Caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali geneticamente modificate per applicazioni neuroterapeutiche

Inizia con le cellule staminali mesenchimali transgeniche di topo, cellule multipotenti derivate dal midollo osseo.

Le cellule sono ingegnerizzate per esprimere GFP e fattori neurotrofici terapeutici che supportano la crescita e la sopravvivenza neuronale.

Lavare le cellule con tampone e fissarle per preservarne l'integrità.

Lavare nuovamente con tampone, quindi aggiungere una soluzione per permeabilizzare la cellula e le membrane nucleari e bloccare i siti di legame non specifici.

Introdurre anticorpi primari che hanno come bersaglio una proteina marcatrice della proliferazione cellulare espressa esclusivamente nel nucleo delle cellule in divisione.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungere anticorpi secondari coniugati con fluorofori che prendono di mira gli anticorpi primari e un colorante legante il DNA per contrastare la colorazione dei nuclei.

Lavare con tampone per rimuovere i reagenti non legati.

Caricare la lastra nel sistema di screening ad alto contenuto e acquisire immagini per rilevare i segnali fluorescenti.

L'espressione del marcatore di proliferazione cellulare indica una divisione cellulare attiva, suggerendo l'idoneità delle cellule transgeniche per applicazioni neuroterapeutiche.

Per eseguire un saggio di proliferazione cellulare Ki-67, utilizzare un tampone fosfato molare 0,1 per sciacquare le colture cellulari per un minuto. Dopo aver ripetuto il lavaggio, utilizzare il 4% di paraformaldeide, o PFA, a temperatura ambiente per 20 minuti per fissare le colture.

Dopo il fissaggio, rimuovere il PFA e utilizzare il PBS per sciacquare i pozzetti tre volte per sette minuti ciascuno. Dopo aver bloccato le cellule secondo il protocollo di testo, applicare 100 microlitri di soluzione di anticorpi primari su ciascun pozzetto. Coprire la piastra e incubare a 4 gradi Celsius per una notte.

Dopo aver lavato le cellule tre volte per sette minuti per ogni lavaggio, applicare l'anticorpo secondario, porre le cellule al buio e incubare a temperatura ambiente per 90 minuti. Dopo altri tre lavaggi, coprire la lastra e conservarla a 4 gradi Celsius fino all'imaging.

Per eseguire l'imaging automatizzato, caricare la piastra immunomarcata nel sistema HCS e lasciare che la piastra si equilibri per 20 minuti. Aprire il software di acquisizione e analisi delle immagini del sistema HCS. Scegli le impostazioni di acquisizione per l'obiettivo 10X utilizzando il binning della fotocamera su 1 e l'impostazione del guadagno su 2.

Usa la funzione di esposizione automatica per trovare il piano Z in cui risiedono le celle e calcola l'offset per ogni lunghezza d'onda di interesse. Per l'analisi qui illustrata, acquisire immagini per DAPI, GFP e Cy3.

Scegliere il livello di intensità massimo al quale i pozzetti di controllo negativo non mostrano alcun segnale per l'acquisizione dell'immagine. Utilizzare le stesse impostazioni di soglia per i pozzetti positivi. Infine, acquisisci le immagini e salvale in un database, prima di eseguire l'analisi delle immagini secondo il protocollo di testo.