Sviluppo di una rete neurale micro-tessutale utilizzando una micro-colonna basata su idrogel

Inizia con un piatto contenente una microcolonna. La microcolonna ha un guscio esterno in idrogel e una matrice extracellulare, o nucleo ECM.

Aggiungere gocce di terreno di coltura allo stesso piatto.

Trasferisci gli aggregati di cellule neuronali nel piatto, quindi posizionali in una delle goccioline medie.

Osservare al microscopio e inserire aggregati cellulari ad entrambe le estremità della microcolonna.

Quindi, trasferire la microcolonna seminata nel terreno per la vitalità cellulare.

Incubare per consentire l'adesione della cellula alla MEC.

Utilizzando lo stereomicroscopio, confermare l'attacco delle cellule. Quindi, aggiungere il terreno di coltura per coprire il piatto e incubare.

I neuroni attaccati iniziano a estendere i loro assoni attraverso la MEC.

Sostituisci regolarmente il mezzo medio con un terreno fresco per mantenere i livelli di nutrienti.

Nel tempo, gli assoni crescono e si estendono per l'intera lunghezza della microcolonna, formando reti neurali.

La rete neurale sviluppata per l'ingegneria dei microtessuti è pronta a ricostruire i circuiti neurali danneggiati.

Procedere alla semina cellulare subito dopo l'incubazione. Trasferire circa 10-20 microlitri di terreno di coltura in due aree libere nelle piastre di Petri che contengono le microcolonne. Utilizzare una micropipetta per raccogliere gli aggregati neuronali singolarmente e trasferirli nella piastra di Petri contenente i costrutti. Spostare gli aggregati con una pinza in una delle piccole vasche di terreno di coltura per preservare la salute delle cellule.

Durante l'osservazione al microscopio, utilizzare una pinza per inserire un aggregato a un'estremità delle microcolonne per micro-TENN unidirezionali o a ciascuna estremità per l'architettura bidirezionale. Quindi, spostare la microcolonna seminata nell'altro piccolo pool di terreno di coltura per evitare la disidratazione e preservare la salute dell'aggregato. Quando tutte le microcolonne sono state caricate, incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 45 minuti per consentire agli aggregati di aderire alla ECM.

Dopo l'incubazione, verificare che gli aggregati rimangano alle estremità delle microcolonne, utilizzando lo stereomicroscopio. Infine, inondare accuratamente le piastre di Petri contenenti i micro-TENN con terreno di coltura utilizzando una pipetta. Metti le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per una coltura a lungo termine.