassiti trematode con un ciclo di vita complesso interscambio tra una vita parassitaria in ospiti di molluschi e di mammiferi con intervenendo libero nuoto fasi. In breve, nuoto libero cercarie infettare un ospite mammifero penetrando la pelle con l&#39;ausilio di proteasi secrete, durante i quali le cercarie perdono la coda, si trasforma in schistosomules. Il schistosomules deve ora eludere il sistema immunitario ospite, sviluppare un intestino per la digestione dei globuli rossi, e migrano attraverso i polmoni e la circolazione portale in rotta verso la destinazione finale nel sistema portale epatico ed eventualmente le vene mesenteriche (per S. mansoni) dove maschile e femminile coppia vermi e compagno, producendo centinaia di uova ogni giorno. Alcune delle uova sono espulso dal corpo in acqua dolce, dove le uova si schiudono in free-nuoto miracidi (5-10). Il miracidi infettare specie di lumaca specifici e si trasformano in sporocisti madre e figlia, che a loro volta, producono cercarie infettive, completando il ciclo di vita. Purtroppo, l&#39;intero ciclo di vita schistosoma non può essere coltivato in vitro, ma cercarie infettive può essere trasformato in schistosomules, e il schistosomules può essere coltivato per settimane per l&#39;analisi dello sviluppo schistosoma in vitro o l&#39;analisi microarray. In questo protocollo, forniamo una descrizione visiva di trasformazione cercarie e in coltura in vitro di schistosomules. Noi capannone cercarie infettive dal glabrata Biomphalaria lumaca di accoglienza e manualmente li trasformano in schistosomules staccando la coda con un emulsionante doppio attacco ago. In vitro cercarie trasformazione e tecniche di coltura schistosomules descritte evitare l&#39;uso di un ospite mammifero, che semplifica la visualizzazione di schistosomi e facilita la raccolta del parassita per l&#39;analisi sperimentale. Trasformazione in vitro e le tecniche di coltura schistosomi sono state fatte da anni (11, 12), ma non esistono ancora protocolli visivo sono stati sviluppati che sono disponibili per l&#39;intera comunità.

Ci descrivono un<em&gt; In vitro</emMetodo&gt; per schistosomula coltura del parassita verme piatto<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, Attraverso la raccolta e la trasformazione di cercarie infettive da acqua dolce glabrata ospite intermedio Biomphalaria lumaca.

Trasformazione e cercarie In vitro La coltivazione di Schistosoma mansoni Schistosomules

I parassiti schistosomi sono gli agenti eziologici della schistosomiasi, una malattia cronica debilitante che colpisce oltre 200 milioni di persone a livello globale e ...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare CRC infettivi in shisom. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo i CRC infettivi dall'ospite lumaca. I CRC infettivi vengono concentrati e successivamente trasformati in shisom non infettivi mediante un ago a doppio taglio.Infine, gli shisom vengono concentrati e raccolti in una piastra di coltura e incubati in RPMI a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere shisom trasformati con contaminazione da FU cial o coda cial. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché una procedura di trasformazione può risultare difficile da apprendere e potenzialmente pericolosa.Le cica sono infettive e in alta concentrazione, e l'isolamento richiede una manipolazione delicata e precisa per procedere in modo sicuro ed efficace. A dimostrare la procedura sarà John, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Riempire un becher pulito da 500 millilitri per metà con acqua distillata a temperatura ambiente utilizzando una rete da acquario standard e pinze. Trasferire le chiocciole infette nel becher.Posizionare il becher su un vassoio di contenimento per versamenti di emergenza, a una distanza di 20-30 cm al di sotto di una sorgente luminosa a incandescenza, e lasciarlo lì per uno o due ore. L'esposizione alla luce intensa induce il CRC a uscire dall'ospite lumaca. Per rimuovere le lumache, assicurarsi di adottare precauzioni aggiuntive per evitare qualsiasi contatto con l'acqua infetta, che contiene CRC in grado di penetrare direttamente la pelle umana.Rimuovere le lumache, quindi sostituire la soluzione sotto una sorgente luminosa per circa 15 minuti, in modo che eventuali sostanze di scarto in sospensione possano depositarsi sul fondo del matraccio. Una volta che i residui si sono depositati, utilizzare una pipetta per trasferire il sovranatante in un matraccio Erlenmeyer pulito, evitando i detriti sul fondo del becher.Posizionare il matraccio sul ghiaccio a un angolo di 45 gradi. Incubare la soluzione al buio per 45-60 minuti, in modo che il CRC si depositi in un angolo. Una volta che i parassiti si sono sedimentati, utilizzare una pipetta da 50 millilitri per rimuovere la maggior parte del soprannatante e scartarlo con attenzione.In un becher contenente candeggina al 10% o etanolo al 70%, agitare delicatamente il matraccio per risospendere i parassiti. Quindi utilizzare una pipetta per trasferire il campione in provette coniche sterili da 50 millilitri. Porre le provette sul ghiaccio e incubarle nuovamente al buio per 20 minuti, in modo da permettere al CRC di sedimentare.Dopo che i parassiti si sono depositati, utilizzare una pipetta per eliminare la maggior parte dei sovranatanti, lasciando da cinque a dieci millilitri di liquido in ogni provetta. Successivamente, montare su una siringa un ago emulsionatore a doppia estremità da 22 gauge con sistema di bloccaggio a baionetta. Aspirare lentamente la soluzione contenente i parassiti da ogni provetta nella siringa.Avendo cura di non far gocciolare la miscela infettiva nella cappa. Ruotare con attenzione la siringa in modo che l'ago sia rivolto verso l'alto e collegare una seconda siringa all'estremità libera dell'ago. Passare la miscela avanti e indietro tra le due siringhe circa 20 volte per trasformare il crc.Quindi posizionare le siringhe verticalmente in modo che quella vuota sia in alto. Rimuovere con cura la siringa superiore e disinfettarla con etanolo al 70%. Depositare i parassiti, goccia a goccia, in una capsula di Petri Pyrex pulita e con i bordi alti.Quindi disinfettare l'ago e la siringa nell'etanolo al 70%. Successivamente, posizionare la piastra su uno sfondo bianco per facilitare la visualizzazione dei parassiti e aggiungere RPMI completo preriscaldato a 37 gradi Celsius in modo che il fondo della piastra di Pyrex sia completamente ricoperto.Mescolare delicatamente per raccogliere lo shisom al centro utilizzando una pipetta sterile. Raccogliere una parte dello shisom concentrato e trasferire i parassiti in una nuova piastra per colture cellulari a 12 pozzetti. Ripetere questo passaggio di risciacquo fino a quando non restano più parassiti.Dopo il trasferimento dei parassiti, riempire ogni pozzetta per circa metà con RPMI tiepido per verificare la presenza di shisom. Visualizzare la piastra utilizzando un microscopio ottico invertito. A questo punto, la maggior parte dei parassiti dovrebbe essersi trasformata in shisom, distinguibili dagli CRC E poiché sono meno modulari e privi della caratteristica coda ciliata.Un piccolo numero di CRC integri e di code caudali di CRC o altri detriti può essere presente. Questi possono quindi essere coltivati e mantenuti in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un massimo di sei settimane, con cambi settimanali del mezzo di coltura. Non dimenticare che lavorare con agenti infettivi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso di doppi guanti con protezioni per le maniche, nonché l'impiego corretto delle strutture e delle cappe a sicurezza biologica.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Schistosoma mansoni uova sono potenti stimolatori del T helper di tipo 2 (Th2) risposta immunitaria, caratteristica di infezioni parassitarie, asma e infiammazione allergica. Questo protocollo utilizza S. mansoni uovo iniezione per generare un CD4 Th2 citochine indotta da risposta infiammatoria nel polmone, caratterizzata dalla formazione di granulomi intorno al polmone l'uovo, eosinofilia e l'attivazione dei macrofagi alternative.

Con ovuli<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Come<em&gt; In vivo</em&gt; Modello di elminti-indotta infiammazione polmonare

Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento axenica su larga scala e la raccolta di nuotare liberamente miracidia del trematode umano sangue Schistosoma mansoni e la loro successiva elaborazione per l'introduzione in coltura in vitro .

Massa isolamento e coltivazione In Vitro delle fasi Intramolluscan del trematode umano sangue Schistosoma Mansoni

L'agente di Trypanosoma cruzi di malattia di Chagas produce infezioni asintomatiche di lunga durata che improvvisamente trasformarsi in patologia clinicamente riconosciuta. Il seguente protocollo di ricerca descrive uno studio epidemiologico a breve termine basati sulla famiglia per svelare il T. cruzi infezione sessualmente trasmessa dal padre alla progenie.

Trasmissione sessuale dell'americano Trypanosomes da maschi e femmine ai compagni di Naive

Qui, abbiamo fornito un metodo per ottenere una trasfezione stabile dei parassiti dell'Eimeria di pollo nucleofecting sporozoiti o merozoiti di seconda generazione. I parassiti eimeri geneticamente modificati che esprimono geni antigenici eterologi potrebbero essere usati come veicoli per la somministrazione di vaccini.

Nucleofezione e Propagazione In Vivo dei Parassiti dell'Emeria del Pollo

Indagini dettagliate sugli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria sono fondamentali per progettare efficaci strategie di blocco della trasmissione. Questo protocollo dimostra come coltura efficacemente gametociti infettivi e quindi nutrire questi gametociti alle zanzare per generare stadi di zanzara di P. falciparum.

Plasmodium falciparum Coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale della membrana

Descriviamo una tecnica di trasduzione rapida transitoria in diversi stadi di sviluppo di Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione.

Trasduzione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus

Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene per eGFP come transgene integrato stabile utilizzando il sistema pLEXSY. I parassiti trasfettati sono stati clonati limitando la diluizione e i cloni con la più alta intensità di fluorescenza in entrambe le specie sono stati selezionati per un ulteriore utilizzo nei saggi di screening farmacologico.

Sviluppo di ceppi di specie di Leishmania con espressione costitutiva di eGFP

La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .

Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

Questo studio mostra un protocollo dettagliato per eseguire la microscopia ad espansione ultrastrutturale in tre fasi del ciclo di vita in vitro di Trypanosoma cruzi, il patogeno responsabile della malattia di Chagas. Includiamo la tecnica ottimizzata per le proteine del citoscheletro e la marcatura del pan-proteoma.

Microscopia ad espansione ultrastrutturale in tre fasi del ciclo di vita in vitro di Trypanosoma cruzi

La genetica chimica prevede la sostituzione di un residuo gatekeeper con un amminoacido contenente una catena laterale diversa nel locus bersaglio. Qui, abbiamo generato un parassita mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 e identificato le vie compensatorie adottate dal parassita nel background mutante.

Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

Qui, descriviamo le condizioni di coltura in vitro , l'isolamento e l'aumento della generazione di vescicole extracellulari (EV) da Echinococcus granulosus. Le piccole vescicole extracellulari sono state caratterizzate dalla diffusione dinamica della luce e dalla microscopia elettronica a trasmissione. L'assorbimento da parte delle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo e la loro modulazione fenotipica sono stati studiati mediante microscopia confocale e citometria a flusso.

Isolamento e captazione delle cellule dendritiche di piccole vescicole extracellulari da Echinococcus granulosus

Impara a coltivare schistosomula di Schistosoma mansoni trasformando le cercarie infettive raccolte da Biomphalaria glabrata. Questo metodo consente di studiare la biologia del parassita in sicurezza per la ricerca sulla schistosomiasi.

Trasformazione e cercarie In vitro La coltivazione di Schistosoma mansoni Schistosomules

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