Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una preparazione di fette di tessuto acuto dell'organo nasale RO del topo o del VNO, al fine di eseguire esperimenti di imaging del calcio su sottopopolazioni o singoli neuroni in tessuto vivente. Questo viene ottenuto innanzitutto estraendo il VNO dal naso del topo, quindi dissezionandolo con cura dalla sua capsula cartilaginea al microscopio stereoscopico in un liquido CSF freddo. Successivamente, il VNO isolato viene posizionato verticalmente all'interno di un blocco di agar e vengono tagliate fette di tessuto coronali acute utilizzando un microtomo per verificare l'integrità del tessuto.

Alcune sezioni vengono osservate mediante microscopia confocale dopo immunohistochimica. Altre sezioni vengono caricate con un colorante sensibile al calcio e successivamente perfuse con ligandi putativi di feromoni, e l'attivazione neuronale viene osservata mediante imaging del calcio. Questo metodo può contribuire a risolvere questioni fondamentali nel campo olfattivo.

Ad esempio, centinaia di recettori per feromoni sono espressi nell'organo vomeronasale, ma solo a pochi di essi sono stati identificati ligandi. I recettori per feromoni sono molto difficili da esprimere in un sistema eterologo. Era necessario sviluppare un saggio in vivo efficiente per assegnare feromoni specifici a recettori specifici.

È possibile utilizzare topi transgenici in cui una specifica sottopopolazione di neuroni esprime recettori sconosciuti e può essere identificata grazie all'espressione di GFP. Possiamo inoltre impiegare questo saggio per indagare farmacologicamente i canali ionici e gli enzimi coinvolti nella cascata di trasduzione del segnale di Fairmont, illustrandone la procedura. Oggi saranno Julian e Fabian, due ricercatori del mio laboratorio, a eseguire l'intervento prima della dissezione.

Preparare una soluzione fresca e fredda di liquido cerebrospinale artificiale, ACSF, saturata con ossicarbonio, combinando tutti gli ingredienti tranne il cloruro di calcio. Saturare la soluzione facendo gorgogliare direttamente l'ossicarbonio. Quindi aggiungere il cloruro di calcio e aggiustare con acqua bidistillata fino al volume desiderato.

Mantenere la soluzione di ACSF in ghiaccio fino all'uso. Dopo l'eutanasia e la decapitazione di un topo adulto, preparare una piastra di Petri con ACSF freddo e continuamente ossigenato e carbonatato. Dopo aver rimosso la mandibola inferiore, posizionare la testa del topo nella piastra di Petri.

Posizionare la testa del mouse sotto il microscopio stereoscopico in modo da visualizzare il palato. Successivamente, effettuare un'incisione orizzontale nella parte superiore del palato con forbici microchirurgiche e quindi rimuovere la membrana del palato con pinzette microchirurgiche. Idratare e pulire la cavità esposta con un liquido cefalorachidiano (CSF).

Tagliare la parte superiore e inferiore del setto nasale. Quindi estrarre delicatamente il setto nasale contenente l'organo vomeronasale (VNO) e posizionarlo direttamente in modo verticale in un liquido cefalorachidiano (CSF) pulito. Separare le due parti dell'organo vomeronasale utilizzando pinzette da dissezione microscopica.

Identificare la capsula cartilaginea dell'organo vomeronasale (VNO) e quindi rimuoverla delicatamente, assicurandosi che tutti i frammenti cartilaginei siano eliminati. L'VNO isolato, i frammenti cartilaginei e l'VNO non dissezionato sono indicati qui per primo l'anno, preparare l'agarosio a basso punto di fusione al 3% e quindi allestire l'area di lavoro con gli strumenti necessari. Riempire lo stampo per inclusione con agarosio e assicurarsi che la temperatura sia inferiore a 41 gradi Celsius prima di immergere l'VNO dissezionato. Posizionare il tessuto in verticale al fine di ottenere sezioni coronali.

Posizionare lo stampo di inclusione sul ghiaccio per un minuto, fino a quando l'espulsore si solidifica. Dopo un minuto, rimuovere il blocco dell'espulsore, tagliare l'agar in forma parametale e quindi incollarlo al supporto del microtomo utilizzando il microtomo per tagliare sezioni coronali del VNO a una velocità di 0,5 millimetri al secondo, con un'ampiezza di 0,7 millimetri e uno spessore di 100 micrometri in un liquido cerebrospinale freddo.

Raccogliere le fette di tessuto con un pennello e posizionarle in una piastra per colture cellulari riempita con A CSF freddo, al fine di verificare l'integrità strutturale delle fette di tessuto raccolte, che possono essere fissate e successivamente sottoposte a immunoistochimica per componenti del citoscheletro o altre proteine di interesse. Qui, la colorazione immunoistochimica contro la tubulina acetilata in viola dimostra l'integrità strutturale della fetta di tessuto. Inoltre, l'osservazione di una popolazione neuronale specifica in cui un particolare recettore dei feromoni è stato marcato con GFP mostra la conservazione della morfologia neuronale: neuroni con corpi cellulari piccoli e ovali e lunghi dendriti che raggiungono la superficie della cavità terminando con microvilli possono essere osservati lavorando in una stanza buia.

Incubare le sezioni del VNO in una soluzione di carico composta da A CSF freddo con sette micromolari di URA 2:00 AM e 0,1% onic per un'ora a 37 gradi Celsius dopo un'ora. Mantenere le sezioni caricate sul ghiaccio con ossicarbonazione fino all'uso. Utilizzare un pennello per posizionare le sezioni caricate in una camera di perfusione contenente A CSF e fissarle con un ancoraggio per sezioni di tessuto.

Posizionare la camera di perfusione sul palchetto del microscopio di un sistema di imaging del calcio e procedere con una perfusione continua di ACSF ossigenata e carbonatata a temperatura ambiente. Osservare le sezioni caricate del VNO utilizzando le lunghezze d'onda di fluorescenza corrispondenti al colorante, ovvero da 340 a 380 nanometri per il 4-O-AM. Utilizzare un software appropriato per registrare le variazioni del rapporto intracellulare di calcio. È necessario un sistema di perfusione per indurre la stimolazione chimica.

Qui, una sezione coronale di tessuto VNO di un topo, in cui la sottopopolazione di neuroni che esprime il recettore feromonico V1Rb2 esprime anche GFP, è stata immunoistochimicamente marcata contro la proteina tubulina acetilata, mostrata in viola. Ingrandimenti della sezione mostrano il mantenimento dell'integrità del tessuto. Neuroni con dendriti lunghi sono visibili mentre raggiungono la superficie della cavità, e l'espressione della proteina strutturale può essere osservata nei terminali dendritici e nei microvilli per l'imaging del calcio.

Le sezioni di tessuto caricate con FU vengono inizialmente visualizzate utilizzando il contrasto di fase Hoffman per individuare il campo di interesse a partire dal vaso sanguigno: dalla prima freccia bianca, l'osservatore procede lentamente verso la luz, la seconda freccia bianca, e la regione neuroepiteliale. Il corpo cellulare ovale del neurone nasale RO. La terza freccia bianca può essere identificata dal suo lungo e sottile dite.

La quarta freccia bianca che si estende nella luz, il bottone dendritico neuronale. La quinta freccia bianca indica i microvilli a contatto con le cellule cariche di feromoni RA qui mostrate a tre 80 nanometri, successivamente illuminate a tre 40 e tre 80 nanometri, e questo rapporto tra lunghezze d'onda fluorescenti viene riportato in un grafico corrispondente alle variazioni intracellulari di calcio nei neuroni selezionati, cerchi neri, rossi e blu. Un ATP viene utilizzato per determinare la vitalità dei neuroni.

Osservare la varietà di risposte al calcio mostrate dai tre neuroni selezionati e il fatto che il neurone numero due, indicato con un cerchio rosso, non risponde a un TP e pertanto verrà escluso da ulteriori analisi. La stimolazione chimica viene quindi ottenuta utilizzando sia urina sia una miscela di feromoni murini, osservando in profondità nella sezione di tessuto. Una sottopopolazione di neuroni che esprime sia GFP sia il recettore V one RRB two può essere localizzata.

Qui, un neurone che esprime sia GFP sia il recettore V1RB2 è mostrato accanto a un neurone che non esprime V1RB2. Entrambe le cellule sono caricate con URA 2:00 AM e il neurone che esprime V1RB2 mostra un picco di calcio in risposta alla perfusione del ligando del recettore, il noto 2-Heptanone. Curiosamente, anche il neurone che non esprime V1RB2 risponde al 2-Heptanone, dimostrando la complessità del rilevamento dei feromoni nel VNO.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre e microdissezionare il topo per l'organo cocleare al fine di preparare fette di tessuto acuto. Questo protocollo è inoltre adattabile per indagini fisiologiche mediante l'uso di alternative colorazioni al calcio e configurazioni del microscopio. Buona fortuna con il tuo esperimento.