Name: Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Impara a preparare sezioni acute di organo vomeronasale murino per l'imaging del calcio su neuroni vivi. Questa tecnica consente di studiare le risposte neuronali ai feromoni e identificare nuovi recettori.

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Vogliamo ringraziare particolarmente Monique Nenniger Tosato per il suo eccellente supporto tecnico e Jean-Yves Chatton per i suoi pareri scientifici e la piattaforma di imaging CIF della UNIL per le apparecchiature microscopio. Il finanziamento è stato fornito dal Fondo nazionale svizzero.

1. Dissezione del VNO del mouse <ol><li> Utilizzare topi adulti. Come feromone di rilevamento è implicato in multimodalità, attenta distinzione tra ceppi, genotipi, sessi ed età è importante e influenzerà i risultati. Qui, abbiamo scelto i topi adulti VG 30 precedentemente utilizzati per l'identificazione di un feromone-recettore coppia (2-eptanone-V1rb2) 31 (fig. 1A). </li><li> Prima di iniziare la dissezione, preparare fresco freddo artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF; 118 mM NaCl, NaHCO 3 25 mM, D-glucosio 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1.2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) saturo di oxycarbon (95% O 2: 5% di CO 2). Per questo, mescolare tutti i componenti tranne ACSF CaCl 2. Saturare la soluzione direttamente spumeggiante con oxycarbon. Alla fine, aggiungere i 2 CaCl e regolare con DDH 2 0 al volume desiderato. Tenere la soluzione ACSF sul ghiaccio fino use. </li><li> L'eutanasia del mouse dovrebbe essere preferenzialmente fatto da dislocazione cervicale o da CO 2 inalazione poco prima l'esperimento. </li><li> Tagliare la testa del mouse. Posto sotto un microscopio da dissezione a freddo ACSF continuamente oxycarbonated. </li><li> Tagliare la mandibola e la posizione della testa in modo da visualizzare il palato (Fig. 1B). </li><li> Fare un'incisione in senso orizzontale nella parte superiore del palato (Fig. 1B) con le forbici micro e rimuovere la membrana palato con micro dissettore. Idratare e pulire la cavità esposta con ACSF (Fig. 1C). </li><li> Tagliare la parte superiore e la parte inferiore del setto nasale (Fig. 1C). Delicatamente estrarre il setto nasale contenente il VNO e metterla direttamente in ACSF su ghiaccio (fig. 1D). </li><li> Separare verticalmente le due parti del VNO utilizzando micro dissettore e delicatamente rimuovere la capsula cartilaginea del VNO (Fig. 1E). Assicurarsi che tutti i pezzi cartilaginei vengono rimossi. </li></ol> 2. VNO tessuto preparazione fetta La preparazione dei tessuti VNO fetta descritto in questa sezione 2) è principalmente per le indagini di imaging di calcio. Fette VNO può essere utilizzato anche per immunohistostainings su fette galleggianti per verificare l'integrità strutturale del tessuto (vedi sezione 3) del protocollo). <ol><li> Preparare basso punto di fusione agar (3% in standard PBS) e il vostro posto di lavoro. Avrete bisogno di ACSF, un microtomo e supporta, micro dissettore, incorporando stampi (22 x 22 x 20 mm), salviette di precisione, spazzole, piastre di coltura dei tessuti, cyanacrylat colla, ghiaccio e un termometro. </li><li> Riempire lo stampo con il 3% embedding basso punto di fusione agar. Assicurarsi che la temperatura non è superiore a 41 ° C prima di mettere in verticale il poco cancellato VNO (Fig. 2A) per essere in grado di ottenere fette coronali. </li><li> Mettere lo stampo embedding su ghiaccioper 1 minuto fino a solidificazione e quindi separato dal blocco di agar. Tagliare il blocco agar in una forma piramidale e posizionarlo con la colla sul supporto microtomo (Fig. 2B). </li><li> Tagliate le fette coronali VNO con il microtomo, con una velocità di 0,5 mm / s, un'ampiezza di 0,7 mm e uno spessore di 100 micron a freddo ACSF e raccogliere le fette di tessuto con una spazzola prima di inserirle in una piastra di coltura dei tessuti pieni di freddo ACSF. </li><li> Se le sezioni contengono fluorescenza endogena come GFP (in gene-mirati neuroni) è possibile selezionare sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza (Fig. 2C). </li></ol> 3. Immunoistochimica su fette VNO galleggiante L'obiettivo di questa procedura è quello di verificare l'integrità del tessuto fette del VNO ottenuto in sezione 2). Acetilati-tubulina è un microtubulo / citoscheletro marcatore espresso in dendriti e microvilli dei neuroni sensoriali VNO. Per gli esperimenti di imaging di calcio, andare direzionetemente alla sezione 4) del protocollo. Il metodo immunohistostaining mobile a fette VNO può essere adattato alla valutazione dell'espressione di una proteina di interesse. A tal fine, si consiglia di fissare il VNO per 1h a 4 ° C in una soluzione di fissativo (paraformaldeide 4% in PBS, pH 7.6) dopo il punto 1.7) del protocollo e l'utilizzo da questo punto di PBS a pH 7,6, piuttosto che ACSF soluzione. <ol><li> Nella piastra di coltura tissutale, fette di riparare il vostro interesse in una soluzione di fissativo (paraformaldeide 4% in PBS, pH 7,6) 1h a 4 ° C. </li><li> Blocca il tuo fette di tessuto notte a 4 ° C in una soluzione PBS contenente NGS (siero normale di capra) 10% e Triton X-100 allo 0,5%. </li><li> Incubare fette con l'anticorpo primario (anti-acetilati-tubulina, Mouse, 1:2000) per 16h a temperatura ambiente (RT) in una soluzione PBS contenente NGS 5% e Triton X-100 allo 0,25%. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti con una soluzione di PBS contenente NGS 2%. </li><li> Incubare al buio con il secoanticorpi ndary (Cy5-coniugato capra anti-topo, 1:200) in una soluzione PBS contenente NGS 2% per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS contenente NGS 2%, PBS NGS 1% e PBS solo. </li><li> Montare le sezioni in un supporto di montaggio a fluorescenza (contenenti o meno DAPI) mettendoli al centro delle zone delimitate idrofobica (usare una penna idrofobico) e coprire le fette con coprioggetto. </li><li> Fare osservazioni e acquisizioni con la microscopia confocale e di un software che consente ricostruzioni 3D (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. Immagini di calcio su fette VNO <ol><li> Le seguenti procedure si svolgeranno al buio. Incubare fette VNO per 1h a 37 ° C in una soluzione di carico composto da freddo ACSF con Fura-02:00 (7 mM, soluzione madre di 1 mM in DMSO) e Pluronic 0,1% (w / v; soluzione madre al 20% in DDH 2 O). </li><li> Tenere le fette caricato su ghiaccio con oxycarbonation fino al momento dell'uso. Fette caricate possono essere conservati per3-4h. </li><li> Mettere le fette caricato con un pennello in una camera di perfusione contenente ACSF e mantenere le fette con una fetta di ancoraggio dei tessuti (Fig. 3A). </li><li> Posizionare la camera di perfusione sul palco di un microscopio di imaging di calcio (Fig. 3B) e continuamente profumato con oxycarbonated ACSF a temperatura ambiente. Temperatura può essere adattato con l'utilizzo di un regolatore di temperatura bipolare. </li><li> Osservazioni delle fette caricato VNO (Fig. 3C-E) sono eseguiti con un microscopio invertito a fluorescenza, con un obiettivo 25x o 63x e un luogo fresco SNAP-HQ telecamera. L'illuminazione è fatta in modo sequenziale (340/380 nm) con uno strumento policromatore e registrati a una velocità di 5Hz. Emissione filtrata viene effettuata a 510 nm. Cambia il rapporto di calcio intracellulare (ΔF = 340 nm/380 nm) sono monitorati con un apposito software. </li><li> Chemostimulation devono essere selezionati secondo il vostro scopo sperimentale. Qui, perfusione di ACSF contenente un feromone mix (isobutylamine, 2-eptanone, 4-eptanone, 2-eptanolo, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 M), 2-eptanone (10 -6 M) o raccolto di recente maschili e femminili (1: 1) urina topo (1:100) vengono eseguite 32. Perfusione di ATP (125 mM) è usato come un test di vitalità economica alla fine degli esperimenti (Fig. 3F) e dovrebbe indicare una percentuale di circa l'80% dei neuroni vitali. In queste condizioni, le fette possono essere utilizzati fino a 2 ore. </li><li> GFP-tagged sottopopolazioni di neuroni sensoriali sono visualizzati con illuminazione specifica (qui i neuroni che esprimono V1rb2) e possono essere analizzati con precisione (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Per stabilire un dosaggio funzionale per indagare i percorsi di trasduzione più in atto nel VNO mouse, o per individuare nuove feromoni-recettori coppie, approfittiamo del mouse VG linea (Fig. 1A (Fig. 1E), ci prepariamo acuta fette VNO (Fig. 2C). Fissiamo una frazione di loro, al fine di verificare e validare l'integrità tissutale della preparazione eseguendo immunohistostainings contro la tubulina acetilata-proteina (Fig. 2D-F). L'altra frazione delle fette viene utilizzato per esperimenti di imaging di calcio. Per questo, le fette sono caricati con Fura-02:00 (Fig. 3C-E) e il livello di calcio intracellulare di ogni neurone è monitorato come un rapporto ΔF (Fig. 3F). La vitalità dei neuroni viene valutata da perfusione di ATP (125 micron), dopo di che rapido aumento e transitoria del rapporto ΔF è atteso (Fig. 3F). L'urina è una delle principali fonti di feromoni, perfusione di frescal'urina del mouse Ly raccolti (1:100) viene utilizzato come controllo endogeno. Si innesca transienti di calcio in circa il 50% dei neuroni registrati (cella 1 e 2, fig. 3F). Sotto GFP illuminazione, V1Rb2 neuroni positivi sono osservabili, e perfusione di suo ligando noto feromonali, 2-eptanone, avvia l'attivazione cellulare (cella 1, fig. 3I). È interessante notare che attivazioni neuronali sono osservabili in una frazione di neuroni che non esprimono il recettore V1Rb2 (neuroni negativo GFP) (cella 2, fig. 3I), a dimostrazione della complessità del feromone di codifica nel VNO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dissezione dell'organo vomeronasale del mouse. (A) Un mouse dalla linea VG. (B) Dopo l'eutanasia del mouse, la testa piena è posta sotto un microscopio binoculare e la mascella inferiore viene rimosso in modo da visualizzare il palato. Una piccola incisione orizzontale è fatto(Linea nera tratteggiata). (C) Dopo la rimozione del palato, il setto nasale allineato con il VNO è tagliato in alto e la parte inferiore (bianco linee tratteggiate) per facilitare l'estrazione VNO. (D) Il VNO si trova in soluzione ACSF e separati (inserire: vista di potenza superiore delle due parti). (E) La capsula cartilaginea del VNO è delicatamente rimosso, e il VNO senza la sua capsula cartilaginea viene utilizzato per il resto degli esperimenti. Barre di scala sono: BE, 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Mouse vomeronasale preparazione fetta acuta e dell'integrità tissutale. (A) La VNO mouse è verticalmente integrata in una soluzione agar 3%. La temperatura del agar deve essere inferiore a 41 ° C. (B) Il blocco di agar è tagliato in una forma piramidale e 100 micron sezioni VNO (linea nera tratteggiata) sono generati in ACSF. (C) fette VNO può essere selezionato sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza per visualizzare uno specificopopolazione di tag neuroni sensoriali. (DF) integrità tissutale può essere valutato immunohistostainings contro la tubulina acetilata-proteina, una visione di potenza superiore del V1rb2 gene mirati neuroni dimostrare la perfetta conservazione della preparazione. I neuroni con i loro dendriti che raggiunge la superficie del lume (E) così come l'espressione della proteina strutturale nel manopole dendritiche e microvilli può essere osservato (F). Barre di scala sono: B, 5 mm; C, 60 micron; D, a 40 micron, EF, 20 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immagini di calcio e la rilevazione di feromoni in vomeronasale fette di tessuto acuta. (A) Dopo un Fura-02:00 fase di carico, fette VNO sono posti in una camera di perfusione e sono mantenuti con un ancoraggio adeguato (vedere ad alta potenza). (B) Gli esperimenti sono eseguiti nel buio e fette VNO sono continuamente perfuso con ACSF a temperatura ambiente con un sistema di vuoto. La temperatura può essere chosit con un sistema di controllo della temperatura composto da un elemento bipolare Pelletier e una sonda termica. Questo particolare esperimento è stato eseguito a temperatura ambiente. (CE) fette VNO sono osservabili in contrasto di fase Hoffman (C, Hv) o Fura 380 nm prima di illuminazione (D) e durante l'attivazione neuronale (E, qui con ATP). (F) vitalità neuronale è valutata con perfusione di ATP (125 mM). Qui, chemostimulation avviene con le urine (urina, 1:100) o con un mix di feromoni del mouse (ph mix., 10 -6 M) ad un flusso costante di 165 ml / h. I livelli di calcio intracellulare (ΔF) può essere registrato individualmente per ogni cella (Cella 1 a 3). (G) Un neurone V1Rb2 viene visualizzato sotto GFP illuminazione (1). (H) Il carico di questo neurone (1) così come un non-V1rb2 neuroni che esprimono (2) viene visualizzato. (I) Il neurone V1rb2 è in grado di rispondere a 2-eptanone con un aumento del calcio intracellulare. Questo particolare non V1rb2 neuroni che esprimono risponde anche a 2-eptanone (cella 2). Barre di scala sono: CE, 20 micron; GH,15 micron; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F e I) Durata di applicazione stimolo è indicata dalle barre sotto ogni traccia. La scala cromatica arbitraria rappresenta l'intensità di fluorescenza.

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<li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li>
<li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di imaging di calcio qui presentata permette di registrare, in una preparazione fetta acuta, le risposte feromonali di topo neuroni VNO. Con questo approccio, dissezione dall&#39;animale ai neuroni vomeronasale è, con po &#39;di pratica, facilmente raggiungibile e offre una lunga vita di preparazione dei tessuti. Esso consente in termini di tempo esperimenti come indagini farmacologiche o lo studio di codifica feromonale. Con questa tecnica fisiologica, le popolazioni di grandi dimensioni così come precisa sottopopolazioni neuronali possono essere analizzati nello specifico. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato ad approcci immunoistochimica o esperimenti a base di coloranti altri calcio. L&#39;utilizzo di queste metodologie combinate sicuramente permettere l&#39;identificazione di nuovi leganti feromonale per il chemocettori orfano molti espressi nel topo organo vomeronasale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Adenosina 5&#39;-trifosfato disodico soluzione salina (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Preferenzialmente per immunoistochimica </td></tr><tr><td> Agar (basso punto di fusione) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Preferenzialmente per l&#39;imaging di calcio </td></tr><tr><td> CL-100 bipolare del termoregolatore </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure capra anti-topo IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Riparo dalla luce </td></tr><tr><td> DMSO (dimetilsolfossido) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Incorporare stampi, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescente montaggio di mezzi (Vectashield con DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA, 02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Riparo dalla luce </td></tr><tr><td> Glisseal N (grasso per vuoto, 60 g) </td><td> Borer Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Grande registrazione camera bagno (RC-26G) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (software per l&#39;imaging di calcio; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Sistemi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoclonale anti-tubulina, acetilatod topo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Siero normale di capra (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Piattaforma per camere (P-1) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (bottiglia di dosaggio, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0.258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line riscaldamento Soluzione / raffreddamento </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Fetta di ancoraggio (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Stereofluorescence </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super PEN PAP (idrofobopenna) </td><td> Pelco internazionale </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrante lama microtomo VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome ad alta velocità del sistema policromatore </td><td> Visitron Sistemi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane software scientifico </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in preparazione dei tessuti vomeronasal acuta slice mouse

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson e Martin Lüscher feromone usato il termine per la prima volta nel 1959 da 1 a descrivere prodotti chimici usati per la comunicazione intra-specie. I feromoni sono volatili e non volatili di breve durata 2 molecole secrete e / o contenuti nei fluidi biologici 3,4, come ad esempio urina, un liquido noto per essere la principale fonte di feromoni 3. Comunicazione feromonali è implicata in una varietà di modalità di animali fondamentali quali le interazioni 5,6 parenti, organizzazioni gerarchiche 3 e le interazioni sessuali 7,8 e sono quindi direttamente correlata con la sopravvivenza di una data specie 9,10,11. Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall&#39;organo vomeronasale (VNO) 10,12, una struttura abbinato situato alla base della cavità nasale, e racchiusi in una capsula cartilaginea. Ogni VNO ha una forma tubolare con un lume 13,14 che permette il contatto con l&#39;esternomondo della chimica. Il neuroepitelio sensoriale è composta principalmente da vomeronasale neuroni sensoriali bipolari (VSNs) 15. Ogni VSN estende un singolo dendrite al lume che termina con una manopola dendritiche grande cuscinetto fino a 100 microvilli implicati nella individuazione di prodotti chimici 16. Sottopopolazioni numerose VSNs sono presenti. Essi si differenziano per il chemocettrice essi esprimono e quindi probabilmente dal ligando (s) riconoscono 17,18. Due famiglie principali recettori vomeronasale, V1Rs e V2Rs 19,20,21,22, sono composti rispettivamente da 23 e 240 120 24 soci e sono espressi in livelli separati del neuroepitelio. Recettori olfattivi (OR) 25 e recettori formil peptide (FPRs) 26,27 sono anche espressi in VSNs. Se tali sottopopolazioni neuronali utilizzare lo stesso percorso a valle di segnalazione per i feromoni di rilevamento è sconosciuta. Nonostante un ruolo di primo piano svolto da un calcio-permeabile canale (TRPC2) presente nel microvilli di neuroni maturi 28 TRPC2 canali di trasduzione indipendenti sono stati suggeriti 6,29. A causa dell&#39;elevato numero di sottopopolazioni neuronali e la particolare morfologia dell&#39;organo, le indagini farmacologiche e fisiologiche degli elementi di segnalazione presenti nel VNO sono complessi. Qui, presentiamo un acuto preparazione fetta di tessuto del VNO del mouse per l&#39;esecuzione di indagini di imaging di calcio. Questo approccio permette osservazioni fisiologiche, in un ambiente naturale di un tessuto vivente, di sottopopolazioni generale o individuale di VSNs già caricati con Fura-02:00, un colorante calcio. Questo metodo è anche utile a studiare i GFP-tagged recettore feromone ed è adattabile per l&#39;uso di altre sonde fluorescenti calcio. Come esempio, si usa il mouse: ecco un VG linea 30, in cui è legata la traduzione del recettore feromone V1rb2 l&#39;espressione di GFP da una strategia policistronica. </p&gt;

Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall&#39;organo vomeronasale (VNO). Qui, un acuto preparazione fetta di tessuto VNO per eseguire l&#39;imaging calcio è descritto. Questo approccio permette osservazioni fisiologiche di sottopopolazioni e / o di singoli neuroni in un tessuto vivente ed è comodo per l&#39;identificazione del recettore-ligando.

Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse

Peter Karlson e Martin Lüscher hanno utilizzato per la prima volta il termine feromone nel 1959 per descrivere le sostanze chimiche utilizzate per la comunicazione intraspecifica. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una preparazione di fette di tessuto acuto dell'organo nasale RO del topo o del VNO, al fine di eseguire esperimenti di imaging del calcio su sottopopolazioni e/o singoli neuroni in tessuto vivente. Questo viene ottenuto innanzitutto estraendo il VNO dal naso del topo, quindi dissezionandolo con precisione dalla sua capsula cartilaginea al microscopio stereoscopico in un liquido CSF freddo. Successivamente, il VNO isolato viene posizionato verticalmente all'interno di un blocco di agar e vengono tagliate fette di tessuto coronali acute mediante un microtomo, per verificare l'integrità del tessuto.Alcune sezioni vengono osservate mediante microscopia confocale dopo immunohistochimica. Altre sezioni vengono caricate con un colorante sensibile al calcio e successivamente perfuse con ligandi putativi di feromoni, e l'attivazione neuronale viene osservata mediante imaging del calcio. Questo metodo può contribuire a risolvere questioni fondamentali nel campo olfattivo.Ad esempio, centinaia di recettori per feromoni sono espressi nell'organo vomeronasale, ma solo a pochi di essi sono stati identificati ligandi. I recettori per feromoni sono molto difficili da esprimere in un sistema eterologo. Era necessario sviluppare un saggio in vivo efficiente per assegnare feromoni specifici a recettori specifici.È possibile utilizzare topi transgenici in cui una specifica sottopopolazione di neuroni esprime recettori sconosciuti e può essere identificata grazie all'espressione di GFP. Possiamo inoltre impiegare questo saggio per indagare farmacologicamente i canali ionici e gli enzimi coinvolti nella cascata di trasduzione del segnale di Fairmont, illustrandone la procedura. Oggi saranno Julian e Fabian, due ricercatori del mio laboratorio, a eseguire l'intervento prima della dissezione.Preparare una soluzione fresca e fredda di liquido cerebrospinale artificiale, ACSF, saturata con ossicarbonio, combinando tutti gli ingredienti tranne il cloruro di calcio. Saturare la soluzione facendo gorgogliare direttamente l'ossicarbonio. Quindi aggiungere il cloruro di calcio e aggiustare al volume desiderato con acqua bidistillata.Mantenere la soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (A CSF) sul ghiaccio fino all'uso. Dopo l'eutanasia e la decapitazione di un topo adulto, preparare una piastra di Petri con A CSF freddo e continuamente ossigenato e carbonatato. Dopo aver rimosso la mandibola inferiore, posizionare la testa del topo nella piastra di Petri.Posizionare la testa del mouse sotto il microscopio stereoscopico in modo da visualizzare il palato. Successivamente, effettuare un'incisione orizzontale nella parte superiore del palato con forbici microchirurgiche e quindi rimuovere la membrana del palato con pinzette microchirurgiche. Idratare e pulire la cavità esposta con un liquido cerebrospinale (CSF).Tagliare la parte superiore e inferiore del setto nasale. Quindi estrarre delicatamente il setto nasale contenente l'organo vomeronasale (VNO) e posizionarlo direttamente in modo verticale in un liquido cefalorachidiano (CSF) pulito. Separare le due parti dell'organo vomeronasale (VNO) utilizzando pinzette da dissezione microscopiche.Identificare la capsula cartilaginea dell'VNO e quindi rimuoverla delicatamente, assicurandosi che tutti i frammenti cartilaginei siano stati eliminati. L'VNO isolato, i frammenti cartilaginei e l'VNO non dissezionato sono indicati qui anno prima, preparare l'agarosio a basso punto di fusione al 3% e quindi allestire l'area di lavoro con gli strumenti necessari. Riempire lo stampo per inclusione con agarosio e assicurarsi che la temperatura sia inferiore a 41 gradi Celsius prima di immergere l'VNO dissezionato. Posizionare il tessuto in verticale al fine di ottenere sezioni coronali.Posizionare lo stampo di inclusione sul ghiaccio per un minuto, fino a quando l'espansore si solidifica. Dopo un minuto, rimuovere il blocco dell'espansore, tagliare l'agar in una forma parametrale e quindi incollarlo al supporto del microtomo utilizzando il microtomo per tagliare sezioni coronali del VNO a una velocità di 0,5 millimetri al secondo, con un'ampiezza di 0,7 millimetri e uno spessore di 100 micrometri in un liquido cerebrospinale freddo.Raccogliere le fette di tessuto con un pennello e posizionarle in una piastra per colture cellulari riempita con A CSF freddo, al fine di verificare l'integrità strutturale delle fette di tessuto raccolte, che possono essere fissate e successivamente sottoposte a immunoistochimica per componenti del citoscheletro o altre proteine di interesse. Qui, la colorazione immunoistochimica contro la tubulina acetilata in viola dimostra l'integrità strutturale della fetta di tessuto. Inoltre, l'osservazione di una popolazione neuronale specifica in cui un particolare recettore dei feromoni è stato marcato con GFP mostra la conservazione della morfologia neuronale: neuroni con corpi cellulari piccoli e ovali e lunghi dendriti che raggiungono la superficie della cavità terminando con microvilli possono essere osservati lavorando in una stanza buia.Incubare le sezioni del VNO in una soluzione di carico contenente A CSF freddo con sette micromolari di URA 2:00 AM e 0,1% onico per un'ora a 37 gradi Celsius dopo un'ora. Mantenere le sezioni caricate sul ghiaccio con ossicarbonazione fino all'uso. Utilizzare un pennello per posizionare le sezioni caricate in una camera di perfusione contenente A CSF e fissarle con un ancoraggio per sezioni di tessuto.Posizionare la camera di perfusione sul palchetto del microscopio di un sistema di imaging del calcio e procedere con una perfusione continua di A CSF ossigenato e carbonatato a temperatura ambiente. Osservare le sezioni caricate del VNO utilizzando le lunghezze d'onda di fluorescenza corrispondenti al colorante, ovvero da 340 a 380 nanometri per 4 O 2:00 AM. Utilizzare un software appropriato per registrare le variazioni del rapporto intracellulare di calcio. È necessario un sistema di perfusione per indurre la stimolazione chimica.Qui, una sezione coronale di tessuto VNO di un topo, in cui la sottopopolazione di neuroni che esprime il recettore feromonico V1Rb2 esprime anche GFP, è stata immunoistochimicamente marcata contro la proteina tubulina acetilata, mostrata in viola. Ingrandimenti della sezione mostrano il mantenimento dell'integrità del tessuto. Neuroni con dendriti lunghi sono visibili mentre raggiungono la superficie della cavità, e l'espressione della proteina strutturale è osservabile nei terminali dendritici e nei microvilli per l'imaging del calcio.Le sezioni di tessuto caricate con FU vengono inizialmente visualizzate utilizzando il contrasto di fase Hoffman per individuare il campo di interesse a partire dal vaso sanguigno: dalla prima freccia bianca, l'osservatore procede lentamente verso la luz, la seconda freccia bianca, e la regione neuroepiteliale. Il corpo cellulare ovale del neurone nasale RO. La terza freccia bianca può essere identificata dal suo lungo e sottile dite.La quarta freccia bianca che si estende nella luz, il bottone dendritico neuronale. La quinta freccia bianca indica i microvilli a contatto con le cellule cariche di feromoni RA qui mostrate a tre 80 nanometri, successivamente illuminate a tre 40 e a tre 80 nanometri, e questo rapporto tra lunghezze d'onda fluorescenti viene riportato in un grafico corrispondente alle variazioni di calcio intracellulare nei neuroni selezionati, cerchi neri, rossi e blu. Un ATP viene utilizzato per determinare la vitalità dei neuroni.Si noti la varietà di risposte al calcio mostrate dai tre neuroni selezionati e il fatto che il neurone numero due, indicato con un cerchio rosso, non risponde a un TP e pertanto verrà escluso da ulteriori analisi. La stimolazione chimica viene quindi ottenuta utilizzando sia urina sia una miscela di feromoni murini, osservando in profondità nella sezione di tessuto. Una sottopopolazione di neuroni che esprime sia GFP sia il recettore V one RRB two può essere localizzata.Qui, un neurone che esprime sia GFP sia il recettore V1RB2 è mostrato accanto a un neurone che non esprime V1RB2. Entrambe le cellule sono caricate con URA 2:00 AM e il neurone che esprime V1RB2 mostra un picco di calcio in risposta alla perfusione del ligando del recettore, il 2-eptanon. Curiosamente, anche il neurone che non esprime V1RB2 risponde al 2-eptanon, dimostrando la complessità del rilevamento dei feromoni nel VNO.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre e microdissezionare il topo per l'organo cocleare al fine di preparare fette di tessuto acuto. Questo protocollo è inoltre adattabile per indagini fisiologiche mediante l'uso di alternative colorazioni al calcio e configurazioni del microscopio. Buona fortuna con il tuo esperimento.

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Multielectrode array (MEA), le registrazioni forniscono un metodo per studiare l'attività elettrica di ampie popolazioni di neuroni. Qui, vi presentiamo i dettagli di una preparazione MEA per registrare dal epitelio del mouse vomeronasale mentre simultaneamente stimola il tessuto.

Array registrazioni Multielectrode dell&#39;epitelio Vomeronasal

L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chimici intraspecie che veicolano informazioni sociali e riproduttivi. Abbiamo effettuato Ca2 + esperimenti di imaging con topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci consente di analizzare i modelli di risposta dei neuroni complicato vomeronasale a un gran numero di stimoli feromone.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

Questo video descrive l'isolamento di un organo vomeronasale di topo (VNO) e la preparazione del tessuto per il sezionamento del vibratomo. Le sezioni vengono utilizzate per caratterizzare gli attributi biofisici e fisiologici di uno specifico gruppo di neuroni sensoriali.

Preparazione dell'organo vomeronasale di topo per il sezionamento del vibratomo

Questo video mostra la registrazione elettrofisiologica dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nei topi utilizzando una tecnica di patch-clamp perforata. L'epitelio olfattivo, contenente OSN con recettori degli odori marcati con fluorofori, viene isolato da un topo e fissato in una camera di registrazione. Una pipetta di registrazione è fissata alla manopola dendritica di un OSN e la nistatina all'interno della pipetta perfora la membrana per formare la connettività elettrica con la cellula.

Registrazione perforata con patch-clamp dei neuroni sensoriali olfattivi nei topi

Il video del protocollo descrive la creazione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica dai neuroni sensoriali dell'organo vomeronasale (VNO) nei topi. Una fetta di VNO coronale con neuroni sensoriali marcati in fluorescenza viene collocata in una configurazione di registrazione. Un neurone marcato viene patchato con una pipetta di registrazione in una configurazione di cellula intera per la registrazione elettrofisiologica in risposta a stimoli chimici.

Definizione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica dai neuroni sensoriali vomeronasali

Un efficace manuale disosso metodo per preparare intatto il mouse tessuto nasale con organizzazione anatomica Conservato

L'accessorio bulbo olfattivo mouse (AOB) è stato difficile studiare nel contesto della codifica sensoriale. Qui, dimostriamo una dissezione che produce un vivo preparazione franco in cui i neuroni AOB rimangono funzionalmente collegati agli ingressi periferici, facilitando la ricerca di elaborazione delle informazioni dei feromoni mouse e cairomoni.

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L'analisi delle proprietà fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi incontra ancora limitazioni tecniche. Qui li registriamo attraverso un patch-clamp perforato in una preparazione intatta dell'epitelio olfattivo in topi geneticamente mirati. Questa tecnica consente la caratterizzazione delle proprietà di membrana e delle risposte a specifici ligandi di neuroni che esprimono recettori olfattivi definiti.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Qui, descriviamo un approccio fisiologico che consente l'identificazione e l'analisi approfondita di una popolazione definita di neuroni sensoriali in fette di tessuto coronale acuto dell'organo vomeronasale del topo utilizzando registrazioni di patch-clamp a cellula intera.

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Dissezione rapida e dissociazione dell'epitelio olfattivo di topo per sospensioni a nucleo singolo

Impara a preparare sezioni acute di organo vomeronasale murino per l'imaging del calcio su neuroni vivi. Questa tecnica consente di studiare le risposte neuronali ai feromoni e identificare nuovi recettori.

Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse

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