Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire una preparazione acuta della fetta di tessuto dell'organo nasale RO di topo o VNO al fine di eseguire esperimenti di imaging del calcio su sottopopolazioni e/o singoli neuroni nel tessuto vivente. Ciò si ottiene estraendo prima il VNO dal naso del topo e poi sezionandolo con la micro sezione dalla sua capsula cartilaginea sotto un microscopio da dissezione in A CSF freddo. Successivamente, il VNO isolato viene posizionato verticalmente in un blocco di agar e le fette di tessuto coronale acuto vengono tagliate utilizzando un microtomo per verificare l'integrità del tessuto.

Alcune fette vengono osservate dopo immunoistochimica al microscopio confocale. Altre fette vengono caricate con un colorante sensibile al calcio e quindi perfuse con leganti feromonali putativi e l'attivazione neuronale viene osservata utilizzando l'imaging del calcio. Questo metodo può aiutare a risolvere problemi chiave in campo olfattivo.

Ad esempio, centinaia di recettori dei feromoni sono espressi nell'organo romo nasale, ma pochissimi di essi hanno ligandi identificati. I recettori dei feromoni sono molto difficili da esprimere in un sistema eterologo. Avevamo bisogno di sviluppare un test in vivo efficiente per assegnare feromoni specifici a un recettore specifico.

Possiamo utilizzare topi tattili in cui una specifica sottopopolazione di neuroni esprime recettori sconosciuti e può essere identificata dall'espressione di GFP. Potremmo anche utilizzare questo test per studiare farmacologicamente i canali ionici e gli enzimi coinvolti nella cascata di trasduzione Fairmont dimostrando la procedura. Oggi saranno Julian e Fabian uno, due ricercatori del mio laboratorio Prima di iniziare la dissezione.

Preparare liquido cerebrospinale artificiale, fresco, freddo, un liquido cerebrospinale saturo di ossicarboidrato combinando tutti gli ingredienti tranne il cloruro di calcio. Saturare la soluzione gorgogliandola direttamente con ossicarb. Quindi aggiungere il cloruro di calcio e regolare con acqua distillata doppia al volume desiderato.

Tenere la soluzione A CSF sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Dopo l'eutanasia e la decapitazione di un topo adulto, preparare una capsula di Petri con liquido cerebrospinale gassato, freddo e continuamente ossigenato. Dopo aver rimosso la mascella inferiore, posizionare la testa del topo nella capsula di Petri.

Posizionare la testa del mouse sotto il microscopio da dissezione per visualizzare la tavolozza. Successivamente, praticare un'incisione orizzontalmente nella parte superiore del palato con micro forbici e quindi rimuovere la membrana del palato con una pinza da micro dissezione. Idratare e pulire la cavità esposta con A CSF.

Tagliare la parte superiore e inferiore del setto nasale. Quindi estrarre delicatamente il setto nasale contenente il VNO e posizionarlo direttamente nel liquido cerebrospinale A pulito verticalmente. Separare le due parti del VNO utilizzando una pinza per microdissezione.

Identificare la capsula cartilaginea del VNO e quindi rimuoverla delicatamente, assicurandosi che tutti i pezzi cartilaginei siano stati rimossi. Il VNO isolato, i pezzi cartilaginei e i VNO non sezionati sono indicati qui per primi l'anno, preparano la coclea a basso punto di fusione al 3% e poi assemblano l'area di lavoro con gli strumenti necessari. Riempire lo stampo di inclusione con la coclea e assicurarsi che la temperatura sia inferiore a 41 gradi Celsius prima di immergere il VNO sezionato Posizionare il tessuto verticalmente in modo da ottenere fette coronali.

Mettere lo stampo da incorporare sul ghiaccio per un minuto fino a quando la coclea non si solidifica. Dopo un minuto, rimuovere il blocco della coclea, tagliare l'agar in una forma parametallica, quindi incollarlo al supporto del microtomo utilizzando le fette di VNO coronale tagliate al microtomo a una velocità di 0,5 millimetri al secondo, un'ampiezza di 0,7 millimetri e uno spessore di 100 micrometri a freddo. Un liquido cerebrospinale.

Raccogliere le fette di tessuto con un pennello e posizionarle in una piastra di coltura tissutale riempita con liquido cerebrospinale freddo A per verificare l'integrità strutturale delle fette di tessuto raccolte può essere fissata e quindi colorare l'immuno per i componenti del citoscheletro o altre proteine di interesse. Qui, la colorazione immuno contro la tubulina acetilata in viola dimostra l'integrità strutturale della fetta di tessuto. Inoltre, l'osservazione di una specifica popolazione neuronale in cui un particolare recettore dei feromoni è stato marcato mediante GFP mostra che i neuroni della morfologia neuronale conservata con piccoli corpi cellulari ovali e lunghi dendriti che raggiungono la superficie del lume terminante con microvilli possono essere osservati lavorare in una camera oscura.

Incubare le fette di VNO in una soluzione di carico di liquido cerebrospinale A freddo con sette micromolari URA 2:00 AM e 0,1% onico per un'ora a 37 gradi Celsius dopo un'ora. Conservare le fette caricate sul ghiaccio con ossicarbonatazione fino al momento dell'uso. Utilizzare un pennello per posizionare i vetrini caricati in una camera di perfusione contenente A CSF e fissare i vetrini con un ancoraggio a fette di tessuto.

Posizionare la camera di perfusione sul tavolino del microscopio di una configurazione di imaging del calcio e perfondere continuamente con A CSF ossicarbonato a temperatura ambiente. Osservare le fette di VNO caricate utilizzando le lunghezze d'onda di fluorescenza corrispondenti al colorante, che è da tre 40 a tre 80 nanometri per quattro O 2:00 AM. Utilizzare il software appropriato per registrare le variazioni del rapporto di calcio intracellulare. Un sistema di perfusione è necessario per indurre la chemiostimolazione.

Qui, una fetta coronale di tessuto vno di un topo in cui la sottopopolazione di neuroni che esprimono il recettore dei feromoni V one RB two esprime anche GFP è immuno colorata contro la proteina tubulina acetilata mostrata in viola. Le viste più potenti della fetta dimostrano la conservazione dell'integrità del tessuto. Si mostra che i neuroni con dendriti lunghi raggiungono la superficie del lume e l'espressione della proteina strutturale può essere vista nelle protuberanze dendritiche e nei microvilli per l'imaging del calcio.

Le fette di tessuto caricate con FU vengono prima visualizzate utilizzando il contrasto di fase di Hoffman per localizzare il campo di interesse a partire dal vaso sanguigno, la prima freccia bianca, l'osservatore progredisce lentamente verso il lume, la seconda freccia bianca e la regione neuroepiteliale. Il corpo cellulare ovale del neurone nasale RO. La terza freccia bianca può essere identificata dalla sua dita lunga e sottile.

La quarta freccia bianca che si estende nel lume, la manopola dendritica neuronale. La quinta freccia bianca porta microvilli a contatto con feromoni RA Le cellule caricate qui mostrate a tre 80 nanometri vengono quindi illuminate in sequenza a tre 40 e tre 80 nanometri, e questo rapporto di lunghezza d'onda fluorescente è l'innesto corrispondente ai cambiamenti intracellulari di calcio nei neuroni selezionati, cerchi neri, rossi e blu. Un TP viene utilizzato per determinare la vitalità dei neuroni.

Si noti la gamma di risposte del calcio esibite nei tre neuroni selezionati e il fatto che il neurone numero due del cerchio rosso non risponde a un TP e quindi sarà scartato da ulteriori analisi. La chemiostimolazione si ottiene quindi utilizzando sia l'urina che un mix di feromoni di topo osservando la profondità della fetta di tessuto. Può essere localizzata una sottopopolazione di neuroni che esprimono sia la GFP che il recettore V one RRB two.

Qui, un neurone che esprime sia GFP che il recettore V one RB two è mostrato insieme a un neurone che esprime due non V one RB. Entrambe le cellule sono caricate con URA 2:00 AM e il neurone V one RB two che esprime mostra un picco di calcio in risposta alla perfusione del ligando due del recettore. È interessante notare che il neurone che esprime non V one RB two risponde anche a due hep noti dimostrando la complessità del rivestimento dei feromoni nel VNO.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre e microsezionare il topo per l'organo cellulare mar al fine di eseguire la preparazione acuta della fetta di tessuto. Questo protocollo è anche adattabile per l'indagine fisiologica utilizzando coloranti di calcio alternativi e configurazioni di microscopio. Buona fortuna con il tuo esperimento.