Imaging tridimensionale di astrociti immunomarcati mediante microscopia confocale

Prendi una sezione cerebrale di topo immunocolorata con astrociti marcati in fluorescenza. Il citoplasma dell'astrocita diventa rosso fluorescente, mentre il nucleo diventa blu.

Posizionare il vetrino sul tavolino di un microscopio confocale sotto una lente obiettiva adatta.

Utilizzando il software di acquisizione, regolare la messa a fuoco e selezionare i fluorofori che marcano il citoplasma dell'astrocita e il nucleo.

Avvia l'imaging dal vivo e ottimizza i parametri di imaging per ridurre il rumore nell'immagine acquisita.

In Parametri di acquisizione, selezionare una modalità di scansione a bassa velocità per acquisire un'immagine bidimensionale di qualità superiore.

Identifica la posizione più alta dell'astrocita come punto di partenza per lo Z-stack e la posizione più bassa come punto finale.

Definisce il numero di sezioni che coprono l'intera profondità della cella.

Unisci le fette per generare un'immagine tridimensionale dell'astrocita.

Per iniziare la microscopia confocale, posizionare un vetrino sul tavolino del microscopio e selezionare l'obiettivo 63x. Dopo aver aperto il software di acquisizione, fare clic su Smart Setup nella scheda Acquisizione e selezionare i fluorofori appropriati. Qui vengono utilizzati DAPI e Alexa Fluor 555.

Quindi, fai clic su Miglior segnale, seguito da Applica. Quindi fare clic su Imposta esposizione per consentire al computer di determinare i parametri di esposizione ottimali.

Per ottimizzare l'immagine, apri la finestra Canali e imposta l'immagine su Live. Regolare la messa a fuoco se necessario. Quindi fare clic su 1 AU per ottimizzare il foro stenopeico. Regola il guadagno per ottenere la migliore intensità.

Infine, imposta il guadagno digitale tra 2 e 3. Dopo questa ottimizzazione, arrestare l'immagine live e aprire la finestra Modalità di acquisizione. Regola le dimensioni del fotogramma facendo clic su X per Y e seleziona 1024 per 1024. Inoltre, scegli una velocità bassa.

Quindi, apri la scheda Media e seleziona un numero maggiore o uguale a 4. Quindi fare clic sul pulsante Snap e salvare l'immagine 2D acquisita. Per configurare l'imaging 3D, apri la scheda Smart Setup e seleziona l'elemento Z-Stack, che causerà l'apertura della finestra dello stack.

Per impostare la prima e l'ultima posizione per lo Z-Stack, fare nuovamente clic su Live e regolare la messa a fuoco sulla posizione più alta dell'astrocita. Fare clic su Imposta prima. Ora regola la messa a fuoco sulla posizione più bassa dell'astrocita e fai clic su Imposta ultimo. Quindi interrompi la visualizzazione in diretta.

Successivamente, scegli l'intervallo facendo clic su Ottimale per impostare il numero di sezioni. Qui, l'intervallo è di 1,01 micrometri. Infine, fai clic su Avvia esperimento e salva le immagini una volta completata la scansione.